Supresión de la señalización Pro-fibróticos potencia Factor-mediada la reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón en cardiomiocitos inducida

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la reprogramación cardíaca, como la identificación de las vías que promueven o reparan la cardiomiogénesis. La principal ventaja de esta técnica, es que podemos generar cardiomiocitos inducidos funcionalmente, con mayor eficiencia que los métodos publicados anteriormente. Estas cardiopatías químicas provocan la pérdida de cardiomiocitos y el deterioro de la función cardíaca.

Por lo tanto, esta técnica puede ayudar en una alta reparación, al convertir los fibroblastos en cardiomiocitos inducidos funcionalmente. Para comenzar la producción de retrovirus, cultive células de platino E o PE en medio PE. Compleméntelo con marcadores de selección en un plato de 10 cm, en un armario de bioseguridad de nivel dos.

Cada dos días pasan las celdas, de una a cuatro, o de una a la quinta dilusion. Un día antes de la transfección planificada, siembre las células de PE en 10 ml de medio de crecimiento, en una placa de cultivo de 10 cm, y luego mueva suavemente las placas de un lado a otro. Coloque con cuidado los platos en una incubadora, para permitir una distribución uniforme de las células, e incube durante 24 horas.

El día de la transfección, añadir el cóctel GHMT2M, en un tubo de 1,5 ML. A continuación, agregue 360 microlitros de medio sérico reducido a un tubo separado de 1,5 ml. A continuación, añada 36 microlitros de reactivo de transfección al medio sérico reducido y agite suavemente el tubo para mezclar.

Incuba a temperatura ambiente durante cinco minutos. El reactivo de transfección utilizado en este paso se une al plástico. Para evitar la eficacia de la transfección, tenga cuidado de pipetear el reactivo de transfección, directamente en el medio sérico reducido, y evite tocar la pared del tubo con la punta de la pipeta.

A continuación, añada al tubo la mezcla reducida de reactivos de transfección de medios séricos que contiene el cóctel de ADN GHMT2M. Agite suavemente el tubo para mezclar e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. Finalmente, agregue la mezcla de reacción de transfección gota a gota a las células de PE.

Agite suavemente el plato durante 10 a 15 segundos. Incubar las células transfectadas a 37 grados centígrados, durante 16 a 20 horas. Ahora cubra platos de 60 mm con colágeno e incube a 37 grados centígrados, durante un mínimo de dos horas.

A continuación, dispense fibroblastos embrionarios de ratón recién descongelados, o MEF, en los platos recubiertos de colágeno. Y agregue el medio de crecimiento en un volumen final, de 4 ML por plato de 60 MM. Meca suavemente los platos y colóquelos en la incubadora.

Al enchapar MEF, es importante que las celdas se siembren de manera uniforme. Evite agitar los platos, esto puede causar un emplatado desigual. En su lugar, mueva suavemente el plato hacia adelante y hacia atrás y colóquelo con cuidado en la incubadora.

24 horas después de la transfección de células PE, use una jeringa de 30 ML para recolectar el medio retroviral generado por las células. Pase la primera recolección de medio retroviral a través de un filtro de tamaño de vertido de 45 micrómetros, en un tubo cónico de 50 ML. A continuación, añada 10 ml de medio de crecimiento fresco en la pared de la placa, teniendo cuidado de no desplazar las células de PE.

Incuba las células a 37 grados centígrados durante otras 24 horas. A continuación, agregue 7,2 microlitros de 10 mg por mililitro de reactivo de transducción de bromuro de metrina de hexidina al tubo cónico de 50 ml que contiene el sobrenadante viral. Ahora aspire el medio de los MEF y agregue 4 ML del medio retroviral recién cosechado al plato.

Incubar las células a 37 grados centígrados durante 24 horas, 48 horas después de la transfección de las células PE, recolectar el medio retroviral y realizar la transducción exactamente de la misma manera que para la primera recolección. Deseche las células PE después de la segunda recolección de medio retroviral y agregue un 10% de lejía a todos los materiales en contacto con el medio retroviral.

Después de la incubación, aspire el medio retroviral de los MEF y agregue 4 ML de medio ICM, que contiene 05 micromolares, inhibidor del receptor TGF Beta Tipo 1. Cada dos días cambie el medio ICM, hasta que se vuelva a usar. Para comenzar la inmunotinción, aspire el medio ICM del día 14 MEFs reprogramados.

A continuación, lave las células una vez con 1 ml de PBS helado 1X, por pocillo de la placa de 12 pocillos. A continuación, aspire el PBS, agregue 500 microlitros de paraformaldehído al 2% para fijar las células e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de aspirar el paraformaldehído, lavar las células tres veces con 1 ml de PBS.

Después de aspirar el PBS, agregue 500 microlitros de 02%Triton X 100 e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de la aspiración de Triton X 100, bloquee las células con 500 microlitros de suero de caballo al 10%, durante 30 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, aspire el suero de caballo y agregue 500 microlitros de anticuerpo primario diluido. Incubar durante una hora a temperatura ambiente. Después de aspirar el anticuerpo primario, lavar tres veces con 1 ml de PBS.

Después del último lavado de PBS, agregue 500 microlitros de anticuerpo secundario diluido. Envuelva el plato en papel de aluminio e incube en la oscuridad, durante una hora a temperatura ambiente. Por último, aspirar el anticuerpo secundario y lavar tres veces con 1ML de PBS.

Envuelva el plato en papel de aluminio y guárdelo a cuatro grados centígrados hasta que se termine la imagen. Este método muestra una conversión de alta eficiencia de MEFs en cardiomiocitos. Un análisis representativo de citometría de flujo, añadido al noveno día después de la transducción, muestra la expresión de troponina T cardíaca activada, en aproximadamente el 70% de las células.

Del mismo modo, la expresión cardíaca de alfa-actinina se observa en aproximadamente el 55% de las células, en comparación con el control de transducción de GFP. Además, la inmunotinción de marcadores cardíacos, realizada dos semanas después de la transducción, muestra que la mayoría de las células expresan troponina I, alfa-actinina y troponina T. La proteína de unión gap Cx43 también se detectó a lo largo de la periferia de los ICM. Además, el co-marcaje de ICMs con alfa-actinina, o troponina T y Cx43, revela formaciones de uniones gap entre células vecinas.

La transducción de GHMT2M y el tratamiento con A83O1 reprograman una fracción de MEFs para convertirlas en células batientes al octavo día. En el día 11, se observan aproximadamente 10000 células batientes por centímetro cuadrado. Los transitorios espontáneos de calcio se detectan en los cardiomiocitos latentes.

La adición de isoproterenol, agonista beta adrenérgico, aumenta significativamente la frecuencia de transitorios espontáneos de calcio. Por el contrario, la sedición del bloqueador de los canales de calcio tipo L, nifedipino, disminuye significativamente la frecuencia de transitorios de calcio. Después de ver este video, uno debería tener una buena comprensión de cómo reprogramar fibroblastos en cardiomiocitos funcionales inducidos con alta eficiencia.

Siguiendo este protocolo, se pueden utilizar otros métodos, como la secuenciación de ARN y la secuenciación de chips, para responder a preguntas adicionales, como la expresión génica global y el estado de la cromatina, que se alteran durante la reprogramación cardíaca. No olvide que trabajar con retrovirus puede ser peligroso. Siempre se deben implementar precauciones, como trabajar en un gabinete de bioseguridad de nivel dos de seguridad, usar equipo de protección personal y eliminar adecuadamente todos los desechos retrovirales mientras se realiza este protocolo.