Evaluar la viabilidad de un consorcio bacteriano sintético en la interfaz de Host-microbio In Vitro Gut

Este modelo es el siguiente paso en el establecimiento de microdirecciones del huésped para el tracto digestivo superior. Está permitiendo abordar cuestiones de investigación mecanicistas y ofrece muchas oportunidades para la industria alimentaria, farmacéutica y nutracéutica, así como para la toxicología. La principal ventaja de esta técnica es que combina un modelo del sistema gastrointestinal con la microinterfaz del huésped, incluyendo una comunidad microbiana compleja.

Es muy aplicable y también es muy flexible. Esta metodología puede adoptarse utilizando otros tipos de células para evaluar la viabilidad del patógeno y la información posterior. Los cambios también se pueden utilizar para ayudar a la capacidad de colonización de las mezclas de probióticos y, en última instancia, al efecto potencial de las bacterias en la circulación sistémica.

Para comenzar, autoclave el medio y luego agregue cinco microgramos por mililitro de hemen y un microgramo por mililitro de menadiona. Dispense nueve mililitros del medio en tubos Hungate y cierre los tubos con un tapón de goma y una tapa de aluminio. A continuación, enjuague los tubos con una mezcla de 90% de nitrógeno y 10% de dióxido de carbono.

Utilice la jeringa para extraer un mililitro de medio anaeróbico y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Elija colonias individuales de cada especie bacteriana y vuelva a suspenderlas en el medio. A continuación, transfiera las colonias al RHI anaeróbico modificado e incube a 37 grados centígrados durante 48 horas.

Después de la incubación, use PBS esterilizado filtrado para diluir los cultivos a 10 a la quinta célula por mililitro. A continuación, utilice la citometría de flujo con la tinción de yoduro de propidio cyber green para medir el número de células. Evaluar la composición y viabilidad de la comunidad del microbioma es esencial para evitar sesgos en nuestro experimento.

Retire el medio de cultivo celular de los matraces, luego use cinco mililitros de PBS sin calcio o magnesio para lavar las células una vez. Agregue dos mililitros de solución de tripsina EDTA a las células. Distribuya la solución moviendo suavemente el matraz.

A continuación, retire 1,5 mililitros de la solución de tripsina e incube el matraz a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Después de comprobar al microscopio si las células se han desprendido, añadir cinco mililitros de medio de cultivo celular suplementado al matraz para inactivar la tripsina, y pipetear hacia arriba y hacia abajo para obtener una suspensión unicelular homogénea. Mezcle inmediatamente una alícuota de 50 microlitros de la suspensión celular con una solución estéril de azul de tripano al 0,4% en una proporción de volumen a volumen de 1:1 para células KCO2 para un volumen de 1:5 a volumen para HT29MTX.

Mezcle mediante pipeteo y cargue la suspensión en una cámara de recuento antes de contar las células bajo el microscopio. Después de preparar las suspensiones de KCO2 y células de HT29MTX de acuerdo con el protocolo de texto, homogeneice las suspensiones y agregue el volumen correspondiente de células de KCO2 y HT29MTX a un recipiente estéril prellenado con medio de cultivo celular suplementado. Aspirar el medio preincubado desde el lado apical de la cámara previamente preparada.

Mezcle suavemente la suspensión celular mediante pipeteo y transfiera 1,5 mililitros al compartimento apical de los insertos de la cámara, mezclando la suspensión celular cada uno a tres pocillos para garantizar una homogeneización constante. Mueva suavemente las placas de un lado a otro y luego de derecha a izquierda para distribuir uniformemente las células en el pocillo. Transfiera las placas a la incubadora y repita el movimiento de las placas.

El asentamiento de las células debe realizarse con una homogeneización constante de la suspensión celular para garantizar una distribución uniforme en el pocillo. Para medir la integridad de la barrera epitelial antes de iniciar el ASA, asegúrese de que el equipo de nivel esté completamente cargado antes de comenzar las mediciones. Desconecte el equipo de nivel de la fuente de alimentación y cúbralo con una bolsa de autoclave de plástico.

Haga un agujero en la bolsa para introducir el electrodo en el puerto de entrada del medidor. A continuación, rocíe la bolsa con etanol al 70% antes de transferir el equipo de nivel al armario de flujo. Para desinfectar el electrodo, sumerja las puntas de los electrodos en etanol al 70% durante 15 minutos.

Deje que las puntas se sequen al aire durante 15 segundos, luego use medio de cultivo celular para enjuagar el electrodo. Permita que las celdas alcancen la temperatura ambiente dentro del gabinete de flujo. Asegúrese de que el medidor esté desconectado del cargador, luego configure el interruptor de modo en Ohmios y encienda el interruptor de encendido.

Mida la resistencia de la celda sumergiendo el electrodo con la punta más corta en el inserto y la punta más larga fuera del pocillo. Mantenga el electrodo en un ángulo de 90 grados con respecto al inserto de la placa. Para simular la digestión oral, transfiera tres mililitros de la comunidad bacteriana en un tubo estéril de 50 mililitros y mezcle con tres mililitros de líquido de saliva simulado o SSF.

Añadir 75 unidades por mililitro de alfa-amilasa de saliva humana tipo 9A y dos gramos por litro de mucina de estómago porcino tipo 2. Incubar la mezcla a 37 grados centígrados y 100 RPM durante dos minutos. Recoger una muestra de dos mililitros para la extracción de ADN y la cuantificación por citometría de flujo.

Para simular la digestión gástrica, agregue cuatro mililitros de líquido gástrico simulado o SGF a tres mililitros de la bacteria. Utilice un molar de HCl para ajustar el pH a tres si es necesario. Incubar la muestra a 37 grados centígrados y 100 RPM durante dos minutos.

A continuación, recoge una muestra de dos mililitros. Para las digestiones del intestino delgado, agregue cuatro mililitros de líquido intestinal simulado o SIF a las bacterias. Use hidróxido de sodio para ajustar el pH si es necesario.

Luego incube la muestra a 37 grados centígrados y 100 RPM durante dos minutos. Y recoge una muestra de dos mililitros. Después de lavar y ajustar la densidad celular de la digestión del intestino delgado de acuerdo con el protocolo de texto, retire el medio apical del sistema transwell y agregue 1,5 mililitros de la suspensión bacteriana.

Co-cultivo del sistema en condiciones generales de cultivo celular durante dos horas. Después de la incubación, mida los valores de los niveles para evaluar la integridad de la barrera epitelial, como se demostró anteriormente en el video. Añadir 0,5 mililitros de n-acetilcisteína de 10 milimolares y HPSS para solubilizar la mucosidad producida por el HT29MTX y recuperar las bacterias adheridas.

Incubar las placas a 37 grados centígrados durante una hora bajo agitación. Recupere el NAC HPSS en un tubo de microcentrífuga y use un mililitro de DPBS para lavar las celdas dos veces. Añada 0,5 mililitros de 0,5%triton-x100 encima de las monocapas y rompa las células pipeteando.

Luego, recupere rápidamente el líquido en vórtice durante un minuto. La velocidad es crucial para evitar dañar las células bacterianas con el detergente. Analice las muestras de acuerdo con el protocolo de texto.

Como se informó aquí, los recuentos de células intactas de cepas individuales eran de aproximadamente 10 a la octava celda por mililitro antes de la creación de la comunidad sintética, mientras que el microcosmos multiespecie contenía más del 90% de células viables durante el establecimiento de la comunidad. Sobre la base de la cuantificación de vivos y muertos, la viabilidad bacteriana disminuye después de cada paso de la digestión como resultado del pH ácido durante el paso gástrico y de las biosales contenidas en los fluidos de digestión del intestino delgado. Las duras condiciones de la digestión del estómago y el intestino delgado pueden convertir las bacterias en células viables, pero no en cultivables, que son bacterias vivas que no crecen ni se dividen.

Como se demuestra en esta figura, las células viables recuperadas de la interfaz mucosa son de color azul en el gráfico de citometría de flujo. Sin embargo, no se observó crecimiento cuando estas muestras de moco se colocaron en el suelo. La fracción en la que las bacterias muestran tasas de viabilidad más altas son los desechos celulares, como lo revela el recuento de placas.

El número de colonias puede ser variable, pero la presencia de bacterias metabólicamente activas se encuentra en las muestras menos diluidas. Después de este desarrollo, esta técnica puede ser utilizada por investigadores de los campos de la nutrigenómica o la farmacomicrobiómica para estudiar microcósmicamente al huésped. Siguiendo este protocolo, se pueden realizar otras técnicas como el transcriptoma o el análisis metabólico para obtener una comprensión mecanicista en el proceso de colonización exitoso en consecuencia.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo establecer un modelo in vitro complejo representativo de los procesos digestivos, incluida la comunicación cruzada entre las células huésped y el resto del microbioma. No olvide que trabajar con bacterias patógenas puede ser extremadamente peligroso, y es importante tener en cuenta las precauciones de bioseguridad.