Name: Fabricación de Nanopattern gradiente térmico Nanoimprinting técnica y proyección de la respuesta de células formadoras de colonias endoteliales humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Aprende a fabricar placas con nanopatrones gradiente mediante nanoimprint térmico y evalúa la respuesta de células progenitoras endoteliales humanas. Este método permite estudiar el comportamiento celular ante estímulos físicos con alta reproducibilidad.

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Este trabajo fue financiado por el programa de investigación de ciencia básica a través de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de educación, ciencia y tecnología (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] y Bio y desarrollo de tecnología médica Programa de la NRF financiado por el Ministerio de ciencia, TIC y planeación de futuro [NRF-2017M3A9C6029563].

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Los autores no tienen nada que revelar.

Fabricación de un AAO a menudo adolece de defectos tales como grietas, formas irregulares de los poros y la quema. La razón principal de estos defectos se llama un desglose electrolítico, que es fuertemente afectado por la naturaleza de los sustratos de metal está anodizado y la resistividad del electrólito21. Puesto que la resistividad del electrolito varía dependiendo de su temperatura, eliminar calor continuamente de electrodos es el punto crítico para mantener la temperatura localización del e...

Recientemente, la respuesta de las células por la estimulación física de la topografía de la superficie ha sido destacó en el campo de la célula ingeniería1,2,3,4. Por lo tanto, más atención se ha centrado en nanoestructuras tridimensionales en el accesorio de celular superficial5. Se ha reportado que la integrina, que es el dispositivo de reconocimiento de superficie de la célula, transmite el estímulo físico por las estructuras micro-nano de ECM a través de la Mecano-transducción6. Este estímulo mecánico regula el comportamiento de la célula a través de la dirección de contacto7 e induce reorganización citoesquelética a cambiar de forma, además de adherencias focales y la rigidez de las células8.
Las células progenitoras endoteliales humanas (hEPCs) en el cuerpo cerca interactúan con el microambiente de la ECM circundante9. Esto indica que el estado físico de lo ECM actúa como un parámetro importante para la formación de complejos de adhesión célula-matriz específica en cuanto a tensión de esquileo derivado del flujo de sangre10. Se divulga que aumenta la superficie nanotopography en vitro la formación de redes extensas de tubo capilar de hEPCs11 y que un factor soluble de ECM/bio sistema combinado permite hEPCs reconocer sustratos disfuncionales y promueve de la herida curativo de12,13. Sin embargo, la relación entre ECM y hEPCs no se entiende claramente.
Aunque muchos investigadores trataron de aclarar la relación entre las respuestas celulares y señales físicas de diferentes sustratos14,15,16, estos estudios utilizaron solamente el tamaño fijo de una nanoestructura o nanopatrones con arreglos irregulares que tienen una limitación para aclarar la relación entre el tamaño del comportamiento de nanoestructura y celular. El problema es la falta de herramientas adecuadas para la detección de respuestas celulares que pueden sustituir a los enfoques existentes tediosos e iterativos para encontrar el tamaño óptimo de la nanoestructura. Por lo tanto, una técnica sencilla se requiere para la detección de las reacciones celulares en estímulos físicos sin repetición.
Aquí, describimos un método utilizado en nuestros anteriores informes17,18,19 para producir un gradiente nanopattern que aumenta gradualmente el diámetro de la nanopillars dispuesto. Además, también hemos descrito cómo cultivar y analizar el comportamiento de hECFCs en placas nanopattern gradiente para determinar el efecto de los estímulos físicos en las células. Un suave anodizado grabado gradual y método de recubrimiento de la capa anti-sticking fueron utilizados para fabricar molde AAO degradado. Mediante la adopción de un térmico impresión técnica de litografía, idénticos nanopatrones gradiente poliestireno fueron producidos de manera rentable y fácil. Utilizando el gradiente nanopatrones, es factible determinar que tamaño de nanoestructura tiene un gran efecto sobre el comportamiento de células en un sistema del experimento. Esperamos que este gradiente nanopattern será útil en la comprensión de los mecanismos de interacción entre hECFC de derivados de sangre u otras células y varios tamaños de nanoestructuras.

<table><tbody><tr><td>Ácido perclórico 60%</td><td>Daejung Chemicals & Metales</td><td>6512-4100</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol etílico, absoluto 99.9%</td><td>Daejung Chemicals & Metales</td><td>4118-4100</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fosfórico 85%</td><td>Daejung Chemicals & Metales</td><td>6532-4400</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol metílico 99.5%</td><td>Daejung Chemicals & Metales</td><td>5558-4400</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de cromo (VI)</td><td>Daejung Chemicals & Metales</td><td>2558-4400</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico 95%</td><td>Daejung Chemicals & Metales</td><td>7781-4100</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno 30%</td><td>Daejung Chemicals & Metales</td><td>4104-4400</td><td></td></tr><tr><td>n-hexano 95%</td><td>Daejung Productos químicos & Metales</td><td>4081-4400</td><td></td></tr><tr><td>Tolueno 99.5%</td><td>Daejung Productos Químicos & Metales</td><td>8541-4400</td><td></td></tr> <tr><td>(heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahidrodecilo)dimetilclorosilano</td><td>Gelest</td><td>SIH5840.4</td><td>Sensible a la humedad</td></tr><tr><td>Metoxinonafluorobutano 99%</td><td>Sigma aldrich</td><td>464309</td><td></td></tr><tr><td>solución de colágeno</td><td>Stemcell</td><td>#4902</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma aldrich</td><td>G1890</td><td>Solución</td></tr> <tr><td>de recubrimiento de proteínasFicoll-Paque</td><td>GE Heathcare</td><td>17-1440-03</td><td>Solución de polisacárido hidrófilo</td></tr><tr><td>EGM-2MV</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td>Medio de expansión de células endoteliales</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>Sigma aldrich</td><td>G5882-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de osmio</td><td>Sigma aldrich</td><td>201030-1G</td><td></td></tr><tr><td>Hexametildisilazano</td><td>Sigma aldrich</td><td>440191</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma aldrich</td><td>X100-100ML</td><td>Etoxilato de octilfenol&nbsp;</td></tr><tr><td>Suero de cabra</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo primario de vinculina humana&nbsp;</td><td>Sigma aldrich</td><td>V9131</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de actina F</td><td>Sondas moleculares</td><td>A12379</td><td>Faloidina conjugada con fluorescencia</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-ratón conjugado&nbsp; Anticuerpo IgG</td><td>Sondas moleculares</td><td>A11001</td><td>Anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia&nbsp;</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindol&nbsp;</td><td>Sigma aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje</td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo primario vWF humano&nbsp;</td><td>DAKO</td><td>A0082</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano&nbsp; Anticuerpo primario CD144&nbsp;</td><td>BD Biociencias</td><td>#555661</td><td></td></tr><tr><td>Eponate 12&comercio; Kit de incrustación, con BDMA</td><td>Ted Pella</td><td>18012</td><td>Resina epoxi</td></tr><tr><td>Acetato de uranilo, 25g</td><td>Ted Pella</td><td>19481</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de plomo, Trihidrato, 10g</td><td>Ted Pella</td><td>19312</td><td></td></tr><tr><td>Placa de aluminio ultra puro</td><td>Goodfellow</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Lámina de poliestireno</td><td>Goodfellow</td><td>ST313120</td><td></td></tr><tr><td>oblea de silicio de 8,0"</td><td>Siltron</td><td>29-01024-03</td><td>Pulido por una cara, 725 y micro; </td></tr><tr><td>Desecador de vacío de m de espesor, 4,4 L</td><td>Kartell</td><td>KA.230</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de vacío</td><td>Aspirador</td><td>V3. VOP100</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de alimentación</td><td>Unicorntech</td><td>UDP-3003</td><td></td></tr><tr><td>Agitador magnético</td><td>Daihan scientific</td><td>SL. </td><td></td>SMS03022</tr><tr><td>Agitador</td> aéreo <td>Daihan scientific</td><td>HT120DX</td><td></td></tr><tr><td>Circulador</td><td>Daihan scientific</td><td>WCR-P12</td><td></td></tr><tr><td>Platina móvil lineal</td><td>Zaber</td><td>A-LSQ300A-E01-KT07</td><td></td></tr><tr><td>Soporte angular, 90 grados</td><td>Zaber</td><td>AB90M</td><td>Accesorio de la platina móvil lineal</td></tr><tr><td>Pinza PMP, 145 mm</td><td>Vitlab</td><td>67995</td><td>Pinza no metálica</td></tr><tr><td>Vaso de precipitados de PTFE, 250 mL</td><td>Cowie</td><td>CW007.25</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador ultrasónico</td><td>Branson</td><td>B2510MTH</td><td></td></tr><tr><td>Cortador de PCB</td><td>Hozan Tool Industrial</td><td>K-110</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de nanoimpresión</td><td>Nanonex</td><td>NX-2000</td><td></td></tr><tr><td>Generador de plasma de oxígeno</td><td>Femto Science</td><td>CUTE</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador de baja temperatura</td><td>Lowtem</td><td>Crystal 50</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubadora</td> Microscopio láser de barrido <td>Panasonic</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><tr><td>Confoal</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de barrido</td><td>JEOL</td><td>JSM6701</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de transmisión</td><td>Hitachi</td><td>H-7500</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricación de nanopattern gradiente térmico nanoimprinting técnica y proyección de la respuesta de células formadoras de colonias endoteliales humanas

Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells

Nanotopography puede encontrarse en diversas matrices extracelulares (ECMs) alrededor del cuerpo y se sabe que tienen importantes acciones reglamentarias sobre reacciones celulares. Sin embargo, es difícil determinar a la relación entre el tamaño de una nanoestructura y las respuestas de las células debido a la falta de herramientas de proyección adecuada. A continuación, os mostramos el desarrollo de placas nanopattern gradiente rentable y reproducible para la manipulación de respuestas celulares. Con óxido de aluminio anódico (AAO) como molde maestro, placas del gradiente nanopattern con nanopillars de gamas de diámetro creciente [120-200 nm (GP 120/200) 200-280 nm (GP 200/280) y 280-360 nm (GP 280/360)] fueron fabricados por un térmico impresión técnica. Estas placas nanopattern gradiente fueron diseñadas para imitar los diversos tamaños de nanotopography en el ECM y se utilizaron para las respuestas de células endoteliales humanas formadoras de colonias (hECFCs) de la pantalla. En este protocolo, se describe el procedimiento paso a paso de la fabricación de placas de gradiente nanopattern de ingeniería, técnicas de cultivo de hECFCs de sangre periférica humana y hECFCs en nanopattern las placas de cultivo celular.

La figura 1 muestra imágenes de SEM de los moldes fabricados de AAO gradiente según su tipo y posición. La figura 2 muestra imágenes de SEM de placas gradiente nanopattern con nanopillars regular-redondeadas y figura 3 cuantificación datos del diámetro del nanopillar. La tabla 1 enumera las características de la nanopillars fabricado.
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Aquí, presentamos un protocolo para la fabricación de placas nanopattern gradiente vía térmica nanoimprinting y el método de proyección de las respuestas de las células progenitoras endoteliales humanas a las nanoestructuras. Usando la tecnología descrita, es posible producir un andamio que puede manipular el comportamiento de la célula por los estímulos físicos.

Fabricación de Nanopattern gradiente térmico Nanoimprinting técnica y proyección de la respuesta de células formadoras de colonias endoteliales humanas

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular ...

La principal ventaja de esta técnica es que puede producir patrones de gradiente con alta reproducibilidad y permite el cribado de la respuesta celular a las estructuras observacionales de los parásitos. La respuesta observada a la estimulación física aún no se ha descubierto por completo. Creemos que nuestro método será una herramienta esencial para descubrir estos mecanismos desconocidos.Para comenzar, conecte un vaso de precipitados de doble camisa que contenga la solución de electropulido a un circulador y ajuste la temperatura a siete grados centígrados. Deje la solución revolviendo durante al menos 30 minutos hasta que la temperatura baje a siete grados centígrados. Sumerja la placa de aluminio ultrapuro y el contraelectrodo de carbono en la solución de electropulido con pinzas de cocodrilo y alambre de cobre.Ajuste la posición de la placa de aluminio en el contraelectrodo de carbono para que se enfrenten entre sí. Conecte la placa de aluminio al terminal positivo y conecte el contraelectrodo de carbono al terminal negativo de una fuente de alimentación de corriente continua. Después de aplicar un voltaje de 20 voltios, la placa de aluminio pasa de tener una superficie rugosa

fabrication-gradient-nanopattern-thermal-nanoimprinting-technique

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Se describe un protocolo para la microfabricación del dispositivo de generación de gradiente de microfluidos que puede generar gradientes espaciales y temporales bien definidos microambiente. En este enfoque, el dispositivo de microfluidos gradiente de generación se pueden utilizar para estudiar la migración celular dirigida, la embriogénesis, la cicatrización de heridas y la metástasis del cáncer.

Un dispositivo de microfluidos gradiente de generación de Biología Celular

Este primer artículo se describe un procedimiento para aislar las células endoteliales humanas de las venas umbilicales y, a continuación se muestra cómo utilizar estas células para examinar la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo. Mediante el uso de una cámara de flujo de bajo volumen hecha de un polímero con las características ópticas de vidrio, en vivo de células de imagen fluorescente de poblaciones celulares raras también es posible.

Aislamiento de células endoteliales de vena umbilical y su uso en el Estudio de la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo

En este protocolo, demostramos la fabricación de sustratos biomiméticos de cultivo de células cardíacas hechos de dos materiales poliméricos distintos utilizando litografía de fuerza capilar.  Los métodos descritos proporcionan una técnica escalable y rentable para diseñar la estructura y función de los tejidos cardíacos macroscópicos para aplicaciones in vitro e in vivo.

Capilar Fuerza Litografía Cardiaca de Ingeniería de Tejidos

Un método para el montaje de gradientes adhesivas y soluble en una cámara de microscopía para estudios en vivo de células de migración se describe. El entorno de ingeniería combina superficies antiincrustantes y pistas adhesivas con gradientes de solución y por lo tanto permite determinar la importancia relativa de las señales de orientación.

Creación de degradados adhesivas y soluble para la migración celular con imágenes de microscopía de fluorescencia

Se presenta en las técnicas a micropatrón nanoporoso películas delgadas de oro a través de la impresión y la fotolitografía plantilla, así como los métodos a células de cultivo en los patrones de microfabricados. Además, se describen los métodos de análisis de imágenes para caracterizar la morfología de las células cultivadas utilizando electrónica de barrido y técnicas de microscopía de fluorescencia y de material.

Microfabricación de los patrones de oro Nanoporous de Estudios de interacción célula-materiales

Describimos un protocolo para modificar la afinidad celular de la superficie de un andamio en un entorno acuoso. El método aprovecha la fotocatálisis de dióxido de titanio para descomponer la película orgánica en la región fotoirradiada. Demostramos que se puede utilizar para crear microdominios de proteínas de andamiaje, tanto ex situ como in situ.

Photopatterning proteínas y células en el medio ambiente acuoso Usando TiO<sub&gt; 2</sub&gt; Fotocatálisis

Este artículo presenta un enfoque simple para proporcionar cepas estática gradiente discontinua en un hidrogel celular cargado concéntrico regular alineación de celda para ingeniería de tejidos.

Gradiente de tensión Chip para estimulantes comportamientos celulares en hidrogel cargadas de celulares

Se presenta un protocolo para producir una gran área de sustrato nanomodelado a partir de pequeños moldes nanomodelados para el estudio de la modulación nanotopográfica del comportamiento celular.

La expansión de nanoestructurada Los sustratos usando la técnica de la puntada para Nanotopographical modulación del comportamiento de la célula

El control de los gradientes químicos y de oxígeno es esencial para los cultivos celulares. En este artículo se presenta un dispositivo microfluídico de polidimetilsiloxano-policarbonato (PDMS-PC) capaz de generar de forma fiable combinaciones de gradientes químicos y de oxígeno para estudios de migración celular, que puede utilizarse prácticamente en laboratorios biológicos sin necesidad de instrumentación sofisticada.

Polidimetilsiloxano-policarbonato celular dispositivos de microfluidos para Estudios de Inmigración en virtud perpendicular Química y gradientes de oxígeno

Este artículo describe la metodología detallada para preparar una matriz de multiplexado Artificial celular microambiente (MACME) para manipulación de alto rendimiento de física y química señales mímico en vivo microambientes celulares y a identificar el entorno celular óptimo para las células de vástago pluripotent humanas (hPSCs) con perfiles de unicelulares.

Fabricación de una Matriz microambiente celular Artificial multiplexados

Presentamos un protocolo para la producción de alto rendimiento de canales vasculares con tamaños flexibles y patrones deseados en una placa estándar de seis pocillos utilizando tecnología de bioimpresión 3D, conocida como vasos en una placa (VOP). Esta plataforma tiene el potencial de avanzar en el desarrollo de terapias para los trastornos asociados con el endotelio comprometido.

Método de bioimpresión de alto rendimiento para modelar la permeabilidad vascular en placas estándar de seis pocillos con flexibilidad de tamaño y patrón

Aprende a fabricar placas con nanopatrones gradiente mediante nanoimprint térmico y evalúa la respuesta de células progenitoras endoteliales humanas. Este método permite estudiar el comportamiento celular ante estímulos físicos con alta reproducibilidad.

Fabricación de Nanopattern gradiente térmico Nanoimprinting técnica y proyección de la respuesta de células formadoras de colonias endoteliales humanas (Video) | JoVE Journal

Fabricación de Nanopattern gradiente térmico Nanoimprinting técnica y proyección de la respuesta de células formadoras de colonias endoteliales humanas

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