Name: Ruta de subaracnoideo intracraneal de la infección para investigar funciones de biopelículas del Streptococcus suis en Meningitis en un modelo murino de infección (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Aprende a investigar el papel de las biopelículas de Streptococcus suis en meningitis bacteriana mediante un modelo murino de infección subaracnoidea intracraneal. Este método permite evaluar respuestas inmunitarias y nuevos fármacos.

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Este trabajo fue financiado por becas de la investigación clave y programa de desarrollo de China [2017YFD0500102]; la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China [31572544]; el laboratorio estatal clave de Biología veterinaria etiológico [SKLVEB2016KFKT005]; la agricultura de Shanghai aplica programa de desarrollo de tecnología, China [G2016060201].

Los experimentos de infección del ratón fueron aprobados por el laboratorio Animal seguimiento Comité de la provincia de Jiangsu, China y realizados en el laboratorio Animal centro de Nanjing Universidad (número de permiso: SYXK (Su) 2017-0007).
1. preparación de las bacterias
Nota: Cepa virulenta de S. suis serotipo 2 P1/7 fue aislada de un cerdo enfermo con meningitis19. P1/7 cepa fue cultivada en caldo Todd-Hewitt (THB, fórmula por litro del TP: corazón infusión, 3,1 g neopeptone, 20,0 g dextrosa, 2,0 g; cloruro de sodio, 2.0 g, fosfato disódico, 0,4 g; carbonato de sodio, 2,5 g) y plateado en el agar de Todd-Hewitt (THA, fórmula por litro de THA: Corazón infusión, 3,1 g; neopeptone, 20,0 g; dextrosa, 2.0 g; cloruro de sodio 2,0 g; fosfato disódico, 0,4 g; carbonato de sodio, 2,5 g; Agar, 15,0 g) a 37 ° C y 5% CO2.
<ol><li>Colección de tensión P1/7 células planctónicas<ol>
<li>Recoger 5 mL de las células planctónicas de la cultura de fase logarítmica media (OD600= 0,6), centrifugar durante 3 min a 8000 g × y luego lavar 3 veces con PBS.</li>
		<li>Resuspender las células con 5 mL de glicerol al 25% en THB, alícuota en tubos de 5 y luego almacenar a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Colección de tensión P1/7 células de estado de biofilm<ol>
<li>Tomar 20 mL de una cultura de la noche a la mañana y añadir a 180 mL de TP fresco; dividir la cultura diluida en 10 placas redondas igualmente y luego poner las placas en una incubadora a 37 ° C en 5% CO2 durante 24 h.</li>
		<li>Después de la incubación, agitar la placa suavemente para resuspender las bacterias que no se han adherido a la placa y luego desechar el sobrenadante por aspiración. Nota: Agitar la placa suavemente y evitar Resuspender el sedimento.</li>
		<li>Añadir 5 mL de PBS para cosechar las células estado de biofilm, Resuspender el sedimento completamente y luego transferir la muestra a un tubo nuevo.</li>
		<li>Someter a ultrasonidos las células estado de biofilm de la última etapa con los siguientes parámetros: 60 W, 4 ciclos, 5 s s on y 10 off.</li>
		<li>Centrifugar durante 3 min a 8000 g × y guarde el sobrenadante a-80 ° C. Nota: El sobrenadante puede contener componentes de biofilm y puede ser utilizado para resuspender las bacterias del biofilm antes de la infección como se describe en la experimentación animal (paso 3).</li>
		<li>Resuspender el sedimento con 10 mL 25% de glicerol en TP y luego almacenar las células de estado biofilm a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Análisis análisis de microscopia electrónica (SEM)
<ol><li>Fijar el biofilm recogidos estado células y células planctónicas con paraformaldehído al 4% para 12-24 h a 4 ° C.</li>
	<li>Enjuagar las muestras rápidamente con agua destilada y deshidratan las muestras secuencialmente con un aumento de la concentración de etanol (25%, 50%, 70%, 90% y 100%) por 30 min en cada solución.</li>
	<li>Se adhieren a las muestras secadas a titulares con cinta de doble cara de metal y finalmente los abrigo en un evaporador con oro y paladio.</li>
	<li>Observar las muestras por un microscopio electrónico de barrido usando los siguientes parámetros: EHT (Extra alta tensión) = 10 kV; WD (distancia de trabajo) = 7.0 o 8.0 mm; Magnificación = 5000 ×; A la señal = SE1.</li>
</ol>3. el animal experimenta
<ol><li>Uso de SPF de 6 semanas de edad hembra ratones BALB/c en este estudio. Infectar a todos los ratones por la ruta subaracnoidea intracraneal de la infección cuyo sitio de la inyección es 3.5mm situado rostral de la bregma. Las coordenadas estereotáxicas del sitio de inyección fueron descritas claramente por Chiavolini et al17.<ol>
<li>Para el análisis histopatológico, infectar a dos grupos de ratones (5 ratones por grupo) utilizando células planctónicas o biofilm estado las células a una dosis de 3 x 107 unidades formadoras de colonias (UFC), y otro 5 ratones fueron inyectados con PBS como un control.</li>
		<li>Para la detección de expresión del mRNA de TLR2 y citoquinas en el cerebro, infecta a dos grupos adicionales de ratones (6 mice por grupo) utilizando células planctónicas o biofilm estado células a una dosis de 3 × 107 CFU.</li>
		<li>Determinar el número de bacterias viables por diluciones seriadas a THA de la galjanoplastia.</li>
		<li>Eutanasia a todos los ratones a la infección después de 12 h para futuras investigaciones. Nota: El glicerol en el medio de stock se debe retirar antes de la infección. Células planctónicas y biofilm células de estado recuperadas de-80 ° C se lavan 3 veces con PBS. Luego, las células planctónicas se resuspendió con PBS y diluidas en la dosis apropiada para la infección; biofilm estado las células se resuspendió con el sobrenadante almacenado (de paso 1.2.5) y diluidas en la dosis apropiada para la infección. El volumen de infección no debe ser más de 50 μl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Detección de la expresión del mRNA de TLR2 y citocinas en el tejido cerebral<ol>
<li>Extraer el ARN total de tejido cerebral utilizando un kit de extracción de RNA.<ol>
<li>Para cada ratón, utilice tejidos de todo el cerebro para la extracción de RNA. Tejido de todo el cerebro se dividen en 5 tubos. Toman al tejido cerebral de 100 mg y añadir 1 mL de solución de lisis para cada tubo que contiene la matriz lisis suministrada con el kit.</li>
			<li>Procesar el tubo en un homogeneizador para 40 s con un valor del 6.0 y, a continuación, centrifugar el tubo a 12000 x g y 4 ° C durante 5 minutos.</li>
			<li>Después de la centrifugación, transferir la fase superior a un tubo nuevo de microcentrífuga.</li>
			<li>Incubar la muestra transferida por 5 min a temperatura ambiente; Añadir 300 μL de cloroformo, vortex por 10 s y luego incubar 5 min a temperatura ambiente.</li>
			<li>Centrifugar el tubo a × 12000 g y 4 ° C por 5 min la transferencia de la fase superior a un tubo nuevo.</li>
			<li>Añadir 500 μl de etanol absoluto frío al tubo, antes de invertir por 5 veces y luego almacenar la muestra a-20 ° C durante al menos 1 h.</li>
			<li>Centrifugar el tubo a × 12000 g y 4 ° C por 15 minutos y eliminar el sobrenadante. Lavar el pellet con 500 μl de etanol 75% frío libre de Rnasa H2O.</li>
			<li>Eliminar el etanol, aire seco el precipitado durante 5 minutos a temperatura ambiente y el ARN resuspender en 100 μl de libre de Rnasa H2O.</li>
			<li>Incubar el ARN durante 5 minutos a temperatura ambiente y determinar la concentración de RNA utilizando un equipo bioanalyzer de RNA.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Realizar síntesis de cDNA, incluyendo eliminación de DNA genómico (gDNA), utilizando un termociclador con un kit de reactivo de transcripción inversa (RT).<ol>
<li>Añadir 1 μg de RNA a un tubo conteniendo 2 μl de tampón de eliminación de 5 x gDNA, 1 μl de enzima de gDNA eliminación y libre de Rnasa H2O hasta que el volumen alcanza 10 μl. Incubar durante 2 min a 42 ° C.</li>
			<li>Añadir 10 μl de la master mix (mezcla de 1 μl de enzima RT I, 1 μl de mezcla de Primer RT, 4 μL de 5 x Buffer 2 y 4 μL de Rnasa free H2O) a la solución de reacción desde el último paso y luego mezclar suavemente. Proceder inmediatamente con la reacción de RT: 37 ° C por 15 min y luego 85 ° C durante 5 s.</li>
			<li>Realizar análisis cuantitativo de PCR (RT-qPCR) en tiempo real utilizando una máquina de PCR en tiempo real con un kit SYBR RT-qPCR. Añadir 10 μl de 2 x enzima, 0,8 μl de cebador forward, 0,8 μl de cebador reverso, 0,4 μL de 50 x ROX referencia tinte II, 2 μl de cDNA plantilla y libre de Rnasa H2O hasta un volumen total de 20 μl.</li>
			<li>Ejecutar cada muestra por triplicado usando los siguientes parámetros térmicos: 30 s a 94 ° C, seguido de 40 ciclos de 5 s a 95 ° C y 34 s a 60 ° C, con una etapa final de 15 s a 95 ° C, 1 min a 60 ° C y 15 s a 95 ° C. Cebadores para RT-qPCR se enumeran en la tabla 1. Genes de limpieza B2m y 18s rRNA fueron utilizados como los controles internos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Calcular el cambio relativo fold basado en el método 2-ΔΔCt .</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Observación de secciones histológicas
	<ol>
<li>Después de la fijación con formalina al 10% en 24 h, reconstruir el tejido cerebral fijo en tamaños adecuados de piezas de tejido en 2-3 mm.</li>
		<li>Poner las piezas de tejido en un cassette inclusión y sumerja en una solución fijadora nueva para la deshidratación con un deshidratador de vacío automático.</li>
		<li>Sacar el tejido fijo y deshidratar secuencialmente en el aumento de las concentraciones de etanol (70%, 80%, 95%, 95% y 100%) por 30 min en cada solución.</li>
		<li>Transparentize la muestra con xileno durante 15 min, sumergirla en parafina líquida a 60 º C durante 90 minutos y luego incrustar usando una máquina de empotrar.</li>
		<li>Cortar el tejido de bloque embebido de parafina 3 μm, azulejo de la rebanada en agua a 45 ° C y luego secar al aire.</li>
		<li>Incubar la sección durante 3 h a 60 ° C, método de la mancha con la hematoxilina y eosina (HE) y sellarlo con la goma neutral.</li>
		<li>Observar los cambios histopatológicos del cerebro con un microscopio óptico. Se utilizó un sistema de clasificación de cuatro puntos para evaluar cambios histológicos. Usar una prueba t para el análisis estadístico. Congestión/hemorragia: ausente, puntuación 0; pequeña área de congestión focal/hemorragia, puntuación 1; gran zona de congestión/hemorragia focal o múltiples sitios de pequeña área de congestión focal/hemorragia, puntuación de 2; hasta tres lugares de gran congestión focal/hemorragia, puntuación de 3; difuso de congestión/hemorragia, puntuación 4. Necrosis: ausente, puntuación 0; necrosis focal, puntuación de 1; difunden aparición de células necróticas de 1-10, puntuación 2; focos de necrosis confluente, puntuación de 3; extensa necrosis confluente, puntuación 4. Infiltración de células inflamatorias: ausente, puntuación 0; infiltraciones de pocos y focal, puntuación 1; infiltración multifocal o infiltraciones con formación de agregados, puntuación de 2; hasta tres agregados, puntuación de 3; y agregados más de cuatro, 4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Gottschalk, M., Xu, J., Calzas, C., Segura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis%3A+a+new+emerging+or+an+old+neglected+zoonotic+pathogen%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis: a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen?</a> Future Microbiology. 5, 371-391 (2010).</li>
<li>Goyette-Desjardins, G., Auger, J. P., Xu, J., Segura, M., Gottschalk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis%2C+an+important+pig+pathogen+and+emerging+zoonotic+agent-an+update+on+the+worldwide+distribution+based+on+serotyping+and+sequence+typing%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis, an important pig pathogen and emerging zoonotic agent-an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing.</a> Emerging Microbes & Infections. 3 (6), e45(2014).</li>
<li>Kerdsin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+Streptococcus+suis+serotype+9+infection+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%2C+Immunology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Emergence of Streptococcus suis serotype 9 infection in humans.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 50 (4), 545-546 (2017).</li>
<li>Hatrongjit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+human+case+report+of+sepsis+due+to+infection+with+Streptococcus+suis+serotype+31+in+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect+Diseases%22%5BJournal%5D)">First human case report of sepsis due to infection with Streptococcus suis serotype 31 in Thailand.</a> BMC Infect Diseases. 15, 392(2015).</li>
<li>Fittipaldi, N., Segura, M., Grenier, D., Gottschalk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+factors+involved+in+the+pathogenesis+of+the+infection+caused+by+the+swine+pathogen+and+zoonotic+agent+Streptococcus+suis%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogen and zoonotic agent Streptococcus suis.</a> Future Microbiology. 7 (2), 259-279 (2012).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+from+the+natural+environment+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases.</a> Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 95-108 (2004).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+DNA%3A+a+major+proinflammatory+component+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Extracellular DNA: a major proinflammatory component of Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Immunology. 184 (11), 6386-6395 (2010).</li>
<li>Isiaku, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+is+associated+with+chronic+streptococcal+meningoencephalitis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Biofilm is associated with chronic streptococcal meningoencephalitis in fish.</a> Microbial Pathogenesis. 102, 59-68 (2017).</li>
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<li>Xiao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis+small+RNA+rss04+contributes+to+the+induction+of+meningitis+by+regulating+capsule+synthesis+and+by+inducing+biofilm+formation+in+a+mouse+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis small RNA rss04 contributes to the induction of meningitis by regulating capsule synthesis and by inducing biofilm formation in a mouse infection model.</a> Veterinary Microbiology. 199, 111-119 (2017).</li>
<li>Dominguez-Punaro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis+serotype+2%2C+an+important+swine+and+human+pathogen%2C+induces+strong+systemic+and+cerebral+inflammatory+responses+in+a+mouse+model+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis serotype 2, an important swine and human pathogen, induces strong systemic and cerebral inflammatory responses in a mouse model of infection.</a> Journal of Immunology. 179 (3), 1842-1854 (2007).</li>
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<li>Williams, A. E., Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+Streptococcal+meningitis+following+intravenous+intracisternal+and+natural+routes+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Pathology of Streptococcal meningitis following intravenous intracisternal and natural routes of infection.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (4), 345-356 (1990).</li>
<li>Dominguez-Punaro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+cochlear+inflammation+and+vestibular+syndrome+in+an+experimental+model+of+Streptococcus+suis+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Severe cochlear inflammation and vestibular syndrome in an experimental model of Streptococcus suis infection in mice.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (9), 2391-2400 (2012).</li>
<li>Auger, J. P., Fittipaldi, N., Benoit-Biancamano, M. O., Segura, M., Gottschalk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+Studies+of+Different+Sequence+Types+and+Geographical+Origins+of+Streptococcus+suis+Serotype+2+in+a+Mouse+Model+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Virulence Studies of Different Sequence Types and Geographical Origins of Streptococcus suis Serotype 2 in a Mouse Model of Infection.</a> Pathogens. 5 (3), (2016).</li>
<li>Chiavolini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+inducing+experimental+pneumococcal+meningitis+in+outbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice.</a> BMC Microbiology. 4, 36(2004).</li>
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<li>Takeuchi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+suilysin+to+the+pathogenesis+of+Streptococcus+suis+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">The contribution of suilysin to the pathogenesis of Streptococcus suis meningitis.</a> Journal of Infectious Diseases. 209 (10), 1509-1519 (2014).</li>
<li>Tenenbaum, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+bacterial+invasion+and+translocation+of+Streptococcus+suis+across+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro.</a> Cellular Microbiology. 11 (2), 323-336 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La ruta subaracnoidea intracraneal de la infección descrita aquí tiene evidentes ventajas sobre otras vías de infección. Permite a los investigadores a estudiar la interacción de la bacteria huésped y el efecto de componentes bacterianos en anfitrión inmunorespuestas directamente en el cerebro, que imitan la entrada bacteriana en el sistema nervioso central. Así, esta ruta de infección se puede extender para investigar los mecanismos de la meningitis causada por otras bacterias. Además, también puede ser utilizado para p...

Streptococcus suis (S. suis) es un importante patógeno bacteriano de los cerdos en todo el mundo, causando enfermedades graves como meningitis, neumonía, septicemia, endocarditis y artritis1. También es un agente zoonótico emergente. Hasta ahora, se ha informado que nueve serotipos pueden causar infección en seres humanos, incluyendo los serotipos 2, 4, 5, 9, 14, 16, 21, 24 y 312,3,4. En los seres humanos y cerdos, la meningitis es uno de los principales signos clínicos de infecciones por S. suis . En Vietnam y Tailandia, S. suis es la principal causa de meningitis en adultos5. Los biofilms microbianos son microorganismos que se adhieren entre sí y se concentra en una interfaz; son esenciales para la virulencia bacteriana, supervivencia en diversos ambientes y resistencia a los antibióticos5. Biofilms normalmente están rodeados por una matriz extracelular que generalmente contiene polisacáridos, proteínas y ADN6. Este último es capaz de provocar respuestas inflamatorias host y del cytokine producción7. Formación de biopelículas se ha divulgado en meningitis estreptocócica en estudios anteriores. Biofilms contribuyen a meningitis Streptococcus agalactiae en un modelo de pescado tilapia y formación de biopelículas se ha revelado dentro de los tejidos del cerebro y alrededor de meníngea superficies en vivo a través de inoculación intra abdominal8. Durante meningitis, estreptococo pneumoniae está en un estado similar al biofilm y bacterias en un biofilm estado fueron más efectivas en la inducción de meningitis en un modelo de infección del ratón9. Además, en nuestro anterior estudio, el estado de biofilm asociado con S. suis en cerebro de ratón contribuye a la virulencia bacteriana supervivencia análisis10. Sin embargo, la evidencia directa para la participación de biofilm de S. suis meningitis requiere más investigación.
Se han desarrollado modelos animales de infección por S. suis en ratones utilizando la intraperitoneal (i.p.)11, intranasal (i.n.)12, vía intravenosa (i.v.)13y las rutas intracisternal (i.c.) de infección14, 15 , 16. sin embargo, no son adecuadas para el estudio de las funciones de los componentes superficiales de S. suis en meningitis directamente en el cerebro las vías i.v., i.p. y i.n. de infección. Se trata de una matriz extracelular de la biopelícula. Aunque la inoculación de la i.c. se utilizó para la infección por S. suis , el sitio de inyección precisa no se ha descrito en estos documentos. En cambio, las coordenadas estereotáxicas del sitio de inyección para la inoculación intracraneal subaracnoidea se ha descrito claramente en un anterior estudio17. Esto permitió el fácil reconocimiento del punto de inoculación y más simplista protocolo experimental. Además, la ruta subaracnoidea intracraneal de la infección mímico bacteriano entrada en sistema nervioso central de los senos paranasales o el oído medio17y la relación entre el oído medio y la meningitis causada por S. suis ha sido demostrado por Madsen et al18. Por otra parte, mediante la aplicación de la ruta subaracnoidea intracraneal de la infección en ratones, hemos demostrado que S. suis pequeño RNA rss04 contribuye a la meningitis en nuestro anterior estudio10.
En el presente estudio, se utilizó la ruta subaracnoidea intracraneal de la infección en ratones para investigar el papel de los biofilms en meningitis de los suis de S. . Infectaron a ratones con células planctónicas o células de estado de biofilm de S. suis por esta vía de infección. El análisis histopatológico y mayor expresión del ARNm de TLR2 y citoquinas del tejido cerebral de ratones inyectados con las células del biofilm estado indican claramente que el biofilm de S. suis contribuye a la meningitis.

<table><tbody><tr><td>Todd Hewitt Broth(THB)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>DF0492078</td><td>Disuelva 30 g del polvo en 1 L de agua purificada. Autoclave a 121 grados; durante 15 min.</td></tr><tr><td>Agar</td><td>DSBIO</td><td>16C0050</td><td>Disolver 15 g del polvo en 1 L de THB. Autoclave a 121 grados; durante 15 min.</td></tr><tr><td>Sistema de purificación de agua de referencia Milli-Q</td><td>Merck KGaA</td><td>Z00QSVCUS</td><td>Sin Dnase / Rnasa</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019318</td><td>Disuelva 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO3, 0,27 g de KH2PO4 en 1 L de agua purificada. Autoclave a 121 grados; durante 15 min. Use KOH para ajustar el pH a 7.4.</td></tr><tr><td>Na2HPO3</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>9009012-01-09</td><td>Disuelva 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO3, 0,27 g de KH2PO4 en 1 L de agua purificada. Autoclave a 121 grados; durante 15 min. Use KOH para ajustar el pH a 7.4.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>9009017-01-09</td><td>Disuelva 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO3, 0,27 g de KH2PO4 en 1 L de agua purificada. Autoclave a 121 grados; durante 15 min. Use KOH para ajustar el pH a 7.4.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>9009019-01-09</td><td>Disuelva 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO3, 0,27 g de KH2PO4 en 1 L de agua purificada. Autoclave a 121 grados; durante 15 min. Use KOH para ajustar el pH a 7.4.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>9009014-01-09</td><td>Disuelva 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO3, 0,27 g de KH2PO4 en 1 L de agua purificada. Autoclave a 121 grados; durante 15 min. Use KOH para ajustar el pH a 7.4.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td></td><td>10010618 Diluido con igual volumen de agua purificada, autoclave a 121 grados durante 15 minutos al</td></tr><tr><td>4% de paraformaldehído</td><td>Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>80096675</td><td></td></tr><tr><td>25% de glutaraldehído</td><td>Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>30092436</td><td>diluido 10 veces con agua purificada para su fijación.</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sionpharm Reactivo Químico Co., Ltd</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sionpharm Reactivo Químico Co., Ltd</td><td>10006818</td><td></td></tr><tr><td>Spctrofotómetro</td><td>DeNovix Inc.</td><td>DS-11 +</td><td></td></tr> <tr><td>Trituradora de células de ultrasonido</td><td>NingBo Scientz Biotechnology Co., Ltd</td><td>JY96-IIN</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Hitachi Koki Co., Ltd</td><td>CT15RE</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerador</td><td>Aucma Co., Ltd</td><td>DW-86L500</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de barrido</td><td>Zeiss</td><td>EVO-LS10</td><td></td></tr><tr><td>FastRNA Pro Green Kit MP</td><td>Biomedicals</td><td>#6045-050</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento FastPrep-24</td><td>MP Biomedicals</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento para PCR</td><td>SensoQuest GmbH</td><td>1124310110</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4485689</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq II</td><td>Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd</td> Kit de reactivos <td>RR820A</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT con borrador de</td> <td>ADNgTakara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd</td><td>RR047A</td><td></td></tr><tr><td>Procesador de tejidos completamente cerrado</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>ASP200S</td><td></td></tr><tr><td>módulo de inclusión de parafina calentada</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>EG1150H</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo rotativo semiautomático</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>RM2245</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua para secciones de parafina</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>HI1210</td><td></td></tr><tr><td>Autostainer XL</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>ST5010</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939A</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio óptico</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr></tbody></table>

ruta de subaracnoideo intracraneal de la infección para investigar funciones de biopelículas del streptococcus suis en meningitis en un modelo murino de infección

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Streptococcus suis es no sólo un patógeno bacteriano importante de cerdos en todo el mundo, sino también un agente zoonótico emergente. En los seres humanos y cerdos, la meningitis es una manifestación importante de infecciones por S. suis . Un modelo adecuado de la infección es una herramienta esencial para comprender los mecanismos de las enfermedades causadas por patógenos. Varias rutas de la infección en ratones se han desarrollado para estudiar la patogenesia de la infección por S. suis . Sin embargo, las rutas de infección intraperitoneales, intranasales o intravenosas no son adecuadas para el estudio de las funciones de componentes superficiales de S. suis meningitis directamente en el cerebro, como la matriz extracelular de la biopelícula. Aunque la inoculación intracisternal se ha utilizado para la infección por S. suis , el sitio de inyección precisa no se ha descrito. Aquí, la ruta subaracnoidea intracraneal de la infección fue descrita en un modelo de ratón para investigar el papel de biofilms en meningitis S. suis . Células planctónicas de S. suis o biofilm estado fueron inyectadas directamente en el espacio subaracnoideo de los ratones a través del sitio de inyección, situado a 3,5 mm rostral de la bregma. El análisis histopatológico y mayor expresión del ARNm de TLR2 y citoquinas del tejido cerebral de los ratones inyectados con las células del biofilm estado indican claramente que biofilm de S. suis juega un papel definitivo en meningitis S. suis . Esta ruta de infección tiene evidentes ventajas sobre otras vías de infección, permitiendo el estudio de la interacción de la bacteria huésped. Además, permite el efecto de componentes bacterianos en las respuestas inmunitarias de host directamente en el cerebro para ser evaluados y simula la entrada de bacteria en el sistema nervioso central. Esta ruta de infección se puede extender para investigar los mecanismos de la meningitis causada por otras bacterias. Además, también puede ser utilizado para probar la eficacia de los medicamentos contra la meningitis bacteriana.

Análisis de SEM fue realizada para examinar la formación de biopelículas en las condiciones experimentales. Como se muestra en la figura 1, existe una diferencia significativa en la formación de biopelículas entre células planctónicas (figura 1A) y biofilm estado células (figura 1B). Análisis de SEM demostraban que las bacterias del biofilm en grupos y capas y múltip...

Aquí, describimos la ruta subaracnoidea intracraneal de la infección en ratones para estudiar el papel de los biofilms en Streptococcus suis meningitis. Este modelo de infección también es adecuado para el estudio de la patogenia de otra meningitis bacteriana y la eficacia de nuevos medicamentos contra la meningitis bacteriana.

Ruta de subaracnoideo intracraneal de la infección para investigar funciones de biopelículas del Streptococcus suis en Meningitis en un modelo murino de infección

Streptococcus suis is not only a major bacterial pathogen of pigs worldwide but also an emerging zoonotic agent. In humans and pigs, meningitis is a major ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el papel de los componentes del Streptococcus suis en muchos sitios, como la matriz extracelular de sus biopelículas. La principal ventaja de esta técnica es que permite investigar los componentes bacterianos que afectan a la forma en que las respuestas inmunitarias responden directamente en el cerebro e imitan la entrada de las bacterias en el sistema nervioso central. El Sr. Shouming Zhang, un estudiante graduado de mi laboratorio, demostrará el procedimiento.Para recolectar células planctónicas de la cepa P1/7, primero recoja cinco mililitros de las células del cultivo de fase de bloqueo medio. Centrifugar durante tres minutos a 8000 veces G antes de lavar las células tres veces en PBS. Vuelva a suspender las células con cinco mililitros de glicerol al 25% en THB y alícuota en cinco tubos.Alternativamente, para recolectar células en estado de biofilm de la cepa P1/7, tome 20 mililitros de un cultivo nocturno y agregue 180 mililitros de THB fresco. Divida igualmente el cultivo diluido en 10 placas de cultivo redondas, luego incube las placas a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 5% durante 24 horas. Después de

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Zhang, S., et al. Vía subaracnoide intracraneal de la infección para investigar los roles de los biofilms de Streptococcus suis en meningitis en un modelo de infección murina. J. Vis. Exp. (2018).Este vídeo demuestra la detección de la expresión génica objetivo en el cerebro de un ratón infectado por bacterias. Se extrae ARN, se trata con una enzima que degrada el ADN y se transcribe inversamente en ADNc. El ADNc se amplifica mediante ciclos térmicos con cebadores específicos de cada...

Detección de la expresión del gen objetivo en un cerebro de ratón infectado por bacterias

Fuente: Lenhard, A. et al. Un modelo murino para la transición de Streptococcus pneumoniae de colonizador a patógeno tras la coinfección viral recapitula la enfermedad agravada por la edad. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo muestra un modelo de coinfección en ratones en el que el virus de la gripe desencadena la transición de Streptococcus pneumoniae de colonizador a patógeno. Detalla los pasos implicados en la colonización bacteriana, la infección viral y la progresión de la enfermedad.

Un modelo murino para estudiar la transición patógena de Streptococcus pneumoniae tras la coinfección viral

En este video, demostramos la administración intracisternal de Neisseria meningitidis en un modelo de ratón para generar infección por meningitis.

Administración intracisternal de meningococos en modelos de ratón para inducir meningitis meningocócica

Neisseria meningitidis es un patógeno específico humana que infecta a los vasos sanguíneos. En este protocolo microvasos humanos se introducen en un ratón mediante el injerto de piel humana en ratones inmunodeprimidos. Las bacterias se adhieren ampliamente a los vasos humanos, dando lugar a daño vascular y el desarrollo de la erupción purpúrica típicamente observado en casos humanos.

Humanizado modelo de ratón para el Estudio de Infecciones Bacterianas Targeting la microvasculatura

Los modelos animales han demostrado ser herramientas muy valiosas en la definición de mecanismos de acogida y de patógenos específicos que contribuyen al desarrollo de la inflamación crónica. Aquí se describe un modelo de ratón de infección oral con el patógeno humano Porphyromonas gingivalis y metodologías detalle para evaluar la progresión de la inflamación en sitios locales y sistémicos.

Un modelo de ratón para Patógenos inducida inflamación crónica en los sitios locales y sistémicos

Aquí, se describe un procedimiento para el establecimiento de la infección sistémica en la rata neonatal con cultivos de Escherichia coli K1. Este procedimiento no invasivo permite la colonización del tracto gastrointestinal, la translocación del patógeno a la circulación sistémica, y la invasión del sistema nervioso central en el plexo coroideo.

Modelo no invasiva de neuropatogénico Escherichia coli La infección en Neonatología Rata

Streptococcus pneumoniae forma lesiones microscópicas discretas no purulentas en el corazón. Se describe el protocolo para un modelo murino de formación de microlesiones cardíacas. Se proporciona instrucción sobre la visualización de microlesiones mediante microscopía, la discriminación entre microlesiones tempranas y tardías, y los métodos para detectar la remodelación cardíaca en el corazón de los animales convalecientes.

Visualización de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Dentro cardíacos microlesiones y la remodelación cardiaca posterior

Aquí, describimos un método para inducir la meningitis meningocócica a través de una vía intracisternal de infección en ratones adultos. Presentamos un protocolo paso a paso de la infección meningocócica desde la preparación del inóculo hasta la infección intracisternal; luego registrar la supervivencia animal y evaluar las cargas bacterianas en los tejidos murinos.

Inducir meningitis meningocócica Serogrupo C en ratones a través de parto intracisternal

Este artículo describe un nuevo modelo de ratón para la transición del neumococo de un colonizador asintomático a un patógeno causante de enfermedades durante la infección viral. Este modelo se puede adaptar fácilmente para estudiar las interacciones polimicrobianas y huésped-patógeno durante las diferentes fases de la progresión de la enfermedad y entre varios huéspedes.

Un modelo de ratón para la transición de Streptococcus pneumoniae de colonizador a patógeno tras la coinfección viral recapitula la enfermedad exacerbada por la edad

El presente protocolo describe un modelo de ratón que emplea la implantación dorsal subcutánea para investigar infecciones asociadas a implantes, lo que permite una investigación exhaustiva de los mecanismos fisiopatológicos y apoya el desarrollo de criterios diagnósticos con estrategias terapéuticas específicas.

Modelo animal de infecciones asociadas a implantes en ratones

Aquí presentamos un protocolo para establecer un modelo de inmunosupresión de sepsis en ratón mediante la instillación intranasal de Klebsiella pneumoniae y validamos el modelo mediante diversos indicadores.

Establecimiento de un modelo de inmunosupresión inducida por sepsis en ratones mediante la instilación intranasal de bacterias

Aprende a investigar el papel de las biopelículas de Streptococcus suis en meningitis bacteriana mediante un modelo murino de infección subaracnoidea intracraneal. Este método permite evaluar respuestas inmunitarias y nuevos fármacos.

Ruta de subaracnoideo intracraneal de la infección para investigar funciones de biopelículas del Streptococcus suis en Meningitis en un modelo murino de infección (Video) | JoVE Journal

Ruta de subaracnoideo intracraneal de la infección para investigar funciones de biopelículas del Streptococcus suis en Meningitis en un modelo murino de infección

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