Un método Simple y Reproducible para preparar muestras de membrana de microvasos de cerebro recién aislado de rata
7 de mayo de 2018
Aquí, se describe un método para el aislamiento de microvasos de cerebro de rata y para la preparación de las muestras de la membrana. Este protocolo tiene la ventaja clara de producir enriquecido microvessel muestras con proteínas aceptable rendimiento de animales individuales. Muestras pueden utilizarse para análisis de proteína sólida en el endotelio microvascular cerebral.
El objetivo general de este procedimiento es aislar microvasos cerebrales del cerebro de rata para estudios bioquímicos destinados a comprender las características moleculares de la barrera hematoencefálica de los mamíferos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la fisiología de la barrera hematoencefálica y la neurofarmacología, como la regulación, la localización y la expresión de proteínas de unión estrecha y transportadores endógenos en la salud y la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que podemos aislar un número suficiente de microvasos de alta calidad de un animal individual, teniendo en cuenta la variabilidad natural en la expresión de proteínas entre animales individuales.
La demostración de esta técnica estará a cargo de Bianca Reilly, una destacada estudiante de pregrado de mi laboratorio. Después de sacrificar y decapitar a una rata Sprague-Dawley de acuerdo con el protocolo de texto, use tijeras quirúrgicas para resecar la piel del cráneo de la rata haciendo un solo corte transversal. Usando rongeurs, retire con cuidado la placa del cráneo y exponga el cerebro.
Luego, con una espátula, retire el órgano. Separe el cerebro y coloque el tejido cerebral aislado en un tubo cónico de 50 mililitros con cinco mililitros de BMB y 5,0 microlitros de cóctel de inhibidores de la proteasa. Para procesar el tejido, transfiéralo a una placa de Petri limpia.
Luego, con fórceps, haga rodar suavemente el cerebro sobre un papel de filtro de 12,5 centímetros de diámetro para eliminar las meninges externas, que están ligeramente adheridas a la corteza cerebral. Durante este paso, se debe tener cuidado para asegurarse de que todo el tejido meníngeo se haya extraído de la muestra de tejido cerebral. Las meninges se pueden visualizar como un tejido membranoso transparente que se puede separar fácilmente del tejido cerebral.
Presione suavemente el tejido cerebral contra el papel de filtro y vuelva a enrollar el pañuelo, girando el papel de filtro con frecuencia durante este paso. Luego, con fórceps, separe el plexo coroideo de los hemisferios cerebrales. A continuación, vuelve a aplanar suavemente el tejido cerebral y utiliza unas pinzas para extraer los bulbos olfativos adyacentes a la materia blanca.
Coloque el tejido cerebral cortical en un mortero de vidrio frío. A continuación, añade cinco mililitros de BMB con cóctel de inhibidores de la proteasa. Usando un homogeneizador de potencia aéreo, inserte un mortero en el mortero y homogeneice el tejido cerebral usando 15 golpes hacia arriba y hacia abajo a 3, 700 rpm.
A continuación, vierta el homogeneizado en tubos de centrífuga etiquetados. Entre muestras, use etanol al 70% para limpiar el mortero. Para llevar a cabo la centrifugación, agregue 8.0 mililitros de solución de dextrano al 26% a cada tubo de centrífuga marcado que contenga homogeneizado cerebral.
Invierta el tubo dos veces y luego haga un vórtice completo de la muestra. Lleve a cabo el vórtice de cada muestra utilizando múltiples ángulos para garantizar una mezcla completa de la solución de homogeneizado cerebral con la solución de dextrano al 26%. Centrifugar las muestras a 5.000 g y cuatro grados centígrados durante 15 minutos.
Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 5,0 mililitros de BMB con cóctel de inhibidores de proteasa. A continuación, agite el pellet para asegurar una mezcla completa. A continuación, agregue 8.0 mililitros de 26% de dextrano a cada tubo de centrífuga y vórtice como se acaba de demostrar.
A continuación, vuelva a centrifugar las muestras. Con un matraz de vacío y una pipeta de vidrio, aspire el sobrenadante y asegúrese de que el gránulo que contiene el microvaso cerebral no se interrumpa. Vuelva a suspender el pellet en BMB con inhibidor de la proteasa y luego 26% de dextrano dos veces más.
Después de la centrifugación final, agregue 5.0 mililitros de BMB a cada pellet y vórtice para resuspender la muestra. Utilizando el protocolo demostrado en este video, se llevó a cabo el aislamiento exitoso de microvasos intactos del cerebro de rata. En esta imagen, el microvaso se tiñe con un anticuerpo contra Oatp1a4, un transportador que se expresa bien en la membrana plasmática de las células endoteliales microvasculares del cerebro.
Como se demostró mediante Western blot, las preparaciones de membrana de microvasos recolectados de ratas hembra Sprague-Dawley se enriquecieron en PECAM-1, también conocida como CD31, una proteína marcadora de la microvasculatura cerebral. Durante la optimización de este protocolo, se observó un enriquecimiento de PECAM en muestras de membrana preparadas mediante dos y cuatro pasos de centrifugación de dextrano. Según lo determinado por el ensayo de proteínas de Bradford y enumerado en esta tabla, las preparaciones de membrana generalmente producen concentraciones de proteínas que oscilan entre 5.0 miligramos por mililitro y 10.0 miligramos por mililitro.
Los valores de proteína se determinaron con base en una curva estándar que se generó utilizando BSA como estándar. Aquí se muestra una transferencia occidental para la proteína transportadora de BBB Glut1. Se detectaron bandas individuales claras a 54 kilodaltons para esta proteína BBB altamente expresada en cada muestra de membrana.
Este gráfico ilustra una mayor expresión de Glut1 en la BBB en ratas macho frente a ratas hembra. No se observaron diferencias en la expresión de ATPasa de sodio/potasio entre animales machos y hembras. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos a 2 1/2 horas si se realiza correctamente.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener todas las muestras en hielo durante todo el protocolo y tener cuidado al aspirar el sobrenadante de la pelletización del microvaso después de los pasos de centrifugación. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis de coinmunoprecipitación, en muestras de microvasos para responder a preguntas adicionales, como la asociación de diferentes proteínas dentro del mismo complejo proteico en la barrera hematoencefálica. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la fisiología de la barrera hematoencefálica y la neurofarmacología exploraran las características moleculares de la barrera hematoencefálica en la salud y en modelos de enfermedades neurológicas en roedores.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar microvasos de alta calidad del cerebro de rata para sus propios estudios de la biología de la barrera hematoencefálica en la salud y la enfermedad.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este estudio presenta un protocolo para aislar microvasos cerebrales de rata con el fin de investigar la barrera hematoencefálica (BHE). El método permite realizar análisis de proteínas de alta calidad a partir de animales individuales, facilitando la exploración de proteínas de uniones estrechas y transportadores relacionados con la neurofarmacología y la fisiología.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Análisis de proteínas
- Fisiología de la barrera hematoencefálica
Antecedentes
- La barrera hematoencefálica desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis del sistema nervioso central.
- Comprender las características moleculares de la BHE puede orientar estudios sobre enfermedades neurológicas.
- Este método tiene en cuenta la variabilidad en la expresión de proteínas entre diferentes ratas.
- Las muestras enriquecidas de microvasos son esenciales para avanzar en la investigación neurofarmacológica.
Objetivo del estudio
- Aislar microvasos cerebrales de cerebros de rata para estudios bioquímicos.
- Analizar los componentes moleculares asociados con la BHE bajo diversas condiciones fisiológicas.
- Evaluar la expresión y regulación de proteínas específicas relacionadas con la función de la BHE.
Métodos Utilizados
- La plataforma principal incluye técnicas quirúrgicas seguidas de homogenización y centrifugación del tejido cerebral.
- El modelo biológico consiste en ratas Sprague-Dawley, lo que permite el análisis individual de las características de los microvasos.
- No se mencionó ningún flujo de trabajo de multiómica.
- Los pasos clave incluyen la resección del tejido, la homogenización y varios ciclos de centrifugación para aislar los microvasos.
- El rendimiento proteico y la purificación se evalúan mediante inmunotransferencia (Western blot) y ensayos de proteína de Bradford.
Resultados Principales
- Se aislaron y caracterizaron con éxito microvasos intactos para la expresión de proteínas.
- Se confirmó el enriquecimiento de PECAM-1 (CD31) y Glut1 en las preparaciones de microvasos.
- Las concentraciones de proteína generalmente oscilaron entre 5 y 10 mg/mL tras el protocolo.
- Se observó una diferencia notable en la expresión de Glut1 entre ratas macho y hembra.
Conclusiones
- Este estudio proporciona un método confiable para aislar microvasos cerebrales, allanando el camino para investigaciones futuras sobre la barrera hematoencefálica.
- El protocolo mejora la comprensión de la dinámica neurofarmacológica y de la fisiología de la BHE.
- Los conocimientos obtenidos pueden orientar enfoques terapéuticos mejores para las afecciones neurológicas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento de microvasos cerebrales permite la reducción mecanicista de riesgos en dianas terapéuticas del SNC al proporcionar muestras enriquecidas en células endoteliales que reflejan la variabilidad fisiológica. Este método apoya la validación de dianas y el desarrollo de ensayos para estudios de penetración en la barrera hematoencefálica, mejorando la confianza predictiva en la identificación de compuestos líderes. La preparación reproducible de membranas a partir de animales individuales mejora la alineación de biomarcadores traslacionales y la selección de carteras en la investigación y desarrollo de neurofarmacología.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de dianas específicas endoteliales como transportadores y proteínas de uniones estrechas en un sistema relevante para la enfermedad.
- Valor operativo: Proporciona el aislamiento reproducible de microvasos de ratas individuales para capturar la variabilidad interindividual en la expresión de las dianas.
- Valor estratégico: Apoya la prueba de hipótesis y la reducción del riesgo biológico de dianas del SNC antes de la optimización del fármaco líder.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Proporciona muestras de membrana adecuadas para el análisis cuantitativo de la expresión y función de proteínas de la barrera hematoencefálica.
- Valor operativo: Ofrece rendimientos consistentes de proteína (5–10 mg/mL), lo que permite entradas estandarizadas en ensayos para campañas de cribado.
- Valor estratégico: Facilita la preparación de ensayos para evaluar los efectos de compuestos sobre dianas endoteliales en un formato escalable.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la relevancia de la enfermedad mediante el aislamiento de microvasos de modelos en roedores para estudiar las respuestas de la BHE a estímulos farmacológicos.
- Valor operativo: Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica utilizando sistemas biológicos emparejados.
- Valor estratégico: Apoya las decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la confirmación del acoplamiento al objetivo en la BHE.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la validación del blanco hasta la evaluación preclínica, al proporcionar muestras enriquecidas en células endoteliales para estudios mecanicistas.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la aclaración de vías y la confirmación de dianas mediante el enriquecimiento de marcadores microvasculares como PECAM-1 y Glut1.
- Selección: Proporciona muestras reproducibles con resultados cuantificables de proteínas para ensayos de selección de compuestos y de interacción con dianas.
- Análisis: Permite obtener lecturas mediante inmunotransferencia (Western blot) y ensayo de Bradford para comparar la expresión proteica entre diferentes condiciones y sexos.
- Investigación Translacional: Se conecta con trabajos preclínicos mediante el uso de microvasos cerebrales de rata como un sistema relevante para enfermedades en el desarrollo de terapéuticos dirigidos a la barrera hematoencefálica.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de aislamiento reutilizable para múltiples proyectos enfocados en la entrega de fármacos al sistema nervioso central y la modulación de la barrera hematoencefálica.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas en la barrera hematoencefálica.
- Valor operativo: Garantiza la estandarización y la reproducibilidad mediante pasos definidos de centrifugación y enriquecimiento basado en dextrano.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos específicos de células endoteliales que reducen el riesgo biológico en fases tardías de los programas del sistema nervioso central.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas basada en la expresión validada en microvasos cerebrales.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en neuroanatomía y manejo de tejidos para aislar microvasos cerebrales sin contaminación.
- Necesita acceso a equipos de homogenización, centrífugas capaces de alcanzar 5.000 g a 4°C y infraestructura para la preparación de dextrano.
- Exige una estandarización entre equipos del procesamiento de muestras para mantener la consistencia en el rendimiento y la pureza de las proteínas.
- Incluye consideraciones de adaptación al aplicar el método a otras especies o modelos de enfermedad distintos del cerebro de rata.
- Comprende limitaciones prácticas, como la necesidad de mantener las muestras en hielo y evitar la alteración del precipitado durante la aspiración del sobrenadante.
