Name: Aislamiento de células Stromal Endometrial humanas In Vitro Decidualization (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Aprenda a aislar células stromales endometriales humanas e inducir su decidualización in vitro mediante suplementación hormonal. Este protocolo permite el silenciamiento génico con siRNA para estudiar mecanismos moleculares en biología reproductiva.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Todas las biopsias de endometrio humano recogidas para este estudio fueron logradas por la Universidad de Washington en St. Louis, Departamento de Obstetricia y Ginecología mediante una Junta de revisión institucional (IRB) había aprobado el formulario de consentimiento escrito.
1. preparación
<ol><li>Preparar 500 mL de 1 x de Hank equilibrada solución de sal (HBSS) mediante la adición de 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL estreptomicina a la botella que contiene los medios de comunicación (más referenciada como HBSS + medio).</li>
	<li>Preparar 500 mL de medio de Eagle modificado de Dulbecco: mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12) con rojo de fenol, L-glutamina y el ácido-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido 15 mM 4 (HEPES) mediante la adición de solución de antibiótico-antimicótico 1% (la concentración final es de 0.25 μg/mL, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL estreptomicina Fungizone) a los medios que contienen botella (además hace referencia a como los medios de aislamiento de células).</li>
	<li>Preparar 500 mL de DMEM/F12 con rojo de fenol, L-glutamina y 15 mM HEPES agregando 10% suero bovino Fetal (FBS), 1 x Na2HCO3y 1% penicilina (10.000 U/mL) y estreptomicina (10.000 μg/mL) (Pen-Strep) a los medios de comunicación (más que contiene la botella hace referencia a como medio de HESCS).</li>
	<li>Preparar 500 mL de medio de suero reducido con L-glutamina, 2,4 g/L de bicarbonato y HEPES con 2% carbón despojado suero bovino Fetal (csFBS) y 1% Pen Strep a los medios que contienen botella (más referenciada como Decidualization medios).</li>
	<li>Preparar 500 mL de rojo de fenol libre DMEM/F12 mediante la adición de 2% carbón pelados suero bovino fetal (csFBS) en los medios de comunicación que contienen botella (más referenciada como medio de cambio).</li>
	<li>Preparar 10 nM estradiol (E2), acetato de medroxiprogesterona de 1 μm (MPA) y 50 μm cíclico del monofosfato de adenosina (cAMP) en un tubo cónico de polipropileno de 15 mL y añadir un 2 ml por pozo alícuota de medios decidualization previamente preparado para in vitro ensayo de decidualization (además hace referencia a como los medios de comunicación EPC).</li>
	<li>Preparar 50 mL de congelación medios con 90% FBS y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) en el tubo cónico polipropileno 50 mL (referenciada adicional como medios de congelación).</li>
	<li>Pesan los 25 mg de colagenasa y 5 mg de DNasa I en un tubo cónico de polipropileno 50 mL y conservar a-20 ° C.</li>
</ol>2. adquisición de biopsia de endometrio humano
<ol><li>Obtener muestras de biopsia de endometrio humano recogidas en la fase proliferativa (día 9 - 12 días) del ciclo menstrual de la clínica de la IRB aprobado en HBSS.</li>
	<li>Lavar las muestras de biopsia con 1 mL de precalentado a 37 ° C HBSS + medio y agítelo suavemente para quitar el exceso de sangre y mucosas.</li>
</ol>3. aislamiento de células Stromal Endometrial humanas (HESCS)
Nota: Este procedimiento de aislamiento se realiza en un ambiente estéril bajo una cabina de seguridad biológica.
<ol><li>Transferencia de la biopsia con pinzas esterilizadas en un tubo de centrífuga cónico de polipropileno de 50 mL que contiene 10 mL fresco HBSS.</li>
	<li>Centrifugue la biopsia a temperatura ambiente a 500 x g por 90 s.<ol>
<li>Si las rupturas de pellet celular, volver a girar la biopsia a 2.000 x g por 90 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire los medios utilizando una pipeta de 1 mL y lavar con 10 mL de 37 º C precalentado HESCS medios de aislamiento seguidos por centrifugación a 500 x g durante 90 s.</li>
	<li>Retire los medios utilizando una pipeta de 1 mL y vigorosamente, añadir 3 mL de medio de aislamiento de células frescas para desalojar a la biopsia.</li>
	<li>Decantar la biopsia en una placa Petri que contiene 5 mL de medio de aislamiento de células.</li>
	<li>Pique la biopsia en como pequeñas piezas como sea posible usando #5 pinzas y tijeras de fina puntada recta durante unos 20 minutos.</li>
	<li>Preparar la ADNasa I y enzimas colagenasa añadiendo 10 mL de medio de aislamiento de HESC a DNasa previamente pesado (0.5 mg/mL) y colagenasa (2,5 mg/mL). Mezclar con la pipeta.</li>
	<li>Pipeta de corta muestras de tejido utilizando una pipeta de 1 mL en un nuevo tubo de polipropileno cónico de 50 mL. Lavar con 7 mL de medio de aislamiento de células y añadir al tubo de polipropileno para adquirir la muestra completa.</li>
	<li>Centrifugar la muestra a temperatura ambiente a 800 x g durante 2 minutos Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta.</li>
	<li>Filtro de la DNasa I y solución de colagenasa con filtro de 0.2 μm al jeringa 10 mL directamente en pellets.</li>
	<li>Vortex por 10 s para Resuspender el pellet.</li>
	<li>Digest en baño de agua de 37 ° C durante 1,5 h, Vortex por 10 s completamente cada 10 minutos, hasta que se digiere el tejido.</li>
	<li>Filtrar la muestra a través de un colador de célula μm 40 apilados sobre un tubo de polipropileno de 50 mL cónico para quitar las células epiteliales y restos de tejido. Nota: Las células del estroma son en el tubo de polipropileno cónicos de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugar el tubo de polipropileno de 50 mL cónico a 800 x g durante 2,5 min a temperatura ambiente. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta de 1 mL.</li>
	<li>Resuspender el precipitado en 10 mL de medio de aislamiento de células.</li>
	<li>Centrifugue a 800 x g durante 2,5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y luego resuspender las células en 6 mL de HESCS medios y pipeta hacia adelante y hacia atrás para mezclar.</li>
	<li>Lentamente la capa en 3 mL de medio gradiente de densidad a las células resuspendidas para separar glóbulos restantes de las células del estroma, teniendo cuidado de no mezclar las capas.</li>
	<li>Centrifugar el tubo de polipropileno de 15 mL a 400 x g durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Recoger 5 mL del sobrenadante en un nuevo tubo de polipropileno de 50 mL y añadir un adicional 5 mL Media de HESCS para resuspender las células.</li>
	<li>Centrifugue a 800 x g durante 2,5 min a temperatura ambiente, seguida por eliminación del sobrenadante y adición de medios de comunicación de HESCS 6 mL. Vórtice de la muestra de 10 s y mezclar mediante pipeteo adelante y atrás 5 veces.</li>
	<li>Alícuota de 10 μl de células resuspendidas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para recuento de células.</li>
	<li>Añadir 10 μl de azul de tripano tinción celular alícuota y mezclar con la pipeta de 0,4%. Cargar 10 μl de la alícuota y contar las células usando un hemocitómetro.</li>
	<li>Las células en un frasco apropiado depende del conteo total en medios de comunicación de HESCS 15 mL de la placa.<ol>
<li>Si el número total de células es inferior a 1 millón, la placa de todas las celdas de 25 cm frasco con 6 mL de medio de HESCS. Si el número total de células es más de 1 millón, placa de todas las celdas de 75 cm frasco con 15 mL de medio de HESCS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Las células en una 5% CO2 incubadora a 37 ° C durante un mínimo de 6 h para asegurar la adhesión celular adecuada y cambiar los medios de comunicación a medios de comunicación de células de la cultura.</li>
	<li>La cultura las células aisladas en una 5% CO2 incubadora a 37 ° C por un período de 3-5 días hasta que las células forman una monocapa que alcanzar 80-90% de confluencia en un frasco plateado.</li>
	<li>Cambiar medios de HESCS cada dos días.<ol>
<li>Medios de HESCS caliente en un baño de agua de 37 ° C durante 15-20 min.</li>
		<li>Aspire los medios de comunicación del frasco y añadir Media células frescas al matraz (volumen de trabajo: 8 mL o 16 mL por frasco de 25 cm o 75 cm respectivamente).</li>
		<li>Frasco vuelva a colocar el 5% CO2 incubadora a 37 ° C hasta alcanza 80-90% de confluencia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Una vez células confluentes de 80-90%, transferencia de células de 25 cm a 75 cm matraz o frasco de 75 cm uno a tres frascos de 75 cm. Nota: HESCS pueden ser congelada y almacenada para uso posterior en este momento para la experimentación futura.</li>
</ol>4. congelación y descongelación HESCs
<ol><li>Aspire el medio del frasco de 75 cm y añadir 2 mL de tripsina-EDTA.</li>
	<li>Incubar en una incubadora 5% CO2 para 2-3 min a 37 ° C hasta desalojar a las células del frasco.</li>
	<li>Agregar 7 mL de HESCS Media y mezcla bien transfiriendo hacia adelante y hacia atrás.</li>
	<li>Centrifugue a 800 x g durante 2,5 min y aspirar el sobrenadante.</li>
	<li>Etiqueta los tubos con línea celular, fecha y número de paso de congelación.</li>
	<li>Resuspenda el precipitado de células en 5 mL de medio de congelación.</li>
	<li>Alícuota 1 mL de las células suspende de nuevo para cada tubo y transferencia tubos al congelador de-80 ° C.</li>
	<li>Transferir los tubos a nitrógeno líquido dentro de las 24 horas. Nota: Si planea descongelar las células en un futuro inmediato, guardar las células de-80 ° C durante un mes.</li>
	<li>Para descongelar las HESCs precalienta medios de HESCS por 20 min.</li>
	<li>Añadir 8 mL de medio de HESCS precalentado a matraz de 25 cm.</li>
	<li>Recuperar el tubo de congelación desde el tanque de nitrógeno líquido o -80 ° C y sumerja el tubo en baño de agua de 37 ° C durante 1-2 min descongelar las células.</li>
	<li>Transferencia de células descongeladas a un matraz de 25 cm con células e incubar en una incubadora 5% CO2 durante la noche a 37 ° C.</li>
	<li>Al día siguiente, cambiar el medio de HESCS y esperar 2-3 días hasta que HESCS ser confluente y transferir las células a matraz de 75 cm como se detalla a continuación en el protocolo 5.<ol>
<li>Medios de HESCS caliente en un baño de agua de 37 ° C durante 15-20 min.</li>
		<li>Aspire los medios de comunicación del frasco y añadir Media células frescas al matraz (volumen de trabajo: 8 mL o 16 mL por frasco de 25 cm o 75 cm respectivamente).</li>
		<li>Frasco vuelva a colocar el 5% CO2 incubadora a 37 ° C hasta alcanza 80-90% de confluencia.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. cultivo de células Stromal Endometrial humanas (HESCS)
Nota: Este procedimiento de cultivo se realiza en un ambiente estéril bajo una cabina de seguridad biológica.
<ol><li>Medios de comunicación de células pre-heat a 37 ° C en un baño de agua durante 20-30 min.</li>
	<li>Aspire los medios de comunicación del frasco y agregar 0.25% tripsina dihidratada del ácido (EDTA) (1 mL para el frasco de 25 cm o 2 mL para el frasco de 75 cm).</li>
	<li>Incubar en una 5% CO2 incubadora a 37 ° C durante 2-3 min hasta desalojar a las células.</li>
	<li>Golpee suavemente las paredes del matraz para desalojar las células restantes. Agregar 7 mL de HESCS Media y mezcla bien transfiriendo hacia adelante y hacia atrás.</li>
	<li>Pipeta de la mezcla de células en un tubo cónico de polipropileno 50 mL y centrifugar a 800 x g durante 2,5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante y Resuspenda el precipitado de células en medios de HESCS.<ol>
<li>Añadir 15 mL para el frasco de 25 cm o 45mL para el frasco de 75 cm (15 mL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 5 mL o 15 mL de suspensión de células en cada matraz de 25 cm o 75 cm respectivamente.</li>
	<li>La cultura las células aisladas en una 5% CO2 incubadora a 37 ° C por un período de 3-5 días hasta que las células forman una monocapa que alcanzar 80-90% de confluencia en un frasco plateado.</li>
	<li>Cambiar medios de HESCS cada dos días.<ol>
<li>Medios de HESCS caliente en un baño de agua de 37 ° C durante 15-20 min.</li>
		<li>Aspire los medios de comunicación del frasco y añadir Media células frescas al matraz (volumen de trabajo: 8 mL o 16 mL por frasco de 25 cm o 75 cm respectivamente).</li>
		<li>Frasco vuelva a colocar el 5% CO2 incubadora a 37 ° C hasta alcanza 80-90% de confluencia.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. humana galjanoplastia de célula (HESC) Stromal Endometrial y siRNA transfección
Nota: Este procedimiento de transfección se realiza en un ambiente estéril bajo una cabina de seguridad biológica.
<ol><li>Aspirar células medios del frasco de 75 cm y añadir 2 mL de solución al 0.25% tripsina-EDTA.</li>
	<li>Incubar de 5% CO2 incubadora a 37 ° C durante 2-3 min hasta desalojar a las células.</li>
	<li>Una vez que las células son desalojadas del frasco, agregar 7 mL de medio de células y mezclar suavemente transfiriendo hacia adelante y atrás 5 veces.</li>
	<li>Pipeta de la mezcla de células en un tubo cónico de polipropileno 50 mL y centrifugar a 800 x g durante 2,5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y Resuspenda el precipitado de células en 10 mL de medio de HESCS. Nota: Si las células de más de un frasco de la galjanoplastia, simplemente aumentar el volumen de medios de HESCS.</li>
	<li>Contar las células usando un hemocitómetro.<ol>
<li>Alícuota de 10 μl de células suspendidas de nuevo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
		<li>Añadir 10 μl de 0.4% azul de tripán mancha a celular alícuota y mezclar mediante pipeteo hacia adelante y atrás.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Células por pocillo en placas de 6 pocillos en placa 0.8 x 105 . Después de dos días, las células deben ser confluente de 60-70% para transfección óptima.</li>
	<li>Para cada muestra de transfección de siRNA, preparar complejos usando siRNA (60 nanomoles) al reactivo de transfección.</li>
	<li>Diluir 5 μl de reactivo de transfección en 150 μL de medios libres de suero reducido e incubar durante 5 minutos.</li>
	<li>Diluir 60 nanomoles de siRNA en 100 μl de medios libres de suero reducido e incubar durante 5 minutos.</li>
	<li>Después de 5 minutos, combinar siRNA diluido con solución de reactivo de transfección diluido y mezclar suavemente transfiriendo hacia adelante y atrás 5 veces. Nota: Si transferencia de uno o varios siRNA en pozos múltiples, prepare la mezcla principal en 10 mL tubos de poliestireno.</li>
	<li>Incubar complejos de reactivo de transfección de siRNA durante 5 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Durante la incubación, añadir 1 mL de medio de cambio a cada pocillo.</li>
	<li>Después de 5 minutos de incubación, centrifugar los tubos a 500 x g durante 2 minutos recoger la solución y añadir 250 μl de complejos de reactivo de transfección de siRNA a cada uno que también contiene las células y los medios de comunicación.</li>
	<li>Mezclar, meciendo suavemente e incubar las células a 37° C en un incubador 5% CO2 para 5 h.</li>
	<li>Después de 5 h, cambiar los medios de comunicación a medios de HESCS.</li>
	<li>Incube las células a 37 ° C en un incubador de 5% CO2 durante 2 días en la preparación de un ensayo de decidualization en vitro .</li>
</ol>7. in Vitro Decidualization ensayo
Nota: Este ensayo se realiza en un ambiente estéril bajo una cabina de seguridad biológica.
<ol><li>Preparar los medios de comunicación EPC antes de iniciar el tratamiento in vitro decidualization como se describe en Camden et al. 3 (ver 1.6).</li>
	<li>Aspire los medios de comunicación de la hora del post-48 transfected línea de HESCS se incubaron de paso 6.16.</li>
	<li>Añadir 2 mL de medio de EPC en cada pozo. Nota: como control, dejar un conjunto de células sin trata con los medios de comunicación EPC. En su lugar, añadir 2 mL de células los pocillos de control.</li>
	<li>Incubar las células en 5% CO2 incubadora a 37 ° C durante 6 días.<ol>
<li>Cambiar los medios de comunicación EPC cada 48 horas.<ol>
<li>Calentar y preparar los medios de comunicación EPC en un baño de agua de 37 ° C durante 15-20 min.</li>
			<li>Aspire los medios de comunicación del pozo y agregar medios EPC fresco.</li>
			<li>Coloque la placa en el 5% CO2 incubadora a 37 ° C.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después del sexto día, analizar el grado de decidualization células estromales mediante ELISA y qRT-PCR (como se describe a continuación).</li>
</ol>8. validación del Decidualization In Vitro utilizando PCR en tiempo Real cuantitativa (qRT-PCR)
Nota: qRT-PCR se completa como se describió anteriormente en Kommagani et al10.
<ol><li>Aislar el ARN total de HESCS utilizando el protocolo de un kit de aislamiento de RNA comercialmente disponible.<ol>
<li>Analizar la cantidad de RNA y la pureza (un260/A280) usando un NanoDrop o metodología similar como se describe en Garcia-Elias et al15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sintetizar el cDNA de 1 μg de ARN total a través de un protocolo del kit de transcripción reversa disponible en el mercado.</li>
	<li>Haga una reacción de qRT-PCR como se describe en un protocolo del kit disponible comercialmente de qRT-PCR.<ol>
<li>Realizar la reacción con un disponible en el mercado en tiempo real PCR Master Mix y sondas de genes específicos junto con controles internos del sistema (18s, PRLy IGFBP1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. validación del Decidualization In Vitro utilizando ELISA
<ol><li>Cuantificar los niveles de prolactina secretados desde los medios de cultivo de tejido utilizando un kit de prolactina ELISA disponible comercialmente.</li>
</ol>10. validación del Decidualization In Vitro utilizando Phalloidin tinción.
<ol><li>Inserte el cubre-objetos estéril en cada pocillo de una placa bien 12.</li>
	<li>Repita los pasos 6.1-6.5.</li>
	<li>Células por pocillo de una placa de la pozo 12 en placa 0.8 x 105 .</li>
	<li>Incubar las células en 5% CO2 incubadora a 37 ° C durante 2 días.</li>
	<li>Aspire los medios de comunicación.</li>
	<li>Repita los pasos 7.3-7.4.</li>
	<li>Fijar las células en 4% paraformaldehido (PFA) en tampón fosfato salino (PBS) a temperatura ambiente durante 30 minutos.</li>
	<li>Aspire la solución de fijación y lavar 3 veces con 1 mL de PBS durante 5 minutos.</li>
	<li>Añadir éter de fenil 0.1% tensioactivo no iónico, glicol de polietileno terc-octil en PBS durante 5 minutos las células fija para aumentar la permeabilidad.</li>
	<li>Lavar 3 veces con 1 mL de PBS durante 5 minutos.</li>
	<li>Añada 100 μl de solución phalloidin por cubreobjetos e incubar a temperatura ambiente durante 90 minutos.<ol>
<li>Preparar la dilución 1: 100 en PBS de utilizar una solución madre de phalloidin en 1 unidad por 5 μl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavar 3 veces con 1 mL de PBS durante 5 minutos.</li>
	<li>Montar las diapositivas con medio de montaje que contiene 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI).</li>
	<li>Observar las células utilizando un microscopio confocal.</li>
</ol>

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<li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+endometritis+modifies+decidualization+in+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Chronic endometritis modifies decidualization in human endometrial stromal cells.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 15, 16(2017).</li>
<li>Garcia-Elias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+quantification+methods+and+optimizing+protocols+for+microarray+hybridization+of+circulating+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Defining quantification methods and optimizing protocols for microarray hybridization of circulating microRNAs.</a> Scientific Reports. 7, 7725(2017).</li>
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<li>Koukouritaki, S. B., Margioris, A. N., Gravanis, A., Hartig, R., Stournaras, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dexamethasone+induces+rapid+actin+assembly+in+human+endometrial+cells+without+affecting+its+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Dexamethasone induces rapid actin assembly in human endometrial cells without affecting its synthesis.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 65, 492-500 (1997).</li>
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Este trabajo es apoyado por financiamiento de institutos nacionales de salud (NIH) / Instituto Nacional de salud infantil y desarrollo humano (NICHD) grant (R00 HD080742) y puesta en marcha de la escuela de medicina de la Universidad de Washington fondos a R.K. Nos gustaría agradecer a la clínica de fertilidad de la Universidad de Washington para proporcionar las muestras de biopsia endometrial.

El ciclo menstrual reproductivo femenino se caracteriza por un aumento en los niveles de progesterona durante la fase lútea, de tal modo induciendo el decidualization del ESC en Ronda, epiteliales como células secretoras3,8. La iniciación del decidualization es especie dependiente. En los seres humanos, decidualization se produce espontáneamente tras el aumento de la concentración de progesterona, mientras que ratones requieren presencia de blastocistos<sup class...

Entre las etapas de la menarquia y la menopausia, las mujeres en edad reproductiva se someten a ciclos mensuales de la proliferación endometrial regulados por hormonas, la diferenciación y el posterior vertimiento en preparación para el embarazo en un proceso conocido como menstruación1 ,2. Las modificaciones físicas del endometrio humano son necesarias para la implantación adecuada del embrión en la pared uterina1. Alteraciones del endometrio, incluyendo adaptaciones tanto morfológicas como bioquímicas, son mediadas a través del ciclo menstrual a través de las hormonas esteroides ováricas estrógenos y progesterona (P4)3,4,5. Dentro de la fase proliferativa (o folicular), los niveles de estrógenos preovulatorio aumento, Inicio de engrosamiento del endometrio. Después de la ovulación, la fase secretora (o luteínica) promueve un aumento significativo en las concentraciones de P4, induciendo la transformación morfológica de células stromal endometriales (ESC) de aspecto fibroblasto-como redondeadas, epitelial-como las células decidual en un proceso conocido como decidualization4,6. Decidualization incorrecta se ha establecido como una causa de fracaso de implantación y posterior temprano embrión aborto4,7,8. Por lo tanto, entender los mecanismos moleculares subyacentes decidualization es ventajoso para el diagnóstico y tratamiento de la pérdida temprana del embarazo.
Actualmente, se utilizan varias metodologías para explorar los efectos subyacentes del decidualization en células stromal endometriales. In vivo, el útero de ratón puede ser inducida artificialmente para decidualization mediante estimulación mecánica (es decir, arañazos) o aceite de inyección en un útero preparado hormonal9. Distinto de los seres humanos, esta estimulación sintética promueve la diferenciación del lumen uterino proporcionando la apariencia de la presencia de blastocistos, un paso que se requiere para la iniciación del decidualization en roedores10,11. En consecuencia, debido a las complicaciones traslacionales asociadas con modelos animales y los dilemas éticos que rodean en vivo basado en estudios en seres humanos, con más éxito se estudian modelos decidualization basado en vitro.
En este estudio, los sujetos son reclutados a través de la colocación de anuncios en dos periódicos locales de inglés y español. Temas identificados como candidatos adecuados para este estudio se traen adentro para reunirse con el Coordinador de la investigación, en el que se discuten una divulgación completa de los riesgos potenciales. Sobre la confirmación de una comprensión completa de los riesgos potenciales involucrados, consentimiento de los sujetos se logró en forma escrita y verbal. Consentimiento del sujeto incluye permiso (1) almacenamiento (2) a largo plazo de flebotomía de sus tejidos para la investigación futura y (3) de acuerdo a la creación de cultivos primarios de muestras de tejido recogidas. Después de consentimiento, temas reciben un formulario para completar en que líos permitidos de raza/origen étnico y el derecho de confidencialidad. Una visita subsecuente está programada para obtener la biopsia de endometrio basada en el ciclo menstrual del sujeto. Voluntarios reclutados en este estudio reflejan la demografía étnica y racial de la región metropolitana de St. Louis como se documenta en el censo 2012 y no implicó la participación de todas las poblaciones vulnerables incluyendo mujeres embarazadas, fetos, embriones, niños menores de 18 años de edad, o de otros grupos vulnerables. Requisitos de elegibilidad para la participación en la toma de muestras de biopsia incluyen (1) ser entre las edades de 18-45 años (2) tener ciclos menstruales regulares (días 25-32) (3) no tener ningún embarazo actual o uso de dispositivo intrauterino/hormonales anticonceptivos 30 días antes de la inscripción (4) no actual infección vaginal o enfermedades de transmisión sexual (5) que no los tratamientos antibióticos actuales y (6) no que actual citología vaginal anormal.
Dentro de este estudio, las células stromal endometriales humanas (HESCS) son cultivadas y artificialmente inducidas a decidualization en vitro a través de la suplementación de hormonas (estradiol (E2), acetato de medroxiprogesterona (MPA) y adenosina cíclica monofosfato (cAMP)) al medio. En este método, el grado de decidualization se altera en base en el número total de días de tratamiento hormonal. Junto con el cambio de citoesqueleto, suplementación hormonal induce adaptaciones bioquímicas en el cual las células decidual experimentan cualidades secretores como2,4. La expresión de genes de la seña de identidad, como la prolactina (PRL) y la proteína de unión a factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGFBP1), puede ser utilizada para confirmar y cuantificar el grado de HESCS decidualization5,12, 13 , 14. lo importante, también se demuestra la viabilidad de este protocolo para llevar a cabo la caída específica del gene.

<table><tbody><tr><td>Opti-MEM I (1X) Medio de suero reducido</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Para medios de decidualización</td></tr><tr><td>DMEM / F12 (1:1) (1X)</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Tinción azul de tripán (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>Para recuento de células</td></tr><tr><td>PureLink RNA Mini Kit</td><td>Invitrogen</td><td>12183018A</td><td>Para aislamiento/purificación de ARN</td></tr><tr><td>TaqMan 2X Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad Applied</td><td>Biosystems</td><td>4374967</td><td></td></tr><tr><td>control endógeno del ARNr eucariota 18S</td><td>Life Technologies</td><td>4319413E</td><td>para el control interno de qPCR</td></tr><tr><td>Ensayo de expresión génica TaqMan Sonda de prolactina</td><td>Applied Biosystems</td><td>4331182</td><td>para el control interno de qPCR</td></tr><tr><td>Expresión génica TaqMan Ensayo IGFBP1 Sonda</td><td>Biosystems Applied</td><td>4331182</td><td>para el control interno de qPCR</td></tr><tr><td>Reactivo de faloidina-iFluor 488 - CytoPainter</td><td>Abcam</td><td>ab176753</td><td></td></tr><tr><td>Prolactina Humana ELISA Kit</td><td>Invitrogen</td><td>EHIAPRL</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehído</td><td>Alfa Aesar</td><td>30525-89-4</td><td>Lipofectamina Fijadora</td></tr><tr><td>RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778150</td><td>Reactivo de transfección</td></tr><tr><td>ProLong Gold reactivo antidecoloración con DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>Para montaje</td></tr><tr><td>0.25% Tripsina-EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Carbón Vegetal Fetal Bovino Suero Sigma</td><td></td><td>F6765-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sodio (7.5%)</td><td>Gibco</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>45001749</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma</td><td>C0130-1G</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa I de páncreas bovino</td><td>Sigma</td><td>DN25-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Medroxiprogesterona 17-acetato</td><td>Sigma</td><td>M1629-1G</td><td>para medios EPC</td></tr><tr><td>Estradiol</td><td>Sigma</td><td>E1024-1G</td><td>para medios EPC</td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma</td><td>A6885-100MG</td><td>para medios EPC</td></tr><tr><td>Tijeras de puntada recta fina</td><td>Fine Science Tools</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>Ensayo de expresión génica TaqMan Sonda NCOA2</td><td>Suero bovino fetal de Biosystems 4351372</td><td></td><td></td>Applied Biosystems</tr><tr><td>, inactivado por calor</td><td>Gibco</td><td>10-082-147</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-antimicótico</td><td>Thermo 15240062</td><td></td><td></td></tr><tr><td>científico Hank' s Solución salina equilibrada &nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-021-cv</td><td></td></tr><tr><td>50 mL polipropileno cónico Tubo Falcon</td><td>Pinza Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Fine</td><td>Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm Placa de Petri de vidrio</td><td>VWR</td><td>75845-546</td><td></td></tr> Colador de <tr><td>celdas de 40 micras</td><td>Midsci</td><td></td> 229481 <td></td></tr><tr><td>Isotemp 215 Baño de agua</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS-215</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga LSE&nbsp;</td><td>Corning</td><td>6755</td><td></td></tr><tr><td>NCOA2 humano siRNA&nbsp;</td><td>Dharmacon</td><td>L-020159-00</td><td>Sonda qPCR específica de genes</td></tr><tr><td>Incubadora de CO2 Steri-cycle i160&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>51030301</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>para la cuantificación</td>de</tr><tr><td>ARN Solución salina tamponada con fosfato&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50146771</td><td></td></tr><tr><td>75 cm matraz de cultivo celular de cuello inclinado</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>6 pocillos Placa de cultivo celular no pirogénico</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de pipetas Ultra</td><td>Corning</td><td>4099</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>19.0.1.334</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de cultivo celular de cuello inclinado de 25 cm</td><td>Corning</td><td>7200876</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-1L</td><td></td></tr><tr><td>15 mL polipropileno cónico Tubo Falcon</td><td>Corning</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Jeringa</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>1300 Serie A2 Campana de seguridad biológica Thermo</td><td>Scientific</td><td>1377</td><td></td></tr><tr><td>accuspin Micro17 centrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>13100675</td><td></td></tr><tr><td>7500 Fast Sistema de PCR en tiempo real</td><td></td> Microscopio de inmunofluorescencia <td>Applied Biosystems</td> 3052632 <td></td></tr><tr><td>EVOS FL Life</td><td>Technologies</td><td>01414-155G-291</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de luz invertida</td><td>Leica Leica</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>Illrustrator</td><td>Adobe</td><td>22.0.1.253</td><td></td></tr><tr><td>Excel Hojas de cálculo</td><td>Microsoft</td><td>2016</td><td></td></tr><tr><td>Deckglaser 18 mm</td><td>NeuVitro</td><td>GG-18</td><td></td></tr><tr><td>Reichert Hemacitómetro de línea brillante</td><td>Sigma</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Biorreactivos Fisher</td><td>BP176-100</td><td>Para tampón de lisis de ARN</td></tr><tr><td>1,2 ml Vial criogénico de polipropileno roscado externo</td><td>Corning 430658</td><td></td><td>Para congelar células HESC&nbsp;</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650-100mL</td><td>Para medios de congelación</td></tr></tbody></table>

aislamiento de células stromal endometrial humanas in vitro decidualization

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

La diferenciación de células stromal endometriales humanas (HESC) de fibroblasto-como aspecto en decidua secretor es una transformación necesaria para la implantación del embrión en el revestimiento del útero de la matriz materna. Decidualization incorrecta se ha establecido como una causa de fallo de implantación y posterior aborto espontáneo del embrión temprano. Por lo tanto, entender los mecanismos moleculares subyacentes decidualization es ventajoso mejorar el índice de nacimientos exitosos. En vivo basado en estudios de decidualization artificial a menudo se limitan debido a dilemas éticos asociados a la investigación en humanos, así como complicaciones traslacionales en modelos animales. Como resultado, en vitro ensayos a través de cultivo celular primario son utilizados a menudo para explorar la modulación del decidualization a través de las hormonas. Este estudio proporciona un protocolo detallado para el aislamiento de células y posterior decidualization artificial mediante la suplementación de hormonas al medio de cultivo. Además, este estudio proporciona un método bien diseñado para caída cualquier gen de interés utilizando siRNA basado en lípidos transfecciones. Este protocolo permite la optimización de la pureza de la cultura, así como rendimiento del producto, maximizando así la capacidad para utilizar este modelo como un método confiable para entender los mecanismos moleculares subyacentes decidualization y la posterior cuantificación de agentes secretados por las células estromales del endometrio decidualized.

Decidualization en cultivo de células
Tras aislamiento, las células stromal endometriales humanas fueron cultivadas a una formación de monocapa con 80-90% de confluencia e inducida por decidualization en vitro por tratar con 10 nM E2, 1 μm MPA y campamento de 50 μm (EPC). Cambios morfológicos asociados con en vitro decidualization fueron visualizados en la figura 1A</strong...

Este estudio presenta un procedimiento optimizado y validado para el aislamiento y cultivo de células stromal endometriales humanas para llevar a cabo análisis de decidualization en vitro . Además, este estudio proporciona un método detallado para eficiente precipitación un gen específico usando siRNA en células stromal endometriales humanas.

Aislamiento de células Stromal Endometrial humanas In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Este método se puede utilizar para responder preguntas clave en el campo de la medicina reproductiva sobre los mecanismos moleculares subyacentes de la decidualización y la comprensión de las funciones de genes específicos en la decidualización de las células del estroma endometrial. Este estudio proporciona un protocolo detallado para el aislamiento de células estromales endometriales humanas y su posterior decidualización artificial mediante la suplementación de hormonas en los medios de cultivo. La expresión de cambios hormonales, como la prolactina y la proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina uno, se puede utilizar para confirmar y cuantificar el grado de decidualización.Es importante destacar que también se demuestra la viabilidad de este protocolo para llevar a cabo la eliminación específica de genes. Transfiera la biopsia con pinzas esterilizadas a un tubo de 50 mililitros que contenga diez mililitros de HBSF fresco, seguido de una centrifugación a 500x G durante 90 segundos. Con una pipeta de un mL, retire el medio y añada tres mL de medio de aislamiento hES precalentado.Decantar la biopsia en un plato de 10 centímetros que contenga cinco ml de medi

isolation-human-endometrial-stromal-cells-for-vitro

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

El establecimiento de los sistemas primarios de células endometriales estromales de cultivo a partir de especímenes de histerectomía es una técnica biológica valiosa y un paso crucial antes de continuar con una amplia gama de objetivos de investigación. Aquí se describen dos métodos utilizados para establecer cultivos de estroma de los tejidos del endometrio resecado quirúrgicamente de pacientes humanos.

Dos métodos para fijar las células humanas primarias endometrial estromales de la histerectomía especímenes

Este estudio presenta un método estandarizado y validado para el aislamiento y cultivo de ratón primario del estroma endometrial y células epiteliales, que se puede utilizar en un sistema de cocultivo para estudiar en decidualization vitro.

Aislamiento de ratón endometrial epiteliales y células del estroma de<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualization

Este protocolo muestra un método para el aislamiento de las células decidual humanas primarias recogidas de las membranas fetales de la placenta de término que puede ser utilizada para una variedad de aplicaciones (es decir, inmunocitoquímica, citometría de flujo, etc.) con el objetivo de para estudiar el papel de diferentes poblaciones celulares en complicaciones del embarazo.

Aislamiento de células Decidual humanas primarias de las membranas fetales de la placenta de término

Este protocolo describe metodologías para establecer organoides epiteliales endometriales de ratón para la expresión génica y análisis histológicos.

Establecimiento de organoides endometriales 3D a partir del útero del ratón

El protocolo muestra un novedoso modelo experimental in vitro que puede recapitular la biología de dos tipos de líneas celulares adherentes con un andamio impreso en tres dimensiones (3D). Se describe la construcción de este modelo y los procedimientos operativos, desde la preparación y el cultivo celular hasta el análisis y la evaluación.

Modelo de cocultivo utilizando dos tipos de líneas celulares adherentes

La heterogeneidad transcripcional dentro de las células estromales derivadas del tejido adiposo humano se puede definir a nivel de célula individual utilizando marcadores de superficie celular y genes osteogénicos.  Describimos un protocolo que utiliza citometría de flujo para el aislamiento de subpoblaciones celulares con mayor potencial osteogénico, que puede usarse para mejorar la reconstrucción esquelética craneofacial.

El aislamiento y enriquecimiento de Human adiposo derivado de células estromales de la osteogénesis mejorada

En este documento se describen los métodos para la disección de tejidos fetales y maternas de placenta humana a término, seguido por el aislamiento y expansión de células madre mesenquimatosas / estroma (MSC) de estos tejidos.

Aislamiento y expansión de células madre mesenquimales / estromales derivadas de tejido de placenta humana

Las células estromales derivadas del tejido adiposo pueden ser útiles para diseñar nuevo tejido a partir de las propias células de un paciente. Presentamos un protocolo para el aislamiento de una subpoblación de células estromales derivadas del tejido adiposo humano (ASCs) con mayor potencial osteogénico, seguido de la aplicación de las células en un ensayo de curación calvarial in vivo.

El aislamiento rápido de BMPR-IB + derivadas de tejido adiposo células estromales de uso en un Defecto La curación Modelo de calota

Aquí, se presenta un protocolo para la disección de cordón umbilical humano umbilical (CU) y la muestra de placenta fetal en cable de forro (CL), gelatina de Wharton (WJ), la unión de cordón placenta (CPJ), y placenta fetal (FP) para el aislamiento y caracterización de células estromales mesenquimales (MSCs) utilizando la técnica de cultivo de explantes.

Aislamiento y caracterización de las células mesenquimales del estroma de cordón umbilical humano y fetal Placenta

Aquí, presentamos un protocolo para generar eficientemente células trofoblásticas humanas a partir de células madre pluripotentes humanas utilizando la proteína morfogénica ósea 4 e inhibidores de las vías Activina/Nodal. Este método es adecuado para la diferenciación eficiente de células madre pluripotentes humanas y puede generar grandes cantidades de células para la manipulación genética.

Diferenciación in vitro de células madre pluripotentes humana en células trofoblásticas

Aprenda a aislar células stromales endometriales humanas e inducir su decidualización in vitro mediante suplementación hormonal. Este protocolo permite el silenciamiento génico con siRNA para estudiar mecanismos moleculares en biología reproductiva.

Aislamiento de células Stromal Endometrial humanas In Vitro Decidualization

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