Name: Microscopía de localización de varios colores solo de proteínas de membrana en organelos de células mamíferas vivas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Aprende a localizar proteínas de membrana en células mamíferas vivas mediante microscopía multicolor de molécula única. Este método de autoetiquetado alcanza ~18 nm de resolución para estudiar dinámica proteica en organelos.

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Los autores desean agradecer al grupo de Biofísica y Jacob Piehler en la Universidad de Osnabrück para apoyo continuo, Wladislaw Kohl para asistencia técnica y preparación del material y la Junta de CellNanOs para proporcionar microscopios para uso. El proyecto fue financiado por el SFB 944.

<ol><li>Appelhans, T., Richter, C., Wilkens, V., Hess, S., Piehler, J., Busch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+organization+of+mitochondrial+microcompartments+revealed+by+combining+tracking+and+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Nanoscale organization of mitochondrial microcompartments revealed by combining tracking and localization microscopy.</a> Nano Letters. 12 (2), 610-616 (2012).</li>
<li>Appelhans, T., Busch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Tracking+and+Localization+of+Mitochondrial+Protein+Complexes+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Tracking and Localization of Mitochondrial Protein Complexes in Live Cells.</a> Methods Mol Biol. 1567, 273-291 (2017).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biological+structures+with+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Nat Protoc. 4 (3), 291-308 (2009).</li>
<li>Pennacchietti, F., Gould, T. J., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Probe+Photophysics+in+Localization-Based+Superresolution+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The Role of Probe Photophysics in Localization-Based Superresolution Microscopy.</a> Biophys J. 113 (9), 2037-2054 (2017).</li>
<li>Wegel, E., Göhler, A., Lagerholm, B. C., Wainman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM%2C+STED+and+Localisation+Microscopy%3A+A+practical+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific reports. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/srep27290?WT.feed_name=subjects_physical-sciences ">https://www.nature.com/articles/srep27290?WT.feed_name=subjects_physical-sciences </a> (2016).</li>
<li>Pellett, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+STED+microscopy+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Two-color STED microscopy in living cells.</a> Biomedical Optics Express. 2 (8), (2011).</li>
<li>Ishigaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+super-resolution+imaging+of+mitochondria+labeled+with+TMRM+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells.</a> Mitochondrion. 28, 79(2016).</li>
<li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy%2C+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740(2015).</li>
<li>Sergé, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+multiple-target+tracing+to+probe+spatiotemporal+cartography+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.</a> Nat Methods. 5 (8), (2008).</li>
<li>Appelhans, T., Busch, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+mitochondrial+membrane+proteins+in+specific+sub-organelle+membrane+locations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+reviews%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of mitochondrial membrane proteins in specific sub-organelle membrane locations.</a> Biophysical reviews. 9 (4), 345-352 (2017).</li>
<li>Wilmes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple-color+super-resolution+imaging+of+live+cells%3A+resolving+submicroscopic+receptor+organization+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Triple-color super-resolution imaging of live cells: resolving submicroscopic receptor organization in the plasma membrane.</a> Angewandte Chemie. 51 (20), 4868-4871 (2012).</li>
<li>Niewidok, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+reveals+dynamic+biphasic+partition+of+RNA-binding+proteins+in+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging reveals dynamic biphasic partition of RNA-binding proteins in stress granules.</a> J Cell Biol. , (2018).</li>
<li>Wurm, C. A., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+protein+distributions+define+two+sub-compartments+of+the+mitochondrial+inner+membrane+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Differential protein distributions define two sub-compartments of the mitochondrial inner membrane in yeast.</a> FEBS Lett. 580 (24), 5628-5634 (2006).</li>
<li>Schmidt, R., Wurm, C. A., Punge, A., Egner, A., Jakobs, S., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+cristae+revealed+with+focused+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial cristae revealed with focused light.</a> Nano Lett. 9 (6), 2508-2510 (2009).</li>
<li>Kukat, C., Wurm, C. A., Spahr, H., Falkenberg, M., Larsson, N. G., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+reveals+that+mammalian+mitochondrial+nucleoids+have+a+uniform+size+and+frequently+contain+a+single+copy+of+mtDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).</li>
<li>Beinlich, F., Drees, C., Piehler, J., Busch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shuttling+of+PINK1+between+Mitochondrial+Microcompartments+Resolved+by+Triple-Color+Superresolution+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Shuttling of PINK1 between Mitochondrial Microcompartments Resolved by Triple-Color Superresolution Microscopy.</a> ACS chemical biology. 10 (9), 1970-1976 (2015).</li>
<li>Shim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li>
<li>Sbalzarini, I., Mezzacasa, A., Helenius, A., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Organelle+Shape+on+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effects of Organelle Shape on Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Biophysical Journal. 89 (3), 1482-1492 (2005).</li>
<li>Reits, E., Neefjes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+fixed+to+FRAP%3A+measuring+protein+mobility+and+activity+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells.</a> Nature Cell Biology. 3 (6), E145-E147 (2001).</li>
<li>Goehring, N., Chowdhury, D., Hyman, A., Grill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+Analysis+of+Membrane-Associated+Proteins%3A+Lateral+Diffusion+and+Membrane-Cytoplasmic+Exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">FRAP Analysis of Membrane-Associated Proteins: Lateral Diffusion and Membrane-Cytoplasmic Exchange.</a> Biophysical Journal. 99 (8), 2443-2452 (2010).</li>
<li>Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2014 (7), 709-725 (2014).</li>
<li>Sukhorukov, V., Dikov, D., Busch, K., Strecker, V., Wittig, I., Bereiter-Hahn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+protein+mobility+in+mitochondrial+membranes+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Determination of protein mobility in mitochondrial membranes of living cells.</a> Biochimica et biophysica acta. 1798 (11), 2022-2032 (2010).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Graham, F. L., van der Eb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+the+assay+of+infectivity+of+human+adenovirus+5+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA.</a> Virology. 52 (2), 456-467 (1973).</li>
<li>Wedeking, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+Controlled+Reorganization+of+Signaling+Complexes+in+the+Plasma+Membrane+of+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally Controlled Reorganization of Signaling Complexes in the Plasma Membrane of Living Cells.</a> Small. 11 (44), 5912-5918 (2015).</li>
<li>Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BCa2%2B%5Di+signaling+between+mitochondria+and+endoplasmic+reticulum+in+neurons+is+regulated+by+microtubules.+From+mitochondrial+permeability+transition+pore+to+Ca2%2B-induced+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">[Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release.</a> J Biol Chem. 280 (1), 715-721 (2005).</li>
<li>Poot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+morphology+and+function+with+novel+fixable+fluorescent+stains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains.</a> J Histochem Cytochem. 44 (12), 1363-1372 (1996).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nmeth1171">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells (vol 5, pg 159).</a> Nature Methods. 5 (5), 455(2008).</li>
<li>Elmokadem, A., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+Drift+Correction+for+Superresolution+Localization+Microscopy+with+Bayesian+Inference%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Optimal Drift Correction for Superresolution Localization Microscopy with Bayesian Inference.</a> Biophys J. 109 (9), 1772-1780 (2015).</li>
<li>Barlag, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+super-resolution+imaging+of+proteins+in+living+Salmonella+enterica+using+self-labelling+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Single molecule super-resolution imaging of proteins in living Salmonella enterica using self-labelling enzymes.</a> Sci Rep. 6, 31601(2016).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li>
<li>Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+localization+analysis+for+single-molecule+tracking+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy.</a> Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).</li>
<li>Jin, S., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-+and+Parkin-Mediated+Mitophagy+at+a+Glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">PINK1- and Parkin-Mediated Mitophagy at a Glance.</a> Journal of Cell Science. 125, 795-799 (2013).</li>
<li>Yamano, K., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1+is+degraded+through+the+N-end+rule+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">PINK1 is degraded through the N-end rule pathway.</a> Autophagy. 9 (11), 1758-1758 (2013).</li>
<li>Wiedemann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machinery+for+protein+sorting+and+assembly+in+the+mitochondrial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Machinery for protein sorting and assembly in the mitochondrial outer membrane.</a> Nature. 424 (6948), 565-571 (2003).</li>
<li>Thompson, R., Larson, D., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, se presentó una técnica para la localización de la sola molécula bicolor de proteínas de membrana móvil. Tras el protocolo, proteínas de membrana están fusionadas a auto etiquetado de proteínas que reaccionan con los tintes del rhodamine TMR y SiR conjugado con sus respectivos sustratos. Rodamina tintes son brillante y Fotoestables y así permitir repetitiva imagen1. Para un rendimiento exitoso, varias condiciones y temas críticos tienen que ser tenidas en cuenta.
...

El objetivo de este protocolo es proporcionar un método de imagen para localizar y rastrear las proteínas de membrana solo dentro de células vivas. Llamamos a este método de seguimiento y localización de la microscopia (TALM)1,2. Como microscopia de reconstrucción óptica estocástica (tormenta)3 y microscopía de fluorescencia fotoactivación localización ((F) PALM)4,5, TALM es una técnica de localización de fluorescencia basada en la molécula sola. Sin embargo, es distinta de la manera que la movilidad de las proteínas de la membrana en combinación con imágenes repetitivas de la misma etiqueta molécula en diversas posiciones revela el microcompartment que es accesible para la proteína móvil. En otras palabras, las localizaciones posibles de la proteína se encuentran en la arquitectura de las organelas y por la movilidad de la proteína1. El método es complementario a varios otros súper resolución técnicas6,7,8 porque revela la trayectoria y localización mapas por proyección de imagen móvil proteínas. El etiquetado se basa en el uso de proteínas de fusión genéticamente que son fluorescentes por sí no. Estas proteínas de fusión son auto etiquetado enzimas que reaccionan covalentemente con un substrato conjugado a un tinte. Este procedimiento tiene la ventaja de que el grado del etiquetado puede ser controlado por la cantidad de sustrato añadido. Además, permite variar el color de la fluorescencia, dependiendo del tinte conjugado solicitada. Varios auto etiquetados enzima-tags están disponibles9. Otra ventaja de usar auto etiquetado enzima etiquetas es, que los tintes conjugados suelen ser más estables y más brillante de proteínas fluorescentes1 y proteínas individuales por lo tanto se pueden grabar más y más precisamente hasta que se blanquean. Esto permite la grabación de las trayectorias de proteínas móviles y la extracción de coeficientes de difusión10,11.
Aquí, demostramos la factibilidad de TALM con proteínas de la membrana mitocondrial, pero también puede ser aplicado para otras proteínas de membrana cellular intra y extraurbano, incluyendo células diferentes tipos12,13. Mostramos que TALM multicolor más permite la distinción simultánea de proteínas en diferentes subcompartimientos en complementación a los súper resolución fluorescencia microscopía técnicas14,15, 16. TALM es compatible con celular directo imágenes17. La física de la foto del elegido rhodamines Tetramethylrhodamine (TMR) y silicio-Rhodamien (SiR), en particular su brillo y su estabilidad, permite a las proteínas de membrana único registro varios fotogramas proporcionar mapas de trayectoria (y localización). Sin embargo, TALM está limitada para la localización de proteínas solubles con coeficientes de difusión alta puesto que el desenfoque de movimiento es demasiado alto y los fotones recogidos por frame son demasiado bajos para la localización correcta. Además, TALM requiere menos energía de la excitación que por ejemplo tormenta o agotamiento estimulado de emisión (STED) microscopía6,7, reduciendo efectos phototoxic. Esto es importante, puesto que estrés fototóxico a menudo afecta la morfología organellar18 y así movilidad análisis19. En suma, presentamos varios color TALM en células vivas como una técnica que llena un vacío entre los métodos de microscopía de localización tormenta/STED/Palma (F) y las técnicas que analizan la movilidad de la proteína tales como recuperación de fluorescencia Tras Fotoblanqueo (FRAP)20 ,21, correlación de fluorescencia (FCS) la espectroscopia22y fluorescencia cross correlación espectroscopia (FCCS)11,23.

<table><tbody><tr><td>(Ácido 2-(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil)-etanosulfónico, 1 M) (HEPES)</td><td>Biochrom</td><td>#1104E</td><td></td></tr><tr><td>DC1: Divisor de haz dicroide&nbsp;</td><td>Chroma</td><td>640 dcxr</td><td>NC506031</td></tr><tr><td>DC2: Espejo policromico, divisor de haz</td><td>Chroma</td><td>zt405/488/561/640rpc</td><td>descatalogado</td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x (sin Ca & Mg)</td><td>Sigma-Aldrich & Co.</td><td></td><td></td>#RNBF8311</tr><tr><td>Earle&agudo; s MEM sin rojo fenol, sin L-Glutamina y sin NaHCO3 que contiene 1% de FBS, 0,1% de HEPES, 0,1% de NEAA, 0,1% de Alanil-L-Glutamina y 34,78% de hidrogenocarbonato de sodio (NaHCO3 0,75 g/l)</td><td></td><td></td><td>Medio de imagen</td></tr><tr><td>Earle&acute; medio esencial mínimo (MEM) con rojo fenol, que contiene 1% de suero fetal bovino superior (FBS), 0,1% de HEPES (ácido 2-(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil)-etanosulfónico, 1 M) y 0,1% de aminoácidos no esenciales (NEAA)</td><td></td><td></td><td>Medio de crecimiento</td></tr><tr><td>EF: Filtro de emisión quadbandpass</td><td>AHF analysentechnik</td><td>F72-866</td><td>Brightline HC Cámara EMCCD 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm</td></tr><tr><td></td><td>Andor</td><td>Andor Cámara EMCCD iXON 897</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de emisión Cubos de filtro QuadView, naranja</td><td>AHF analysentechnik</td><td>F39-637</td><td>paso de banda 582 - 619 nm</td></tr><tr><td>Filtro de emisión Cubos de filtro QuadView, rojo</td><td>Paso de banda Chroma</td><td></td><td>655 - 725 nm (HQ 690/70)</td></tr><tr><td>FBS (Suero bovino fetal) superior</td><td>Biochrom</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>Perlas fluorescentes: TetraSpeck&trade; Microesferas, 0,1 y micro; m, azul fluorescente/verde/naranja/rojo oscuro</td><td>Microesferas fluorescentes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T7279</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Biochrom</td><td>#0951C</td><td></td></tr><tr><td>células HeLa&nbsp;</td><td>DSMZ</td><td>ACC-57</td><td>Células de carcinoma cervical de la paciente Henrietta Lacks</td></tr><tr><td>Células Hela CI::p aGFP, estables</td><td>Muster et al., PLOSOne 2010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células Hela CV g::Halo7-Tag, estables</td><td>Appelhans et al., NanoLett 2012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células Hela Tom20::Halo7-Tag,</td><td>estables Appelhans et al., NanoLett 2012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Divisor de imagen</td><td>Fotometría</td><td>Dual-View Emisión</td><td>del divisor de imágenes</td>QV2</tr><tr><td>Software de procesamiento de imágenes&nbsp;</td><td>ImageJ2 / Fiji</td><td>freeware</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de inmersión - ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45)</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td>444960-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de epifluorescencia invertida</td><td>Olympus IX-71/73/83</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Láser 561 nm, 200 mW</td><td>CrystaLaser</td><td>CL-561-200</td><td>Emisión de 561 nm</td></tr><tr><td>Láser 642 nm, 140 mW</td><td>Omicron</td><td>Luxx-642-140 Emisión de</td><td>642 nm</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>versión R2013a</td><td></td></tr><tr><td>MEM con solución salina equilibrada de Earle's 2,2 g/L de NaHCO3, glutamina estable sin PR</td><td>Biochrom</td><td>FG-0385</td><td></td></tr><tr><td>MEM con solución salina equilibrada de Earle con NaHCO3 de 2,2 g/L, glutamina estable,</td><td>Biochrom</td><td>fenolado FG-0325</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker&reg; Tinte Deep Red FM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M22426</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker&reg; Colorante verde FM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M7514</td><td></td></tr><tr><td>Polarización óptica multimodo que mantiene la fibra monomodo</td><td>Pointsource/Qioptiq</td><td></td><td>KineFLEX</td></tr><tr><td>NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer&nbsp;</td><td>Rapp Polymere GmbH T&uuml; Recubrimiento</td> de <td>cubreobjetos</td>Bingen <td></td></tr><tr><td>aminoácidos no esenciales (NEAA)Biochrom</td><td></td><td>#0802E</td><td></td></tr><tr><td>PEG 800 (Polietilenglicol) 10 %</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>Art No. 0263.1</td><td>recubrimiento de cubreobjetos</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Biochrom</td><td>#0122E</td><td></td></tr><tr><td>Plásmido para la expresión de PINK1-Halo7-Tag</td><td>Beinlich et al., ACS Chemical Biology 2015</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina (1,2 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich & Co.</td><td>gato. No.P9155</td><td>recubrimiento de cubreobjetos</td></tr><tr><td>RGD Péptido (Ac-CGRGDS-COOH)</td><td>Sistema de extracción de muestras Diagnostix GmbH, recubrimiento</td> de cubreobjetos Gernsheim <td></td><td>/ Motivo del receptor Intergrin</td></tr><tr><td>Rodamina de silicio unido a HaloTag&reg;-Ligando (SiRHTL)&nbsp;</td><td>regalo personal de Kai Johnson</td><td></td><td>dye</td></tr><tr><td>Complemento de análisis</td><td>de software escrito por C. P. Richter, Biophysik Osnabr&uuml; ck</td><td>SLIMFAST 16g</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametilrodamina / SNAP-Cell&reg; TMR-Star vinculado a SNAP-Ligando (TMRstar)&nbsp;</td><td>Biolab de Nueva Inglaterra &reg;</td><td>Colorante S9105S</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametilrodamina unida al ligando HaloTag&reg;-(TMRHTL)&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G8251</td><td>colorante</td></tr><tr><td>Condensador TIRF</td><td>Olympus</td><td>Cell^TIRF Sistema MITICO</td><td>Condensador</td></tr><tr><td>TIRF software de control de microscopio</td><td>TIRF Olympus cellSens 1.12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objetivo TIRF</td><td>Olympus</td><td>150x objetivo de aceite (N.A. 1.45; Olympus UAPO)</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA 10x</td><td>Biochrom</td><td>#0266</td><td></td></tr><tr><td>Agua H2O 99,5 % Rotipuran&reg; Bajo en orgánico&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>Art. No. HN57.1</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopía de localización de varios colores solo de proteínas de membrana en organelos de células mamíferas vivas

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

Conocimiento sobre la localización de proteínas en subcompartimientos celulares es crucial para entender su función específica. Aquí, presentamos una técnica de súper-resolución que permite la determinación de la microcompartments que son accesibles para las proteínas generando localización y seguimiento de los mapas de estas proteínas. Por otra parte, por microscopia de la localización de varios colores, la localización y seguimiento de perfiles de proteínas en subcompartimientos diferentes se obtienen simultáneamente. La técnica es específica para las células vivas y se basa en la proyección de imagen repetitiva de proteínas de membrana móvil único. Proteínas de interés son genéticamente fusionadas con etiquetas auto etiquetados específicos, supuestos. Estas etiquetas son enzimas que reaccionan con el sustrato de manera covalente. Conjugado a estos sustratos son tintes fluorescentes. Reacción de las proteínas de la enzima etiquetada con la fluorescencia etiquetada resultados de sustratos en proteínas etiquetadas. Aquí, Tetramethylrhodamine (TMR) y silicio rodamina (SiR) se utilizan como tintes fluorescentes a los sustratos de las enzimas. Usando las concentraciones de sustrato en la pM a rango nM, etiquetado sub-estequiométrica se consigue que se traduce en señales distintas. Estas señales se localizan con ~ 15 – 27 precisión nm. La técnica permite la proyección de imagen de varios color de moléculas individuales, por el que el número de colores es limitado por los tintes disponibles permeable a la membrana y el repertorio de auto etiquetado de las enzimas. Mostramos la viabilidad de la técnica en la determinación de la localización de la enzima de control de calidad (Pten)-inducida quinasa 1 (PINK1) en diferentes compartimentos mitocondriales durante su proceso en relación con otras proteínas de membrana. La prueba verdadera interacciones físicas entre proteínas diferentemente marcadas solo por sola molécula traste o seguimiento Co es restringida, sin embargo, debido a los bajos grados de etiquetado disminuyen la probabilidad de tener dos proteínas adyacentes con la etiqueta al mismo tiempo. Mientras que la técnica es fuerte para las proteínas en los compartimientos de la membrana de la proyección de imagen, en la mayoría de los casos no es apropiado determinar la localización de proteínas solubles altamente móviles.

Análisis de la proyección de imagen y colocalización multicolor puede ayudar a determinar la localización sub-organellar de proteínas. Hemos demostrado esto antes con el citosol fosfatasa y tensina homólogo, PINK1, que tiene diferentes lugares sub-mitocondrial debido a su procesamiento por las proteasas mitocondrial17. PINK1 es un factor importante que garantiza la funcionalidad mitocondrial34,35. Para dete...

Aquí, presentamos un protocolo para la localización de varios color de proteínas de membrana único en organelos de células vivas. Para colocar fluoróforos, se usan proteínas auto etiquetadas. Proteínas, situadas en compartimientos diferentes membranas de la mismo orgánulo, se pueden localizar con una precisión de ~ 18 nm.

Microscopía de localización de varios colores solo de proteínas de membrana en organelos de células mamíferas vivas

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a ...

Esta técnica puede responder a preguntas clave en los procesos de regulación, como el papel que juegan la dinámica y la organización de las proteínas en la adaptación funcional. La principal ventaja de esta técnica es que se puede realizar en células vivas, revelando así la dinámica de las proteínas a nivel de una sola molécula. Aunque este método se implementó originalmente para proporcionar información sobre la organización espacio-temporal de las proteínas de la membrana mitocondrial, también se puede aplicar a otros orgánulos y otras proteínas de la membrana.La demostración de la técnica estará a cargo de Timo Appelhans, un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Después de transfectar y preparar las muestras de células y el microscopio de acuerdo con el protocolo de texto, monte la muestra preparada con perlas fluorescentes en el portamuestras entre el anillo de PTFE y el anillo de goma roja. Encienda el microscopio, todos los componentes de hardware y todo el software necesario para la microscopía.Use un pañuelo de papel nuevo y sin pelusa rociado con isopropanol para limpiar la lente del objetivo y la parte inferior del cubreobjetos. A continuación, coloque una gota de aceite de inmersión en la pupila de la lente del objetivo. A continuación, coloque el portamuestras con la muestra de perlas en la platina del microscopio de modo que la parte inferior del cubreobjetos entre en contacto con el aceite.A continuación, concéntrese en las cuentas mediante el uso de luz de transmisión o una línea láser. Ajuste la potencia de los dos láseres de excitación para lograr una densidad de señal similar en los dos canales de fluorescencia. Luego busque un área con muchas señales fluorescentes distintas.Genere una vista combinada de los canales fluorescentes mediante el software de control de la cámara. A continuación, utilice los tornillos del divisor de imagen para inclinar manualmente el divisor de imagen óptico interno para lograr la mejor superposición de las señales de los dos canales fluorescentes. Inicie el software de control de microscopio TIRF y elija mostrar canales individuales en el modo de transmisión en vivo.Tome una imagen instantánea, excitando fluorescentes en todos los canales. A continuación, utilice esta imagen para producir la matriz de transformación. Inicie el complemento de análisis de software y cargue las imágenes de doble color previamente grabadas de perlas fluorescentes en el software.Elija la orientación utilizada de los canales fluorescentes. Haga clic en Sí cuando se le solicite calibrar imágenes y seleccione la instantánea tomada anteriormente. Abra el administrador de unidades para definir los factores de conversión de unidades y, a continuación, abra el administrador de localización.Para determinar la función de dispersión de puntos, o PSF, presione el botón PSF Radius. En la ventana Estimador de PSF que se abre, defina la apertura numérica y el máximo de emisión. A continuación, haga clic en Estimar radio de PSF.A continuación, acepte el PSF experimental obtenido. Defina el cuadro de evaluación, el número de bucles de deflación y cuántos núcleos de la computadora se utilizan para el cálculo. A continuación, pulse Localizar para empezar a ajustar la distribución de intensidad de las partículas individuales, utilizando una función gaussiana simétrica 2D.Abra el administrador de calibración. En la imagen renderizada y fusionada de los dos canales, se mostrará la señal original y los centros localizados. Elija el modo afín.A continuación, conecte manualmente los pares correspondientes de centros localizados en los dos canales, que se han originado en la misma perla fluorescente, dibujando una línea de conexión. Conecte las señales correspondientes distribuidas en el campo de visión. A continuación, pulse Aceptar y guarde la matriz de transformación.Para llevar a cabo imágenes moleculares individuales de las proteínas de la membrana mitocondrial, monte el deslizamiento de la cubierta de la muestra entre los anillos de goma y PTFE. A continuación, llene la cámara con 0,5 a 0,8 mililitros de medio de imagen. Limpie la lente del objetivo y la parte inferior de la cubierta.A continuación, utilice la luz de transmisión o una línea láser para enfocar las células, después de añadir una gota de aceite a la lente. A continuación, ajuste la potencia de los dos láseres de excitación para lograr una intensidad similar y busque una zona con muchas señales fluorescentes. Ajuste el ángulo de iluminación en el software de control de microscopio TIRF para crear un ángulo de incidencia que sea más pequeño que el ángulo crítico, o el modo TIR, para excitar la región específica de interés a través de una hoja HILO.La adaptación de la iluminación del microscopio TIRF para excitar orgánulos celulares utilizando la iluminación HILO requiere un juicio rápido de la relación señal-fondo y experiencia en microscopía TIRF, así como un conocimiento de la morfología celular. Establezca la ganancia EM y elija un tiempo de exposición adecuado para el experimento que recoja suficientes fotones por fotograma. A continuación, ajuste la potencia del láser para lograr una alta relación señal-ruido, ya que esta relación corresponde directamente a la precisión de la localización.Encuentre un área en la periferia celular con mitocondrias alargadas que no se superponen y señales de una sola molécula. Si no hay señales individuales visibles en uno o ambos canales, espere hasta que el blanqueo dé como resultado la aparición de señales de una sola molécula. En el caso de que solo sea necesario blanquear un canal, apague el láser del otro canal, para evitar el blanqueo, antes de grabar este canal.Grabe hasta que el número de señales sea demasiado bajo para una continuación razonable. Inicie el software de procesamiento de imágenes y compruebe las estructuras mitocondriales generando una imagen de suma renderizada acumulativa de al menos 1.000 fotogramas grabados. Inicie el complemento de análisis de software.Para llevar a cabo el procesamiento de datos para la localización y el seguimiento, cargue los datos sin procesar. Cuadros multicolor. Elija la orientación correcta de ambos canales.Cuando se le solicite Calibrar imágenes, cargue la matriz de transformación. Los canales se mostrarán por separado. Abra los datos sin procesar del contenedor de imágenes haciendo clic en Mostrar.A continuación, abra el administrador de unidades en la pestaña superior y defina los factores de conversión de unidades en cada canal. Abra el administrador de localización en la pestaña superior y defina el cuadro de evaluación y el número de bucles de deflación. Haga clic en Radio PSF para abrir el estimador PSF.Establezca la apertura numérica y el máximo de emisión para obtener el valor PSF teórico. Presione Aceptar. Repita esto para todos los canales.A continuación, pulse Localizar para iniciar la localización de una sola partícula para las señales grabadas en ambos canales. Espere a que finalice el software. Ahora, se obtiene una imagen super-resuelta para cada canal en el contenedor de imágenes del plugin de análisis de software.PINK1 es un factor importante que garantiza la funcionalidad mitocondrial. Para determinar la localización de PINK1 en relación con Tom20 en mitocondrias funcionales y disfuncionales, se registró una serie temporal de 1.000 fotogramas. La imagen acumulativa de todas las señales a lo largo del tiempo de un canal mostró que PINK1 se localizaba en el citosol, en la membrana externa y dentro de las mitocondrias en condiciones normales, pero preferentemente en la membrana externa de las mitocondrias despolarizadas.Como muestran las imágenes sumadas de las partículas localizadas, PINK1 se distribuye principalmente dentro de las mitocondrias polarizadas, mientras que Tom20 se localiza en la membrana mitocondrial externa. Esto se vuelve aún más claro en la imagen combinada de las partículas localizadas Tom20 y PINK1, lo que muestra que la distribución de la proteína de membrana externa Tom20 es mucho más amplia. Para verificar la localización de PINK1 dentro de las mitocondrias, la subunidad de 30 kilodalton del complejo respiratorio uno se fusionó con GFP fotoactivable y se registró mediante microscopía de localización de fotoactivación de fluorescencia.La imagen acumulativa de triple color y la distribución de la sección transversal muestran la superposición de complejo uno y PINK1, lo que confirma la importación de PINK1 de cuerpo entero. Estos datos demuestran que las subpoblaciones de PINK1 ocupan varios microcompartimentos mitocondriales. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 20 horas, incluido el registro y el posprocesamiento de los datos, si se hace correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar probar el movimiento de los orgánulos. Siguiendo este procedimiento, se puede determinar la localización relativa de las proteínas. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del seguimiento de una sola partícula de proteínas mitocondriales observaran su comportamiento en Z2 y diferentes condiciones metabólicas, y bajo estrés.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la microscopía de doble columna de proteínas mitocondriales para revelar su posición y tráfico de suborgánulos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Time-lapse microscopía de marcadores autofagia marcados con fluorescencia permite la monitorización de la respuesta de la autofagia dinámico con alta resolución temporal. Usando la autofagia específico y los marcadores de orgánulos en una combinación de 3 colores diferentes, podemos seguir la aportación de una proteína a la formación autophagosome en un contexto espacial y temporal robusto.

Imágenes de células vivas de las primeras autofagia Eventos: Omegasomes y más allá

Demostramos el uso de la microscopía de localización por fotoactivación de fluorescencia (FPALM) para obtener imágenes simultáneas de múltiples tipos de moléculas marcadas con fluorescencia dentro de las células. Las técnicas descritas producen la localización de miles a cientos de miles de proteínas individuales marcadas con fluorescentes, con una precisión de decenas de nanómetros dentro de células individuales.

Imágenes Multicolor Simultáneas de Estructuras Biológicas con Microscopía de Localización de Fotoactivación de Fluorescencia

Aquí, presentamos un protocolo para realizar un análisis cuantitativo del nivel de Asociación de la membrana plasmática para fluorescencia etiquetada periférica asociada a proteina. El método se basa en la descomposición computacional de membrana y citoplasmático componente de señal observado en células con marcador fluorescente membrana plasmática.

Determinación de la membrana plasmática particionado en proteínas asociadas periféricamente

La microscopía de localización de una sola molécula 3D se utiliza para sondear las posiciones espaciales y las trayectorias de movimiento de las proteínas etiquetadas fluorescentes mente en células bacterianas vivas. El protocolo experimental y de análisis de datos descrito en este documento determina los comportamientos difusivos prevalentes de las proteínas citosólicas basadas en trayectorias agrupadas de una sola molécula.

Microscopía de seguimiento de una sola molécula - Una herramienta para determinar los estados difusos de las moléculas citosólicas

Este artículo proporciona una guía paso a paso para investigar la dinámica de localización subcelular de proteínas y para monitorear los cambios morfológicos usando microscopía de fluorescencia de alta resolución en Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus.

Microscopía de Fluorescencia de Células Vivas para Investigar la Localización de Proteínas Subcelulares y Cambios de Morfología Celular en Bacterias

Los conjugados BODIPY convencionales se pueden utilizar para la microscopía de localización de células vivas de una sola molécula (SMLM) a través de la explotación de sus dimers de estado de tierra de formación transitoria y cambio de rojo. Presentamos un protocolo SMLM optimizado para rastrear y resolver lípidos neutros subcelulares y ácidos grasos en mamíferos vivos y células de levadura a escala de longitud nanoscópica.

Conjugaciones BODIPY convencionales para microscopía de superresolución de células vivas y seguimiento de una sola molécula

Este protocolo presenta un flujo de trabajo para la propagación, diferenciación y tinción de células SH-SY5Y cultivadas y neuronas primarias del hipocampo de rata para la visualización y el análisis de la ultraestructura mitocondrial mediante microscopía de agotamiento de emisiones estimuladas (STED).

Uso de imágenes de células vivas de STED para visualizar la ultraestructura de la membrana interna mitocondrial en modelos de células neuronales

Este protocolo describe un mecanismo para utilizar la microscopía óptica y electrónica correlativa para visualizar la interacción de mitocondrias y lisosomas marcados con mEosEM y APEX2, respectivamente.

Microscopía correlativa de luz y electrónica de doble color para la visualización de interacciones entre mitocondrias y lisosomas

Este artículo ofrece una descripción detallada de cómo crear muestras para el seguimiento de una sola proteína en bicapas lipídicas soportadas por sólidos. También explica un microscopio de fluorescencia sencillo con sensibilidad a una sola molécula y una tasa de fotogramas rápida. Finalmente, describimos el procedimiento para extraer trayectorias de una sola proteína.

Seguimiento de proteínas individuales en bicapas lipídicas mediante microscopía de fluorescencia

Este protocolo describe el marcaje de anticuerpo único (SAL) para resolver la organización espacial a nanoescala de las proteínas de membrana plasmática. Al aprovechar las interacciones acumulativas anticuerpo-epítopo a nivel de molécula única, el SAL de membrana (mSAL) mapea las distribuciones locales de epítopos mientras captura simultáneamente el comportamiento de unión de anticuerpos en el entorno celular nativo.

Microscopía de localización de moléculas individuales de proteínas de membrana utilizando marcaje de anticuerpo único

Aprende a localizar proteínas de membrana en células mamíferas vivas mediante microscopía multicolor de molécula única. Este método de autoetiquetado alcanza ~18 nm de resolución para estudiar dinámica proteica en organelos.

Microscopía de localización de varios colores solo de proteínas de membrana en organelos de células mamíferas vivas

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