Enriquecimiento y caracterización de los microambientes Tumor inmunes y no inmunes en tumores murinos subcutáneos establecidos

El objetivo general de esta técnica es proporcionar un método para el perfil simultáneo de las fracciones de células inmunitarias y cancerosas que contribuyen al microambiente inmunitario de los tumores sólidos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la oncología inmunitaria, como qué cambios en serie inmunitarios y no inmunitarios se producen en el tumor después de un tratamiento determinado. La principal ventaja de esta técnica es que facilita el enriquecimiento efectivo de los componentes inmunes y no inmunes del tumor, permitiendo un perfil exhaustivo del estado inmunológico del tumor.

El objetivo general de este método es perfilar de manera eficiente el microambiente inmunitario del tumor e identificar los cambios inducidos por el tratamiento. Después de rociar el ratón con etanol al 70% para evitar la contaminación del cabello, extirpe quirúrgicamente los tumores subcutáneos, teniendo cuidado de que los tumores estén libres de cualquier tejido contaminante. A continuación, se coloca cada tumor en 1,8 mililitros de medio base RPMI 1640 sin suero fetal bovino en pocillos individuales de una placa de 24 pocillos en hielo.

Cuando se hayan recolectado todos los tumores, use unas tijeras para cortar las muestras en trozos de menos de un milímetro cúbico y agregue 200 microlitros de cóctel de disociación 10X recién preparado que contiene colagenasa-1, colagenasa-4 y DNasa uno a cada pocillo. Después de una hora a 37 grados Celsius, en un agitador de placas orbital a 60 a 100 RPM, neutralice la reacción con un mililitro de medio RPMI 1640 suplementado con 5% de FBS y dos milimolares de EDTA, y use una punta de pipeta modificada de un mililitro para transferir cada muestra de lechada tumoral a tubos cónicos individuales de 50 mililitros rematados con filtros individuales de 40 micrómetros. Con un émbolo de jeringa de 10 mililitros, disgregue mecánicamente los trozos de tumor a través de los filtros, enjuagando periódicamente cada filtro con dos mililitros de medio RPMI 1640 más 5% de FBS hasta que los filtros estén libres de tumor.

Cuando se hayan disociado todos los tumores, agregue medio a cada tubo según sea necesario para que todas las muestras alcancen el mismo volumen y granulen las células por centrifugación. A continuación, utilice una pipeta serológica de cinco mililitros para resuspender los gránulos en dos mililitros de medio suplementado con FBS por tubo. Para separar las fracciones de células inmunitarias y tumorales, agregue tres mililitros de medio de gradiente de densidad a la parte inferior de un tubo cónico de 15 mililitros por muestra y coloque lentamente dos mililitros de suspensión de células tumorales en el costado de cada tubo en cada gradiente.

Tenga cuidado de asegurarse de que las suspensiones de células tumorales se mezclen bien antes de colocar las capas, que las suspensiones celulares se pipeteen lentamente por el costado de los tubos y que los tubos se manipulen con cuidado para evitar que se mezclen las capas. Separe las células mediante centrifugación en gradiente de densidad y recoja cuidadosamente el medio superior y las capas de leucocitos infiltrantes del tumor en un nuevo tubo de 15 mililitros por muestra. Deseche el medio de gradiente de densidad restante y vuelva a suspender los gránulos tumorales en dos mililitros de medio más FBS por tubo.

A continuación, centrifugar todas las muestras y resuspender los leucocitos infiltrantes tumorales en 200 microlitros y las células tumorales en dos mililitros de medio más FBS por tubo en hielo. Para colocar las células en una placa, etiquete una placa inferior en U de 96 pocillos para cada panel de tinción inmunitaria, además de una placa adicional para los recuentos de células y alícuota de las suspensiones de células individuales en cada una de las placas del panel de tinción y la placa de cal. Lave las células dos veces con 200 microlitros de PBS de Dulbecco por muestra y bloquee las células con 50 microlitros de bloque FC por pocillo durante 20 minutos a cuatro grados centígrados.

Al final de la incubación de bloqueo, agregue 50 microlitros de anticuerpo dirigido extracelular concentrado 2X y una mezcla de tinción de viabilidad fijable a cada pocillo para una incubación de 30 minutos en la oscuridad. Al final de la incubación de la tinción, lavar las muestras dos veces con tampón FACS y resuspender los pellets en 200 microlitros de solución de fijación y permeabilización durante la noche a cuatro grados centígrados, protegidos de la luz. Al día siguiente, recoja las células por centrifugación, seguido de un lavado con 200 microlitros de tampón de permeabilización por pocillo.

Etiquete las células con 100 microlitros de panel de tinción de anticuerpos intracelulares en tampón de permeabilización para una incubación de 30 minutos en la oscuridad, seguida de otro lavado con tampón de permeabilización. A continuación, se lavan de nuevo las células con tampón FACS y se vuelven a suspender las muestras en 300 microlitros de tampón FACS fresco para su análisis por citometría de flujo. La digestión tumoral, como se ha demostrado, con o sin enriquecimiento del medio en gradiente de densidad, da como resultado una población de células tumorales completas viables de aproximadamente el 70 % según lo evaluado por citometría de flujo.

El enriquecimiento del medio con gradiente de densidad promueve un aumento de más del doble en la fracción de leucocitos infiltrantes tumorales CD45 positivos, en comparación con las digestiones tumorales no enriquecidas, así como en numerosos subconjuntos de células inmunitarias que se observan comúnmente en los estudios de microambiente inmunitario. La fracción de células tumorales CD45 negativas también se puede perfilar para numerosas características tumorales, como la viabilidad o apoptosis general del tumor, la capacidad de proliferación y la expresión de varios marcadores inmunosupresores. Para determinar cómo varían los subconjuntos inmunológicos de mieloides y linfocitos a lo largo de un solo tumor sólido, el tumor se puede dividir en cuatro partes iguales de tal manera que cada sección contenga regiones intratumorales aproximadamente iguales, así como porciones dérmicas y peritoneales iguales.

A continuación, cada pieza puede digerirse por separado y analizarse, como se ha demostrado, para detectar la presencia de varias poblaciones de células inmunitarias. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en cuatro a 8 horas, dependiendo de la cantidad de muestras que tenga. Al intentar este procedimiento, es importante trabajar de manera rápida pero eficiente para preservar la viabilidad celular.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de disociación y separación implican técnicas que son difíciles de aprender solo con texto escrito. Después de este procedimiento, se puede realizar una citometría de flujo para responder preguntas adicionales sobre cómo cambian las poblaciones celulares dentro de un tumor, tanto en términos de abundancia como de fenotipo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo separar y analizar los componentes inmunitarios y no inmunitarios de un tumor murino subcutáneo establecido utilizando las técnicas demostradas de digestión y separación por gradiente de densidad.