Optimizado el ensayo de rayado para In Vitro pruebas de migración de la célula con una cámara óptica automatizada

La principal ventaja de esta técnica es que se pueden observar las células en tiempo real en el microscopio óptico automático. Las implicaciones de este tratamiento se extienden a una terapia de heridas crónicas o cáncer donde la migración juega un papel crucial en estas enfermedades. Comience lavando un cultivo confluente de células HaCaT dos veces con cinco mililitros de PBS estéril libre de magnesio y calcio por lavado.

A continuación, incube las células con un mililitro de tripsina en una incubadora a 37 grados centígrados durante cinco a ocho minutos. Después de confirmar el desprendimiento bajo un microscopio óptico, detenga la reacción enzimática con nueve mililitros de medio de cultivo suplementado con FBS. Y diluir las células a una concentración de 7,5 veces 10 a la cuarta célula por cada 250 microlitros de medio más concentración de FBS.

A continuación, siembre 250 microlitros de células en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 48 pocillos de fondo redondo y deslice suavemente la placa de lado a lado para asegurarse de que las células se distribuyan uniformemente por el fondo de los pocillos. A continuación, transfiera la placa a una incubadora de cultivos celulares. Cuando los cultivos hayan alcanzado una confluencia del 90 al 95%, reemplace el sobrenadante en cada pocillo con 250 microlitros de medio recién preparado suplementado con 10 microgramos por mililitro de mitomicina C, y devuelva la placa a la incubadora durante otras dos horas.

Al final de la incubación, lavar las células con 250 microlitros de PBS y agregar 250 microlitros de PBS fresco a cada pocillo. A continuación, utilice una punta de micropipeta de 200 microlitros para hacer un rasguño vertical en cada monocapa de celda. Cuando se hayan rayado todas las monocapas, reemplace el PBS en cada pocillo con 250 microlitros con el estímulo peptídico de interés y monte la placa en un sistema de cámara óptica con la tapa intacta.

Para configurar la cámara óptica, abra la ventana de adquisición y seleccione cicatrización de heridas. Seleccione el tipo de placa y anule la selección de los pocillos que no estén en uso. A continuación, haga clic en habilitar y haga clic con el botón derecho en uno de los pozos para ajustar el enfoque para que se ajuste a la posición de las celdas.

Establezca el período de tiempo para las imágenes en intervalo de imagen y establezca el número de repeticiones para que se ajuste al período deseado. A continuación, seleccione el tipo de análisis adecuado. A continuación, haga clic en iniciar para comenzar a obtener imágenes de las celdas.

Cuando se produce una herida, las células de la piel comienzan a proliferar y a migrar a través del lecho de la herida para cerrar la herida, un proceso que se puede observar a través de la cámara óptica. Después de una incubación de 48 horas, el tratamiento con factor de crecimiento endotelial induce un cierre de casi el 95% de la herida, en comparación con un cierre del 38% en los pocillos de control no tratados, y del 33% y el 62% en los cultivos de lactoferrina y lactoferricina, respectivamente. El porcentaje de cierre de la herida determinado a partir de los cambios en el ancho del espacio desde el rasguño inicial también se puede trazar para cada estímulo de crecimiento.

Este video describe un protocolo sencillo y eficiente para estudiar la migración de queratinocitos a través de un rasguño hecho en una monocapa de células sanas. Aunque las células utilizadas en este ensayo son células HaCaT, el método también se puede aplicar en otras líneas celulares, hongos o incluso bacterias, siempre que se adhieran a la parte inferior de la placa de microtitulación.