Name: Fabricación de Nanopattern gradiente térmico Nanoimprinting técnica y proyección de la respuesta de células formadoras de colonias endoteliales humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Aprende a fabricar placas con nanopatrones gradiente mediante nanoimprint térmico y evalúa la respuesta de células progenitoras endoteliales humanas. Este método permite estudiar el comportamiento celular ante estímulos físicos con alta reproducibilidad.

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Este trabajo fue financiado por el programa de investigación de ciencia básica a través de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de educación, ciencia y tecnología (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] y Bio y desarrollo de tecnología médica Programa de la NRF financiado por el Ministerio de ciencia, TIC y planeación de futuro [NRF-2017M3A9C6029563].

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Los autores no tienen nada que revelar.

Fabricación de un AAO a menudo adolece de defectos tales como grietas, formas irregulares de los poros y la quema. La razón principal de estos defectos se llama un desglose electrolítico, que es fuertemente afectado por la naturaleza de los sustratos de metal está anodizado y la resistividad del electrólito21. Puesto que la resistividad del electrolito varía dependiendo de su temperatura, eliminar calor continuamente de electrodos es el punto crítico para mantener la temperatura localización del e...

Recientemente, la respuesta de las células por la estimulación física de la topografía de la superficie ha sido destacó en el campo de la célula ingeniería1,2,3,4. Por lo tanto, más atención se ha centrado en nanoestructuras tridimensionales en el accesorio de celular superficial5. Se ha reportado que la integrina, que es el dispositivo de reconocimiento de superficie de la célula, transmite el estímulo físico por las estructuras micro-nano de ECM a través de la Mecano-transducción6. Este estímulo mecánico regula el comportamiento de la célula a través de la dirección de contacto7 e induce reorganización citoesquelética a cambiar de forma, además de adherencias focales y la rigidez de las células8.
Las células progenitoras endoteliales humanas (hEPCs) en el cuerpo cerca interactúan con el microambiente de la ECM circundante9. Esto indica que el estado físico de lo ECM actúa como un parámetro importante para la formación de complejos de adhesión célula-matriz específica en cuanto a tensión de esquileo derivado del flujo de sangre10. Se divulga que aumenta la superficie nanotopography en vitro la formación de redes extensas de tubo capilar de hEPCs11 y que un factor soluble de ECM/bio sistema combinado permite hEPCs reconocer sustratos disfuncionales y promueve de la herida curativo de12,13. Sin embargo, la relación entre ECM y hEPCs no se entiende claramente.
Aunque muchos investigadores trataron de aclarar la relación entre las respuestas celulares y señales físicas de diferentes sustratos14,15,16, estos estudios utilizaron solamente el tamaño fijo de una nanoestructura o nanopatrones con arreglos irregulares que tienen una limitación para aclarar la relación entre el tamaño del comportamiento de nanoestructura y celular. El problema es la falta de herramientas adecuadas para la detección de respuestas celulares que pueden sustituir a los enfoques existentes tediosos e iterativos para encontrar el tamaño óptimo de la nanoestructura. Por lo tanto, una técnica sencilla se requiere para la detección de las reacciones celulares en estímulos físicos sin repetición.
Aquí, describimos un método utilizado en nuestros anteriores informes17,18,19 para producir un gradiente nanopattern que aumenta gradualmente el diámetro de la nanopillars dispuesto. Además, también hemos descrito cómo cultivar y analizar el comportamiento de hECFCs en placas nanopattern gradiente para determinar el efecto de los estímulos físicos en las células. Un suave anodizado grabado gradual y método de recubrimiento de la capa anti-sticking fueron utilizados para fabricar molde AAO degradado. Mediante la adopción de un térmico impresión técnica de litografía, idénticos nanopatrones gradiente poliestireno fueron producidos de manera rentable y fácil. Utilizando el gradiente nanopatrones, es factible determinar que tamaño de nanoestructura tiene un gran efecto sobre el comportamiento de células en un sistema del experimento. Esperamos que este gradiente nanopattern será útil en la comprensión de los mecanismos de interacción entre hECFC de derivados de sangre u otras células y varios tamaños de nanoestructuras.

<table><tbody><tr><td>Ácido perclórico 60%</td><td>Daejung Chemicals & Metales</td><td>6512-4100</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol etílico, absoluto 99.9%</td><td>Daejung Chemicals & Metales</td><td>4118-4100</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fosfórico 85%</td><td>Daejung Chemicals & Metales</td><td>6532-4400</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol metílico 99.5%</td><td>Daejung Chemicals & Metales</td><td>5558-4400</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de cromo (VI)</td><td>Daejung Chemicals & Metales</td><td>2558-4400</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico 95%</td><td>Daejung Chemicals & Metales</td><td>7781-4100</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno 30%</td><td>Daejung Chemicals & Metales</td><td>4104-4400</td><td></td></tr><tr><td>n-hexano 95%</td><td>Daejung Productos químicos & Metales</td><td>4081-4400</td><td></td></tr><tr><td>Tolueno 99.5%</td><td>Daejung Productos Químicos & Metales</td><td>8541-4400</td><td></td></tr> <tr><td>(heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahidrodecilo)dimetilclorosilano</td><td>Gelest</td><td>SIH5840.4</td><td>Sensible a la humedad</td></tr><tr><td>Metoxinonafluorobutano 99%</td><td>Sigma aldrich</td><td>464309</td><td></td></tr><tr><td>solución de colágeno</td><td>Stemcell</td><td>#4902</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma aldrich</td><td>G1890</td><td>Solución</td></tr> <tr><td>de recubrimiento de proteínasFicoll-Paque</td><td>GE Heathcare</td><td>17-1440-03</td><td>Solución de polisacárido hidrófilo</td></tr><tr><td>EGM-2MV</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td>Medio de expansión de células endoteliales</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>Sigma aldrich</td><td>G5882-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de osmio</td><td>Sigma aldrich</td><td>201030-1G</td><td></td></tr><tr><td>Hexametildisilazano</td><td>Sigma aldrich</td><td>440191</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma aldrich</td><td>X100-100ML</td><td>Etoxilato de octilfenol&nbsp;</td></tr><tr><td>Suero de cabra</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo primario de vinculina humana&nbsp;</td><td>Sigma aldrich</td><td>V9131</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de actina F</td><td>Sondas moleculares</td><td>A12379</td><td>Faloidina conjugada con fluorescencia</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-ratón conjugado&nbsp; Anticuerpo IgG</td><td>Sondas moleculares</td><td>A11001</td><td>Anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia&nbsp;</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindol&nbsp;</td><td>Sigma aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje</td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo primario vWF humano&nbsp;</td><td>DAKO</td><td>A0082</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano&nbsp; Anticuerpo primario CD144&nbsp;</td><td>BD Biociencias</td><td>#555661</td><td></td></tr><tr><td>Eponate 12&comercio; Kit de incrustación, con BDMA</td><td>Ted Pella</td><td>18012</td><td>Resina epoxi</td></tr><tr><td>Acetato de uranilo, 25g</td><td>Ted Pella</td><td>19481</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de plomo, Trihidrato, 10g</td><td>Ted Pella</td><td>19312</td><td></td></tr><tr><td>Placa de aluminio ultra puro</td><td>Goodfellow</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Lámina de poliestireno</td><td>Goodfellow</td><td>ST313120</td><td></td></tr><tr><td>oblea de silicio de 8,0"</td><td>Siltron</td><td>29-01024-03</td><td>Pulido por una cara, 725 y micro; </td></tr><tr><td>Desecador de vacío de m de espesor, 4,4 L</td><td>Kartell</td><td>KA.230</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de vacío</td><td>Aspirador</td><td>V3. VOP100</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de alimentación</td><td>Unicorntech</td><td>UDP-3003</td><td></td></tr><tr><td>Agitador magnético</td><td>Daihan scientific</td><td>SL. </td><td></td>SMS03022</tr><tr><td>Agitador</td> aéreo <td>Daihan scientific</td><td>HT120DX</td><td></td></tr><tr><td>Circulador</td><td>Daihan scientific</td><td>WCR-P12</td><td></td></tr><tr><td>Platina móvil lineal</td><td>Zaber</td><td>A-LSQ300A-E01-KT07</td><td></td></tr><tr><td>Soporte angular, 90 grados</td><td>Zaber</td><td>AB90M</td><td>Accesorio de la platina móvil lineal</td></tr><tr><td>Pinza PMP, 145 mm</td><td>Vitlab</td><td>67995</td><td>Pinza no metálica</td></tr><tr><td>Vaso de precipitados de PTFE, 250 mL</td><td>Cowie</td><td>CW007.25</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador ultrasónico</td><td>Branson</td><td>B2510MTH</td><td></td></tr><tr><td>Cortador de PCB</td><td>Hozan Tool Industrial</td><td>K-110</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de nanoimpresión</td><td>Nanonex</td><td>NX-2000</td><td></td></tr><tr><td>Generador de plasma de oxígeno</td><td>Femto Science</td><td>CUTE</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador de baja temperatura</td><td>Lowtem</td><td>Crystal 50</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubadora</td> Microscopio láser de barrido <td>Panasonic</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><tr><td>Confoal</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de barrido</td><td>JEOL</td><td>JSM6701</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de transmisión</td><td>Hitachi</td><td>H-7500</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricación de nanopattern gradiente térmico nanoimprinting técnica y proyección de la respuesta de células formadoras de colonias endoteliales humanas

Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells

Nanotopography puede encontrarse en diversas matrices extracelulares (ECMs) alrededor del cuerpo y se sabe que tienen importantes acciones reglamentarias sobre reacciones celulares. Sin embargo, es difícil determinar a la relación entre el tamaño de una nanoestructura y las respuestas de las células debido a la falta de herramientas de proyección adecuada. A continuación, os mostramos el desarrollo de placas nanopattern gradiente rentable y reproducible para la manipulación de respuestas celulares. Con óxido de aluminio anódico (AAO) como molde maestro, placas del gradiente nanopattern con nanopillars de gamas de diámetro creciente [120-200 nm (GP 120/200) 200-280 nm (GP 200/280) y 280-360 nm (GP 280/360)] fueron fabricados por un térmico impresión técnica. Estas placas nanopattern gradiente fueron diseñadas para imitar los diversos tamaños de nanotopography en el ECM y se utilizaron para las respuestas de células endoteliales humanas formadoras de colonias (hECFCs) de la pantalla. En este protocolo, se describe el procedimiento paso a paso de la fabricación de placas de gradiente nanopattern de ingeniería, técnicas de cultivo de hECFCs de sangre periférica humana y hECFCs en nanopattern las placas de cultivo celular.

La figura 1 muestra imágenes de SEM de los moldes fabricados de AAO gradiente según su tipo y posición. La figura 2 muestra imágenes de SEM de placas gradiente nanopattern con nanopillars regular-redondeadas y figura 3 cuantificación datos del diámetro del nanopillar. La tabla 1 enumera las características de la nanopillars fabricado.
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Aquí, presentamos un protocolo para la fabricación de placas nanopattern gradiente vía térmica nanoimprinting y el método de proyección de las respuestas de las células progenitoras endoteliales humanas a las nanoestructuras. Usando la tecnología descrita, es posible producir un andamio que puede manipular el comportamiento de la célula por los estímulos físicos.

Fabricación de Nanopattern gradiente térmico Nanoimprinting técnica y proyección de la respuesta de células formadoras de colonias endoteliales humanas

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular ...

La principal ventaja de esta técnica es que puede producir patrones de gradiente con alta reproducibilidad y permite el cribado de la respuesta celular a las estructuras observacionales de los parásitos. La respuesta observada a la estimulación física aún no se ha descubierto por completo. Creemos que nuestro método será una herramienta esencial para descubrir estos mecanismos desconocidos.Para comenzar, conecte un vaso de precipitados de doble camisa que contenga la solución de electropulido a un circulador y ajuste la temperatura a siete grados centígrados. Deje la solución revolviendo durante al menos 30 minutos hasta que la temperatura baje a siete grados centígrados. Sumerja la placa de aluminio ultrapuro y el contraelectrodo de carbono en la solución de electropulido con pinzas de cocodrilo y alambre de cobre.Ajuste la posición de la placa de aluminio en el contraelectrodo de carbono para que se enfrenten entre sí. Conecte la placa de aluminio al terminal positivo y conecte el contraelectrodo de carbono al terminal negativo de una fuente de alimentación de corriente continua. Después de aplicar un voltaje de 20 voltios, la placa de aluminio pasa de tener una superficie rugosa y sin brillo a tener una superficie similar a un espejo de color plateado.Para realizar la anodización primaria, vierta un litro del electrolito en un vaso de precipitados de doble camisa de dos litros. Sumerja la placa de aluminio pulido y el contraelectrodo de carbono en la solución con pinzas de cocodrilo en alambre de cobre. Instale un eje vertical sobre un pedestal en forma de U.Fije un agitador aéreo y un impulsor con abrazaderas de metal. Coloque la hélice del impulsor cerca del extremo inferior de ambos electrodos. Ajuste la velocidad de rotación del agitador superior entre 200 y 300 rpm y aplique un voltaje de 195 voltios bajo agitación durante 16 horas.Después de la anodización primaria, el color de la placa de aluminio cambia de plateado a gris. Para realizar la picazón de alúmina, sumerja la placa de aluminio anodizado en la solución de grabado. Selló la parte superior del vaso de precipitados con papel de aluminio y dejó remover durante al menos 10 horas.Durante el paso de grabado, el color de la placa de aluminio cambia de gris a blanco. Para la anodización secundaria, configure las mismas condiciones experimentales que la anodización primaria y vuelva a aplicar un voltaje de 195 voltios durante seis horas. Después de la anodización secundaria, el color de la placa de aluminio cambia de blanco a gris.Para realizar el ensanchamiento de poros en gradiente, primero conecte el vaso de precipitados de doble camisa que contiene una solución de ácido fosfórico al circulador y ajuste la temperatura a 30 grados centígrados. Coloque una platina móvil lineal verticalmente junto al vaso de precipitados y fije un soporte a la parte móvil de la platina lineal. Coloque la parte móvil del escenario lineal en la posición inicial.Coloque el clip del soporte y cargue la placa de aluminio anodizado. Manipule la posición de la placa de aluminio manualmente para que la placa de aluminio quede justo por encima de la superficie de la solución. Sumerja gradualmente la placa de aluminio en la solución a una velocidad de cuatro coma ocho seis micras por segundo durante 120 minutos para hacer un molde AAO de 35 milímetros con un gradiente de tamaño de 120 nanómetros a 200 nanómetros.Ponga en marcha un cronómetro en el momento en que la placa de aluminio toque la superficie de la solución. Después de que hayan pasado 100 minutos, la mitad del molde AAO debe estar en la solución. Para hacer moldes GP 200 a 280 y GP 280 a 360, sumergió toda el área del molde GP 120 a 200 en la solución de ensanchamiento de poros durante dos a cuatro horas respectivamente.Sumerja el molde AAO y la solución de piraña durante 30 segundos con una pinza no metálica. Enjuague el molde AAO varias veces con agua desionizada. Remojar el molde en agua desionizada durante 30 minutos y poner en alcohol metílico durante otros 30 minutos.Secó completamente el molde AAO al vacío durante tres horas. Para la deposición de monocapas autoensambladas, sumerja el molde AAO en 57 mililitros de hexano y filtrado y un vaso de precipitados de 100 mililitros. A continuación, añada tres mililitros de solución madre de HDFS al hexano N para hacer una solución de HDFS de 2,9 milimolares y espere 10 minutos para que proceda la reacción.Después de transferir el molde de AAO a fresco y hexano, remoje el molde de AAO en 60 mililitros de metoxi-nonafluorobutano. Limpie ultrasónicamente el molde AAO en un vaso de precipitados durante 10 segundos cada vez para eliminar las moléculas de HDFS adsorbidas físicamente. Repita el procedimiento de limpieza 10 veces antes de secar el molde AAO al vacío durante 24 horas.Corte una lámina de poliestireno de un punto un milímetro de espesor a un tamaño de dos punto nueve milímetros de ancho por tres punto siete milímetros de largo utilizando un cortador de placa de circuito impreso. Trabajando en una habitación limpia, corte el molde AAO a 35 milímetros de la parte inferior con una pinza. Marque el nombre de la muestra y el fabricante de los datos en el reverso.Limpie una oblea de ocho punto cero pulgadas con la pequeña dosis de alcohol etílico, luego coloque las láminas de poliestireno en la oblea y monte el molde AAO. A continuación, coloque la película inferior en el cajón de una impresora térmica y fije la película superior a la junta, luego coloque la oblea en la película inferior y coloque la junta en la oblea. Asegúrese de que no haya polvo en la oblea.Después de cerrar el cajón de la térmica y la impresora, aplique 165 grados centígrados de calor y 620 punto cinco/dos kilopascales de presión a partir de 100 segundos. A continuación, enfríe la muestra a temperatura ambiente. Una vez frío, ventile la cámara y la presión bajará a cero kilo Pascal.Gire suavemente la lámina de poliestireno para liberar el molde AAO. Recolecta 50 mililitros de sangre humana usando un tubo inhibidor de heparina. Coloque seis mililitros de solución de polisacárido hidrofílico en un tubo de 15 mililitros y agregue ocho mililitros de sangre a la solución de polisacárido hidrófilo.Es necesario recolectar sangre inmediatamente y agregarla lentamente sobre la solución de polisacárido hidrofílico. Después de centrifugar el tubo a 1020 veces G durante 20 minutos para peletizar las células, recoseche la capa celular opaca y transfiérala a un nuevo tubo de 15 mililitros. A 10 mililitros de PBS que contienen 10% de FBS en centrífuga, el tubo a 1020 veces G durante 10 minutos para granular las células.Retire el sobrenadante y agregue el tampón de lisis de glóbulos rojos. Después de incubar en hielo durante cinco minutos a PBS que contiene 10% de FBS y centrifugar el tubo a 1020 veces G durante cinco minutos para granular las células. Retirar el sobrenadante y añadir un mililitro de medio de expansión de células endoteliales suplementado con 10%FBS.Siembra ocho millones de células por pocillo para cada placa codificada con colágeno. Induzca la colonia humana y etérea formando células como se describe en el protocolo de texto y haga crecer las células hasta el paso siete para experimentos posteriores. A continuación, cubra las placas de patrón nano degradado con un mililitro de solución de recubrimiento de proteína al uno por ciento de punto cero en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.Realice una suspensión de ECFC humanos de la placa de cultivo mediante un método estándar de división celular utilizando tripsina. Después de diluir la suspensión celular para lograr la confluencia deseada, las semillas de los ECFC humanos cesan en las placas de patrón nano de gradiente en un control plano. Cultive las células en placas planas o degradadas con nanopatrones durante dos días en la incubadora.Estas imágenes muestran los moldes AAO fabricados en tres condiciones diferentes de ensanchamiento por vertido. Un lado con el menor tiempo de inmersión en la solución de grabado con ácido fosfórico tiene el tamaño de poro más pequeño, mientras que el otro lado que tiene el mayor tiempo en la solución de grabado tiene el tamaño de poro más grande. Dado que el nano patrón se transfirió al poliestireno a través del método de impresión térmica, se generan estructuras de nano pilares en la superficie de poliestireno y el gradiente de tamaño del molde AAO se mantiene en placas de nano patrón.Los ECFC humanos confluentes mostraron una morfología típica similar a la de un adoquín que informa una colonia que se puede distinguir fácilmente bajo un microscopio de contraste de fase. Después de dos días de cultivo de ECFCs humanos en el plano en placas de patrón nano de gradiente, se observó un crecimiento significativo de filopodia en células cultivadas en GP 120 a 200. Por el contrario, no se observaron cambios notables en GP 200 a 280 o GP 280 a 360 en comparación con el control plano.Este resultado indica que la respuesta de las células es diferente dependiendo del tamaño de la nanoestructura de la superficie. Hay muchos pasos para fabricar una placa de patrón nano. Por lo tanto, puede ser complicado al principio, pero una vez dominado, obtendrá patrones con el gradiente de tamaño deseado sin ninguna dificultad.Después de ver este video, debería tener una gran comprensión de cómo producir placas de patrón nano degradado y el cultivo a humano y las series de formación de colonias más tontas en la placa de patrón nano. Además, este método está disponible para varios tipos de series. Este método puede proporcionar un puente entre la ingeniería de materiales y la biotecnología que ayudará a comprender las inyecciones de células y la nanotopografía de la superficie.

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