Aislamiento de células Stromal Endometrial humanas In Vitro Decidualization

Este método se puede utilizar para responder preguntas clave en el campo de la medicina reproductiva sobre los mecanismos moleculares subyacentes de la decidualización y la comprensión de las funciones de genes específicos en la decidualización de las células del estroma endometrial. Este estudio proporciona un protocolo detallado para el aislamiento de células estromales endometriales humanas y su posterior decidualización artificial mediante la suplementación de hormonas en los medios de cultivo. La expresión de cambios hormonales, como la prolactina y la proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina uno, se puede utilizar para confirmar y cuantificar el grado de decidualización.

Es importante destacar que también se demuestra la viabilidad de este protocolo para llevar a cabo la eliminación específica de genes. Transfiera la biopsia con pinzas esterilizadas a un tubo de 50 mililitros que contenga diez mililitros de HBSF fresco, seguido de una centrifugación a 500x G durante 90 segundos. Con una pipeta de un mL, retire el medio y añada tres mL de medio de aislamiento hES precalentado.

Decantar la biopsia en un plato de 10 centímetros que contenga cinco ml de medio de aislamiento hES, y comience a picar con pinzas Dumont 5 y tijeras de puntada recta fina durante unos 20 minutos. Con una pipeta de mL, transfiera la biopsia picada a un nuevo tubo de 50 mL y agregue siete mL adicionales de medio de aislamiento hES a la placa, para transferir las piezas restantes al tubo de 50 mL. A continuación, centrifugar la muestra durante dos minutos a 800x G y eliminar el sobrenadante con una pipeta de un mL.

A continuación, filtre la mezcla de digestión de DNasa-1 y colagenasa a través de un filtro de 0,2 micras conectado a una jeringa de 10 mililitros directamente sobre el pellet. A continuación, agite el tubo durante 10 segundos para volver a suspender el pellet e incube durante 90 minutos en un baño de agua. Después de cada 10 minutos, agite el tubo durante 10 segundos para asegurarse de que el tejido se digiera correctamente.

Después de la incubación, filtre la suspensión a través de un filtro de células de 40 micras apilado sobre un nuevo tubo de 50 mililitros para recuperar las células estromales, luego centrifugue las células recolectadas a 800x G durante 2,5 minutos. Después de la centrifugación, retire suavemente el sobrenadante con una pipeta de un mililitro, asegurándose de no alterar la pastilla de celdas. A continuación, vuelva a suspender el pellet de la célula en 10 mililitros de medio de aislamiento hES fresco, seguido de una centrifugación a 800x G durante 2,5 minutos.

Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante con cuidado y vuelva a suspender las células en un medio hES fresco de seis mililitros. A continuación, para extraer las células sanguíneas, coloque lentamente las células resuspendidas en capas de tres mililitros de medio de gradiente de densidad y centrifugue la muestra a 400x G durante 30 minutos. Después de la centrifugación, recoja el sobrenadante sin alterar el medio de gradiente de densidad.

A continuación, añada medios hES para aumentar el volumen total a 10 mililitros y vuelva a centrifugar la muestra a 800x G durante 2,5 minutos. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en seis mililitros de medio hES. A continuación, coloque las células en un matraz de 75 centímetros añadiendo seis mililitros de la resuspensión de células y 10 mililitros de medio hES al matraz, seguido de una mezcla suave meciendo el matraz.

Después de la siembra, verifique la densidad celular bajo el microscopio, luego cultive las células en una incubadora de dióxido de carbono al 5% durante tres a cinco días, asegurándose de cambiar el medio hES cada dos días. Después de 48 horas, las células deben crecer como una monocapa. Por lo general, después de cinco días, las células alcanzan una confluencia del 80 al 90% en un matraz de 75 centímetros.

Para la transfección de siRNA, comience colocando 800.000 células por pocillo en una placa de seis pocillos por triplicado para cada condición, e incube las células en una incubadora de dióxido de carbono al 5% durante dos días para prepararse para la transfección. Después de dos días, agregue 150 microlitros de medios libres de suero Opti-MEM en un tubo de cinco ml, seguido de la adición de cinco microlitros de reactivo de transfección. Mezclar bien por inversión, e incubar durante cinco minutos.

A continuación, agregue 100 microlitros de medios libres de suero Opti-MEM en un nuevo tubo de cinco ml, seguido de la adición de 16 nanomoles de siRNA SRC-2. A continuación, añada 100 microlitros de medios libres de suero Opti-MEM en un tubo de cinco ml, seguido de la adición de 16 nanomoles de siRNA de control. Después de la incubación, combine el reactivo de transfección diluido con el siRNA SRC-2 y mezcle bien pipeteando hacia adelante y hacia atrás.

A continuación, combine el reactivo de transfección diluido con el siRNA de control y mezcle bien pipeteando hacia delante y hacia atrás. A continuación, incubar los complejos durante cinco minutos. Durante esta incubación, aspire el medio hES y agregue un mililitro de medio de cambio a cada pocillo.

Después de cinco minutos de incubación, centrifugar los complejos a 500x G durante dos minutos para recoger la solución. A continuación, añada 250 microlitros de los complejos de reactivos de transfección de siRNA a cada pocillo que contenga células y medios, y mezcle mediante un balanceo suave, seguido de la incubación en una incubadora de dióxido de carbono al 5% durante cinco horas a 37 grados centígrados. Después de cinco horas, aspire el medio y cámbielo a medio hES, y continúe la incubación durante dos días en preparación para un ensayo de decidualización in vitro.

Después de la transfección de 48 horas y antes de iniciar el ensayo de decidualización in vitro, recoja las células transfectadas de siRNA de control de día cero y SRC-2 siRNA. Primero, aspire el medio y lave con un mL de PBS por pocillo. A continuación, retire el PBS y añada 300 microlitros de tampón de lisis de ARN por pocillo e incube durante tres minutos.

Después de tres minutos de incubación, recoja las células en tampón de lisis de ARN en un tubo de 1,5 ml para su posterior análisis. A continuación, prepare el medio EPC alícuota el volumen adecuado de medio de decidualización y añada 10 nanomolares de estradiol, un acetato de medroxiprogesterona micromolar y 50 micromolares de adenosina monofosfato cíclico en un tubo de 50 mililitros. Para los pocillos restantes del sexto día, agregue dos mililitros de medio EPC en cada pocillo e incube las células en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius durante seis días, cambiando el medio EPC cada 48 horas.

Después del sexto día, recoja los gránulos de células transfectadas de siRNA de siRNA del sexto día y SRC-2 del sexto día en tampón de lisis de ARN para el análisis posterior mediante PCR en tiempo real. La inducción de la decidualización por acetato de estrógeno medroxiprogesterona y monofosfato de adenosina cíclico, da como resultado el reordenamiento del citoesqueleto de las células estromales de células fibroblásticas alargadas a células epitelioides redondeadas. La tinción con faloidina de las células estromales endometriales revela además la reorganización activa del citoesqueleto de fibras característica de la decidualización de hES.

En las células hES tratadas con vehículos, las células permanecen fibroblásticas en apariencia, mientras que en las células tratadas con EPC, las hES parecían epitelioides. Para confirmar la eficacia del ensayo de decidualización in vitro, se evaluaron los niveles de transcripción de ARNm de los marcadores de decidualización prolactina y la proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina-1 durante un período de 6 días. Tras la decidualización de las células estromales endometriales humanas, los niveles de prolactina e IGFBP1 aumentaron de forma dependiente del tiempo.

El aumento dependiente del tiempo de los niveles de prolactina secretada también se confirmó mediante el examen de los medios de cultivo de tejidos hES mediante el método ELISA. Se evaluaron los efectos de knockdown específicos de genes en los cambios celulares y moleculares de la decidualización de las células del estroma endometrial humano en el sexto día de cultivo después de la transfección de siRNA de 48 horas, con siRNA de control o coactivador del receptor de esteroides 2. Las hES transfectadas con siRNA de control mostraron cambios celulares y moleculares, consistentes con una decidualización adecuada, incluido un cambio morfológico en adoquines y un aumento de los niveles de transcripción de los marcadores de decidualización PRL e IGFBP1.

En el knockdown de siRNA de SRC-2, las hES permanecieron fibroblásticas en apariencia en comparación con las hES transfectadas con siRNA de control, y mostraron niveles de transcripción de PRL e IGFBP1 significativamente disminuidos. Los niveles de transcripción de SRC-2 disminuyeron significativamente en las hES transfectadas con siRNA de SRC-2 en comparación con el siRNA de control, lo que indica la viabilidad de este método para el silenciamiento génico. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar células estromales primarias de biopsias endometriales con el fin de decidualizar in vitro y eliminar un gen específico de interés mediante la transfección de siRNA.