Name: Optimizado el ensayo de rayado para In Vitro pruebas de migración de la célula con una cámara óptica automatizada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Aprende el ensayo de rayado optimizado para estudiar la migración celular in vitro con microscopía óptica automatizada. Este método permite observar células HaCaT en tiempo real para investigar terapias de heridas crónicas y cáncer.

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Consejo Danés de investigación independiente, tecnología y producción, otorgar #4005-00029

El montaje experimental no tiene ninguna restricción ética y jurídica y se llevó a cabo de acuerdo con la Universidad de Roskilde. Una visión general del montaje experimental se aprecia en la figura 1 y los mecanismos de la cámara óptica en la figura 2.
1. preparación
<ol><li>Realizar todos los pasos en un banco de flujo laminar estéril limpiar la banca y todos los equipos con etanol al 70% antes del inicio del experimento.</li>
	<li>Coloque la cámara óptica en una incubadora convencional a 37 ° C con 5% CO2 para garantizar las condiciones óptimas para las células.</li>
	<li>Cultivar células HaCaT en medio DMEM con 10% FBS y 1 x antibióticos (penicilina y estreptomicina) en un matraz T75.</li>
	<li>Para separar las células y el cultivarlos cada 3-4 días, por la dispersión sobre la capa celular usar la tripsina de 1 x 1 mL. Precaliente a temperatura ambiente antes de usar.</li>
</ol>2. generar una monocapa de HaCaT células en una placa de microtitulación de 48 pozos
<ol><li>Retire el medio del frasco T75 con una pipeta Pasteur.</li>
	<li>Lavar las células adherentes en el matraz mediante la adición de 5 mL 1 x PBS estéril al matraz T75. Nota: Asegúrese de que la PBS está libre de calcio y magnesio.</li>
	<li>Circulan por el PBS y extraiga con una pipeta Pasteur.</li>
	<li>Repita el paso 2.2-2.3.</li>
	<li>Añadir tripsina de 1 x 1 mL en el matraz y dispersa a través de la capa de células.</li>
	<li>Incube el frasco a 37 ° C en una incubadora convencional hasta que las células son separadas (5-8 minutos es suficiente para la mayoría de las líneas de la célula).</li>
	<li>Ver bajo el microscopio si las células son separadas. Una vez que las células son separadas, añadir 9 mL de los medios de cultivo regular con 10% FBS para inactivar la tripsina 1 x.</li>
	<li>Cuenta la célula con cualquiera un hemocitómetro, un contador coulter o similares. Nota: Azul de tripán puede utilizarse para ver las células muertas. Sin embargo, en tripsina 1 x HaCaT las células son redondas perfectamente cuando vivo.</li>
	<li>Transferencia de 7.5 x 104 células/pozo en 250 μl 10% FBS media a una placa de cultivo de tejidos de 48 pocillos fondo redondo (placa estándar). Nota: ensayo también puede configurarse en 6, 12, 24-o placas de 96 pocillos, que todo pueden ser analizadas bajo el microscopio óptico.</li>
	<li>Mueva suavemente la placa de lado a lado para asegurar que las células se distribuyen igualmente en los pozos o las células se reunirán en el centro de los pozos. Examinar bajo un microscopio de luz para asegurarse de que la célula es distribuida uniformemente en los medios de comunicación</li>
	<li>Poner la placa en un convencional incubador de CO2 a 37 ° C durante la noche o hasta que las células se han adherido a la parte inferior de los pozos.</li>
</ol>3. Además de los estímulos para efectos de migración
<ol><li>Comprobar si los pozos son confluentes de 90-95% bajo un microscopio de luz.</li>
	<li>Preparar 10 μg/mL de mitomicina C en una cantidad adecuada del medio. Nota: En este estudio, la mitomicina C se mantiene a 4 ° C en una solución madre de 1 mg/ml. Mitomicina C en la solución puede ser almacenada una semana en la oscuridad a 2-8 ° C.</li>
	<li>Retire los medios gastados con una pipeta Pasteur de cada pozo.</li>
	<li>Añadir 250 μl de 5 μg/mL de mitomicina C a cada pocillo.</li>
	<li>Incubar la placa por 2 h a 37 ° C y 5% CO2.</li>
	<li>Preparar estímulos de péptidos por diluir en una cantidad adecuada del medio. Nota: En este estudio, tanto la humana y bovina lactoferrina y Lactoferricin fueron probados a 25 μg/mL en un volumen de 250 μl</li>
	<li>Retire el medio con el mitomycin C con una pipeta Pasteur.</li>
	<li>Lave los pocillos 1 x con 250 μl de 1 x PBS (temperatura ambiente) y retire el lavado con un Pasteur pipeta.</li>
	<li>Añadir 250 μl de 1 x PBS y raspar manualmente los pozos verticalmente con una punta de pipeta de 200 μl. Utilice una nueva pipeta para cada pozo.</li>
	<li>Retirar el PBS y añadir estímulos de péptido de 250 μl.</li>
	<li>Monte la placa en sistema óptico de la cámara mediante el ajuste de los tornillos en ambos lados de la placa. Deje la tapa en la placa de microtitulación. Nota: La cámara puede funcionar con la tapa abierta si es necesario.</li>
</ol>4. configurar el programa para la cámara óptica en la computadora
<ol><li>Haga clic en adquirir en la barra de tareas de la izquierda.</li>
	<li>Elija la función de la cicatrización de heridas en la barra de tareas de la izquierda.</li>
	<li>Seleccione el tipo de placa haciendo clic debajo de la ilustración de la placa.</li>
	<li>Anular la selección de pozos, no esté en uso, marcándolos y haga clic en Activar en la parte superior izquierda de la pantalla. Nota: Todos los pozos se seleccionan por defecto.</li>
	<li>Ajuste el enfoque de la lente en los pozos para ajustar la posición de las celdas haciendo clic derecho en uno de los pozos. Nota: Enfoque automático también se puede ajustar manualmente moviendo la barra hacia la derecha de la ilustración de la placa.</li>
	<li>Establecer el período de tiempo para imágenes en el Cuadro intervalo (por ejemplo, (00: 30:00)).</li>
	<li>Establecer el número de repetición para el período deseado (por ejemplo 97 repeticiones).</li>
	<li>Iniciar la ejecución pulsando el botón Start en la esquina inferior derecha.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La importancia de la migración en los estudios del desarrollo, la cicatrización de heridas, Inmunología y cáncer ha llevado a varios métodos para estudiar la migración. La migración puede ser una expresión de la expansión o el cierre de la brecha por las células. Se prueba más a menudo posible cierre del cero, que es más fácil crecer las células en una monocapa y luego hacer un rasguño que el crecimiento de las células en forma específica8. Nuestro estudio demuestra un método optimizado para rayar...

La migración es un proceso importante que influye en varios aspectos fisiológicos. En la cicatrización de heridas, migración facilita la re-epitelización de la piel. En las heridas no cicatrizan, como heridas crónicas, bacterias oportunistas causan infección de la herida, y las heridas abiertas son ideales para el crecimiento de bacterias y formación de biofilm1,2. Biofilm es una de las causas del desarrollo de bacterias resistentes, que es una de las mayores amenazas a nuestra sociedad moderna3. En la curación de la herida, las células inmunitarias no pueden penetrar el biofilm. En el cáncer, la migración de las células cancerosas es un paso fundamental de la metástasis, que es la principal causa de muerte para los pacientes con tumores sólidos4,5. Por lo tanto, es crucial poder estudiar la migración.
El ensayo de rayado se utiliza a menudo para probar la migración de la célula porque es barato y fácil de realizar en líneas de células adherentes, tales como fibroblastos endoteliales y células epiteliales líneas6,7. Hoy en día, existen varios métodos para realizar rayas8y diversos materiales se han divulgado para ser utilizado, incluyendo palillos9, celular raspadores10, láseres11y corrientes eléctricas12. Todos los métodos tienen desventajas y ventajas diferentes, y el método debe ser decidido según la herramienta de análisis, presupuesto y tipo de célula. Por ejemplo, si el tipo de celda utilizado requiere revestimiento, retiro de presión manual, por ejemplo con una punta de palillo de dientes o de la pipeta, influirá en la migración dentro de la zona, se debe usar un método diferente. En este estudio, nos centraremos en raspado manual.
Una desventaja para el raspado manual es la variación del tamaño, las formas de los arañazos y acumulación de células en los bordes del scratch. Existen muchos protocolos, y un papel altamente citado informa aumento de la velocidad o lavar bien después de rayar13. Además, se han utilizado varios métodos para reducir al mínimo la proliferación, ya que la proliferación de las células no se puede diferenciar de la migración y por lo tanto puede dar resultados falsos positivos de la migración. Algunos divulgan métodos son hambre suero precede el rasguño14 y disminuyendo la cantidad de suero15. Sin embargo, ninguno de estos métodos puede asegurar que no hay ninguna proliferación. Por lo tanto, se presenta un tratamiento previo de las células con el mitomycin C para obtener resultados verdaderos de la migración. La mitomicina C es un antibiótico que inhibe la síntesis de ADN mediante la formación de un enlace covalente con el ADN, lo que impide que el ADN separa16. Por el tratamiento con mitomicina C y lavar con PBS antes de rayar, el cierre detectado de la brecha muestra la verdadera migración de las células (figura 1).
Una característica de todos los métodos es la necesidad de un sistema para analizar el proceso de migración17. Común y un método económico para analizar el progreso es usar un microscopio de campo de luz para tomar imágenes de la cero en momentos predeterminados, seguidos de un análisis del cierre de la brecha en un software de imagen18,19. Este método es lento, poco fiable en cuanto a tomar fotografías en el mismo lugar y el enfoque, y el movimiento de la incubadora a cámara las fuerzas ciclos de cambios de temperatura mientras se toman fotos. Otros métodos se han desarrollado para detectar la migración midiendo el flujo de corriente. Los cambios actuales, como las células cubren más espacio en la placa, que se lee como un aumento en la impedancia20. Mediante la medición de impedancia, no se ve afectado el medio ambiente de las células, y por lo tanto se considera el método no invasivo. Este método se basa en platos especializados con electrodos de oro, que son caros, pero permiten la detección de muchos procesos, como la adhesión celular, proliferación, migración y muerte celular. Una gran desventaja de este método es que la medición de impedancia no indica directamente la migración, como factores como la temperatura tienen un gran impacto en la impedancia. Cambios en la impedancia pueden ser causadas por varios factores que no son revisados por el software, haciendo más difícil el análisis de los datos. Por lo tanto, la falta de visualización requiere un microscopio de luz convencional para verificar la migración.
Para superar muchos de los inconvenientes de las técnicas disponibles, utilizamos una cámara óptica automatizada en tiempo real. La cámara óptica es un sistema de detección con un microscopio de alto rendimiento en una plataforma pequeña con una lente, unidad de iluminación y una cámara digital. Cuenta con un software incorporado, que puede probar la migración y proliferación entre otras cosas. Para detectar la migración, se utilizan dos algoritmos para analizar el crecimiento y la cinética de la migración de las células, que se llaman la proliferación y la cicatrización análisis, respectivamente. El análisis de la proliferación se basa en un algoritmo de segmentación de imagen de dos etapas que se aplica el análisis de textura para detectar la diferencia entre zonas cubiertas de la célula (se muestra en amarillo) y vacío fondo áreas por análisis del histograma avanzado. La cicatrización de análisis se basa en un algoritmo de tres pasos que detecta la monocapa celular, localiza el boquete de la herida y determina el ancho de la brecha. Estos pasos se llevan a cabo en momentos determinados por el usuario y los datos se presentan como área cubierta, distancia y área de boquete. Una de las grandes ventajas de esta máquina es que permite la proyección de imagen de células adherentes a través de líquido debido al ángulo de la cámara21. Las imágenes de lenstakes inclinado de cámara que se proyectan a una pila de z de un solo plano z generan para asegurarse de que las fotos son foco (figura 2). pilas de z se generan por la fusión de la serie de fotografías (por ejemplo 40) perpendiculares al borde de la herida y a través de la herida toda. Las pilas de z permite la captación de la profundidad de la capa de células, así como un plano de foco a través de la herida. Además, la serie de imágenes se puede poner junto a una colección de vídeos de las imágenes con el clic de un botón.
Demostramos un protocolo optimizado para la detección de la migración en la línea celular de queratinocitos HaCaT. Hemos probado lactoferrina y su péptido N-terminal, Lactoferricin, de seres humanos y las vacas, para analizar su efecto sobre la migración como estas moléculas se han demostrado tener numerosas aplicaciones como antimicrobiano e inmune modulación de moléculas22 , 23. los cuatro compuestos se compararon con las células HaCaT no tratadas y factor de crecimiento epidérmico (EGF) fue utilizado como control positivo.

<table><tbody><tr><td>oCelloScope</td><td>BioSense Solution ApS</td><td></td><td>Cámara óptica</td></tr><tr><td>UniExplorer software&nbsp;</td><td>BioSense Solution ApS</td><td></td><td>(8.0.0.7144 (RL3))</td></tr><tr><td>Célula</td><td></td><td></td> de HaCaT <td>donada por el Hospital Bispebjerg</td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>Medio para HaCaT</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>Suero fetal bovino</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>D837</td><td>Sin Mg+ y Ca2+</td></tr><tr><td>Pencillin-Estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>Antibióticos</td></tr><tr><td>Tripsina (10x)</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Mitomicina C</td><td>Tocris</td><td>3258</td><td>Inhibe la proliferación Placa</td></tr><tr>de<td>microtitulación</td><td>Greiner Bio-one</td><td>677 180</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Panasonic</td><td></td><td>37&deg; C, 5% CO2</td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Assistent</td><td></td><td>T&uuml; rk (0.1 mm)</td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Accu-Jet pro</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

optimizado el ensayo de rayado para in vitro pruebas de migración de la célula con una cámara óptica automatizada

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Migración celular es un proceso importante que influye en muchos aspectos de la salud, como la cicatrización de heridas y el cáncer, y por lo tanto, es crucial para el desarrollo de métodos para el estudio de la migración. El ensayo de rayado ha sido el método más común de en vitro para probar compuestos con propiedades anti y pro migration debido a su bajo costo y simple procedimiento. Sin embargo, un problema a menudo informado del ensayo es la acumulación de células en el borde de la raya. Además, para obtener datos de lo análisis, imágenes de diferente exposición deben tomarse durante un período de tiempo en el mismo lugar exacto para comparar los movimientos de la migración. Programas de análisis diferentes pueden utilizarse para describir el cierre scratch, pero son intensivas en mano de obra, inexacto y las fuerzas de los ciclos de cambios de temperatura. En este estudio, demostramos un método optimizado para probar el efecto de la migración, por ejemplo con las proteínas que ocurren naturalmente humanos y bovinos lactoferrina y su péptido N-terminal Lactoferricin en la línea de células epiteliales HaCaT. Una optimización crucial es lavar y rayar en PBS, que elimina la mencionada acumulación de células en el borde. Esto podría explicarse por la eliminación de cationes, que han demostrado tener un efecto en la conexión de la célula de queratinocitos. Para asegurar la detección real de la migración, previo tratamiento con mitomicina C, un inhibidor de la síntesis de ADN, fue agregado al Protocolo. Finalmente, demostramos la automatizado óptica cámara, que elimina los ciclos de temperatura excesiva, mano de obra con el análisis de cierre scratch, mejora en la reproducibilidad y garantizando el análisis de secciones idénticas de cero con el tiempo.

HaCaT es una línea de celular de queratinocitos, uno de los tipos celulares más abundantes en la piel. Cuando se produce una herida, las células de la piel comienzan a proliferar y migrar más al lecho de la herida para cerrar la herida (figura 3). Ambos procesos son, por lo tanto, de suma importancia para la curación adecuada.
La cámara óptica puede seguir ambos procesos en tiempo real. Para la migr...

Aquí describimos un procedimiento para probar la migración la célula en vitro con un microscopio de cámara óptica automatizada. El ensayo de rayado ha sido ampliamente utilizado donde el cierre de la raya es seguido por un período determinado. El microscopio óptico permite la detección confiable y barata de migración de la célula.

Optimizado el ensayo de rayado para In Vitro pruebas de migración de la célula con una cámara óptica automatizada

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for ...

La principal ventaja de esta técnica es que se pueden observar las células en tiempo real en el microscopio óptico automático. Las implicaciones de este tratamiento se extienden a una terapia de heridas crónicas o cáncer donde la migración juega un papel crucial en estas enfermedades. Comience lavando un cultivo confluente de células HaCaT dos veces con cinco mililitros de PBS estéril libre de magnesio y calcio por lavado.A continuación, incube las células con un mililitro de tripsina en una incubadora a 37 grados centígrados durante cinco a ocho minutos. Después de confirmar el desprendimiento bajo un microscopio óptico, detenga la reacción enzimática con nueve mililitros de medio de cultivo suplementado con FBS. Y diluir las células a una concentración de 7,5 veces 10 a la cuarta célula por cada 250 microlitros de medio más concentración de FBS.A continuación, siembre 250 microlitros de células en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 48 pocillos de fondo redondo y deslice suavemente la placa de lado a lado para asegurarse de que las células se distribuyan uniformemente por el fondo de los pocillos. A continuación, transfiera la placa a una incubadora de cultivos cel

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

De uso general, se describen métodos muy accesibles para el examen de la migración celular y la invasión in vitro. El primer método es el ensayo de cierre de la herida de células que mide la motilidad celular. El segundo método es la migración y la invasión de ensayo Transwell que evalúa la quimiotaxis y la capacidad invasiva de las células.

En la migración celular y la invasión ensayos in vitro

La capacidad de migrar es una función clave de muchos tipos diferentes de células, incluidas las células estromales mesenquimales (MSC). Sin embargo, cuantificar las alteraciones en la capacidad migratoria después de los daños es un desafío. Este protocolo describe un ensayo de migración fácilmente adaptable que utiliza estadísticas rigurosas para cuantificar los cambios en la capacidad migratoria de MSC después del daño.

Optimización del ensayo arañazos herida para detectar cambios en Murino mesenquimales estromales migración de células después de daño por Soluble Extracto humo del cigarrillo

Este estudio divulga a dos diferentes métodos para el análisis de invasión celular y la migración: el análisis de la cámara de Boyden y en vitro video microscopio basado cicatrización ensayo. Los protocolos de estos dos experimentos se describen y se comparan con sus beneficios y desventajas.

Evaluación de la invasión celular y el proceso de migración: una comparación de Video cero basado en el microscopio de la herida el análisis y el análisis de la cámara de Boyden

Migración celular es esencial para el desarrollo, mantenimiento de tejidos y reparación y tumorigenesis y está regulada por factores de crecimiento, quimiocinas y citocinas. Este protocolo describe el ensayo de punto, un análisis de la migración de dos dimensiones, sin restricciones para evaluar el fenotipo migratorio de hojas adjunta, cohesivo de la célula en respuesta a señales microambiental.

Usando el análisis de punto para analizar la migración de células de hojas

Este manuscrito describe cómo incisión-como lesiones sobre monocapas de células epiteliales cultivadas convenientemente modelo herida curativo en vitro, permitiendo la proyección de imagen de confocal o microscopia de la exploración del laser, y que puede proporcionar alta calidad datos cuantitativos y cualitativos para el estudio de comportamiento de la célula y los mecanismos implicados en la migración.

Métodos basados en microscopía para la evaluación de la migración de células epiteliales durante la cicatrización de la herida In Vitro

Este estudio se centra en un modelo en vitro de herida curativa (rasguño ensayo) como un mecanismo para la determinación de contaminantes ambientales como como la migración celular de la influencia de arsénico. Los resultados demuestran que este ensayo in vitro proporciona indicaciones rápidas y tempranas de los cambios en la migración celular antes de la experimentación en vivo .

In Vitro Rasguño de análisis para demostrar los efectos del arsénico sobre la migración de la célula de la piel

El actual protocolo describe un método integrado de investigación migración de la célula de cáncer y la invasión en una única plataforma en tiempo real, proporcionando una opción fácilmente reproducible y eficiente para estudiar la morfología y movilidad de la célula.

Un flujo de trabajo Simple migración/invasión usando a un sensor automatizado de células vivas

Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo de arañazos in vitro utilizando fibroblastos primarios y para un ensayo de cicatrización de heridas de piel in vivo en ratones. Ambos ensayos son métodos sencillos para evaluar la cicatrización in vitro e in vivo de heridas.

Ensayo de migración de arañazos y cámara dorsal Skinfold para análisis In Vitro e In Vivo de sanación de heridas

Presentamos un método rentable para el ensayo de migración de arañazos que proporciona un nuevo enfoque para determinar la migración celular sin el uso de métodos intensivos en equipos. Mientras que los fibroblastos se utilizaron en este protocolo, se pueden adaptar y utilizar para estudiar tipos celulares adicionales e influencias en la migración celular.

Un ensayo de migración de arañazos rentable y adaptable

Este protocolo proporciona un método de aislamiento primario de células T murinas y microscopía de lapso de tiempo de la migración de células T en condiciones ambientales específicas con análisis cuantitativo.

Ensayo de migración in vitro en tiempo real para linfocitos T murinos CD8+ primarios

Este estudio presenta el ensayo bidimensional (2D) de migración de heridas por arañazo y el ensayo tridimensional (3D) de brotes esferoides, junto con sus respectivos métodos de análisis posteriores, incluida la extracción de ARN y la inmunocitoquímica, como ensayos adecuados para estudiar la angiogénesis in vitro.

Investigación de la angiogénesis a nivel funcional y molecular mediante el uso del ensayo de migración de heridas por arañazo y el ensayo de germinación de esferoides.

Aprende el ensayo de rayado optimizado para estudiar la migración celular in vitro con microscopía óptica automatizada. Este método permite observar células HaCaT en tiempo real para investigar terapias de heridas crónicas y cáncer.

Optimizado el ensayo de rayado para In Vitro pruebas de migración de la célula con una cámara óptica automatizada

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