Microscopía de localización de varios colores solo de proteínas de membrana en organelos de células mamíferas vivas

Esta técnica puede responder a preguntas clave en los procesos de regulación, como el papel que juegan la dinámica y la organización de las proteínas en la adaptación funcional. La principal ventaja de esta técnica es que se puede realizar en células vivas, revelando así la dinámica de las proteínas a nivel de una sola molécula. Aunque este método se implementó originalmente para proporcionar información sobre la organización espacio-temporal de las proteínas de la membrana mitocondrial, también se puede aplicar a otros orgánulos y otras proteínas de la membrana.

La demostración de la técnica estará a cargo de Timo Appelhans, un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Después de transfectar y preparar las muestras de células y el microscopio de acuerdo con el protocolo de texto, monte la muestra preparada con perlas fluorescentes en el portamuestras entre el anillo de PTFE y el anillo de goma roja. Encienda el microscopio, todos los componentes de hardware y todo el software necesario para la microscopía.

Use un pañuelo de papel nuevo y sin pelusa rociado con isopropanol para limpiar la lente del objetivo y la parte inferior del cubreobjetos. A continuación, coloque una gota de aceite de inmersión en la pupila de la lente del objetivo. A continuación, coloque el portamuestras con la muestra de perlas en la platina del microscopio de modo que la parte inferior del cubreobjetos entre en contacto con el aceite.

A continuación, concéntrese en las cuentas mediante el uso de luz de transmisión o una línea láser. Ajuste la potencia de los dos láseres de excitación para lograr una densidad de señal similar en los dos canales de fluorescencia. Luego busque un área con muchas señales fluorescentes distintas.

Genere una vista combinada de los canales fluorescentes mediante el software de control de la cámara. A continuación, utilice los tornillos del divisor de imagen para inclinar manualmente el divisor de imagen óptico interno para lograr la mejor superposición de las señales de los dos canales fluorescentes. Inicie el software de control de microscopio TIRF y elija mostrar canales individuales en el modo de transmisión en vivo.

Tome una imagen instantánea, excitando fluorescentes en todos los canales. A continuación, utilice esta imagen para producir la matriz de transformación. Inicie el complemento de análisis de software y cargue las imágenes de doble color previamente grabadas de perlas fluorescentes en el software.

Elija la orientación utilizada de los canales fluorescentes. Haga clic en Sí cuando se le solicite calibrar imágenes y seleccione la instantánea tomada anteriormente. Abra el administrador de unidades para definir los factores de conversión de unidades y, a continuación, abra el administrador de localización.

Para determinar la función de dispersión de puntos, o PSF, presione el botón PSF Radius. En la ventana Estimador de PSF que se abre, defina la apertura numérica y el máximo de emisión. A continuación, haga clic en Estimar radio de PSF.

A continuación, acepte el PSF experimental obtenido. Defina el cuadro de evaluación, el número de bucles de deflación y cuántos núcleos de la computadora se utilizan para el cálculo. A continuación, pulse Localizar para empezar a ajustar la distribución de intensidad de las partículas individuales, utilizando una función gaussiana simétrica 2D.

Abra el administrador de calibración. En la imagen renderizada y fusionada de los dos canales, se mostrará la señal original y los centros localizados. Elija el modo afín.

A continuación, conecte manualmente los pares correspondientes de centros localizados en los dos canales, que se han originado en la misma perla fluorescente, dibujando una línea de conexión. Conecte las señales correspondientes distribuidas en el campo de visión. A continuación, pulse Aceptar y guarde la matriz de transformación.

Para llevar a cabo imágenes moleculares individuales de las proteínas de la membrana mitocondrial, monte el deslizamiento de la cubierta de la muestra entre los anillos de goma y PTFE. A continuación, llene la cámara con 0,5 a 0,8 mililitros de medio de imagen. Limpie la lente del objetivo y la parte inferior de la cubierta.

A continuación, utilice la luz de transmisión o una línea láser para enfocar las células, después de añadir una gota de aceite a la lente. A continuación, ajuste la potencia de los dos láseres de excitación para lograr una intensidad similar y busque una zona con muchas señales fluorescentes. Ajuste el ángulo de iluminación en el software de control de microscopio TIRF para crear un ángulo de incidencia que sea más pequeño que el ángulo crítico, o el modo TIR, para excitar la región específica de interés a través de una hoja HILO.

La adaptación de la iluminación del microscopio TIRF para excitar orgánulos celulares utilizando la iluminación HILO requiere un juicio rápido de la relación señal-fondo y experiencia en microscopía TIRF, así como un conocimiento de la morfología celular. Establezca la ganancia EM y elija un tiempo de exposición adecuado para el experimento que recoja suficientes fotones por fotograma. A continuación, ajuste la potencia del láser para lograr una alta relación señal-ruido, ya que esta relación corresponde directamente a la precisión de la localización.

Encuentre un área en la periferia celular con mitocondrias alargadas que no se superponen y señales de una sola molécula. Si no hay señales individuales visibles en uno o ambos canales, espere hasta que el blanqueo dé como resultado la aparición de señales de una sola molécula. En el caso de que solo sea necesario blanquear un canal, apague el láser del otro canal, para evitar el blanqueo, antes de grabar este canal.

Grabe hasta que el número de señales sea demasiado bajo para una continuación razonable. Inicie el software de procesamiento de imágenes y compruebe las estructuras mitocondriales generando una imagen de suma renderizada acumulativa de al menos 1.000 fotogramas grabados. Inicie el complemento de análisis de software.

Para llevar a cabo el procesamiento de datos para la localización y el seguimiento, cargue los datos sin procesar. Cuadros multicolor. Elija la orientación correcta de ambos canales.

Cuando se le solicite Calibrar imágenes, cargue la matriz de transformación. Los canales se mostrarán por separado. Abra los datos sin procesar del contenedor de imágenes haciendo clic en Mostrar.

A continuación, abra el administrador de unidades en la pestaña superior y defina los factores de conversión de unidades en cada canal. Abra el administrador de localización en la pestaña superior y defina el cuadro de evaluación y el número de bucles de deflación. Haga clic en Radio PSF para abrir el estimador PSF.

Establezca la apertura numérica y el máximo de emisión para obtener el valor PSF teórico. Presione Aceptar. Repita esto para todos los canales.

A continuación, pulse Localizar para iniciar la localización de una sola partícula para las señales grabadas en ambos canales. Espere a que finalice el software. Ahora, se obtiene una imagen super-resuelta para cada canal en el contenedor de imágenes del plugin de análisis de software.

PINK1 es un factor importante que garantiza la funcionalidad mitocondrial. Para determinar la localización de PINK1 en relación con Tom20 en mitocondrias funcionales y disfuncionales, se registró una serie temporal de 1.000 fotogramas. La imagen acumulativa de todas las señales a lo largo del tiempo de un canal mostró que PINK1 se localizaba en el citosol, en la membrana externa y dentro de las mitocondrias en condiciones normales, pero preferentemente en la membrana externa de las mitocondrias despolarizadas.

Como muestran las imágenes sumadas de las partículas localizadas, PINK1 se distribuye principalmente dentro de las mitocondrias polarizadas, mientras que Tom20 se localiza en la membrana mitocondrial externa. Esto se vuelve aún más claro en la imagen combinada de las partículas localizadas Tom20 y PINK1, lo que muestra que la distribución de la proteína de membrana externa Tom20 es mucho más amplia. Para verificar la localización de PINK1 dentro de las mitocondrias, la subunidad de 30 kilodalton del complejo respiratorio uno se fusionó con GFP fotoactivable y se registró mediante microscopía de localización de fotoactivación de fluorescencia.

La imagen acumulativa de triple color y la distribución de la sección transversal muestran la superposición de complejo uno y PINK1, lo que confirma la importación de PINK1 de cuerpo entero. Estos datos demuestran que las subpoblaciones de PINK1 ocupan varios microcompartimentos mitocondriales. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 20 horas, incluido el registro y el posprocesamiento de los datos, si se hace correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar probar el movimiento de los orgánulos. Siguiendo este procedimiento, se puede determinar la localización relativa de las proteínas. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del seguimiento de una sola partícula de proteínas mitocondriales observaran su comportamiento en Z2 y diferentes condiciones metabólicas, y bajo estrés.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la microscopía de doble columna de proteínas mitocondriales para revelar su posición y tráfico de suborgánulos.