Name: Evaluar la viabilidad de un consorcio bacteriano sintético en la interfaz de Host-microbio In Vitro Gut (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Aprende a evaluar interacciones hospedador-microbio intestinal usando un modelo in vitro con comunidad bacteriana sintética. Este método permite estudiar invasión de patógenos y viabilidad de probióticos.

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Los autores reconocen con gratitud el apoyo financiero de la Fundación de investigación de Flandes a Marta Calatayud Arroyo (FWO postdoctoral fellowship-12N2815N). Emma Hernandez-Sanabria es una beca posdoctoral apoyada por Flandes innovación y emprendimiento (Agentschap voor innovadores puerta Wetenschap en Technologie, IWT).

<ol><li>Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+estimates+for+the+number+of+human+and+bacteria+cells+in+the+body%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body.</a> PLoS Biology. 14, e1002533(2016).</li>
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<li>Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+normal+bacterial+flora+of+the+oral+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Defining the normal bacterial flora of the oral cavity.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43, 5721-5732 (2005).</li>
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<li>Yamashita, Y., Takeshita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oral+microbiome+and+human+health%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Science%22%5BJournal%5D)">The oral microbiome and human health.</a> Journal of Oral Science. 59, 201-206 (2017).</li>
<li>Wade, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oral+microbiome+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">The oral microbiome in health and disease.</a> Pharmacological Research. 69, 137-143 (2013).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+resource+for+cell+line+authentication%2C+annotation+and+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A resource for cell line authentication, annotation and quality control.</a> Nature. 520, 307(2015).</li>
<li>Pelaseyed, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mucus+and+mucins+of+the+goblet+cells+and+enterocytes+provide+the+first+defense+line+of+the+gastrointestinal+tract+and+interact+with+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The mucus and mucins of the goblet cells and enterocytes provide the first defense line of the gastrointestinal tract and interact with the immune system.</a> Immunological Reviews. 260, 8-20 (2014).</li>
<li>Bengoa, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simulated+gastrointestinal+conditions+increase+adhesion+ability+of+Lactobacillus+paracasei+strains+isolated+from+kefir+to+Caco-2+cells+and+mucin%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Research+International%22%5BJournal%5D)">Simulated gastrointestinal conditions increase adhesion ability of Lactobacillus paracasei strains isolated from kefir to Caco-2 cells and mucin.</a> Food Research International. 103, 462-467 (2018).</li>
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<li>Laparra, J. M., Sanz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+in+vitro+models+to+study+bacterial+adhesion+to+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of in vitro models to study bacterial adhesion to the intestinal epithelium.</a> Letters in Applied Microbiology. 49, 695-701 (2009).</li>
<li>Gagnon, M., Berner, A. Z., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+Caco-2%2C+HT-29+and+the+mucus-secreting+HT29-MTX+intestinal+cell+models+to+investigate+Salmonella+adhesion+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion.</a> Journal of Microbiological Methods. 94, 274-279 (2013).</li>
<li>Großkopf, T., Soyer, O. S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369527414000198">Synthetic microbial communities.</a> Current Opinion in Microbiology. 18, 72-77 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

El microbioma oral es un elemento clave en la salud humana reportada recientemente por varios autores20,21. Los resultados anteriores sugieren que la ingestión de saliva, que contiene grandes cargas de bacterias puede influir en el ecosistema microbiano del intestino, que es uno de los sitios principales para oscurecimiento inmunológico. La combinación de un modelo de digestión gastrointestinal superior estático con la interfaz de anfitrión, representado por las ...

Los seres humanos conviven con las bacterias, que están presentes en el mismo número que las células humanas1. Por lo tanto, es de crucial importante obtener un conocimiento integral del microbioma humano. La cavidad bucal es un entorno único en que se divide en varios hábitats más pequeño, así que contiene una gran variedad de bacterias y biofilms en los diferentes lugares. Ser un ecosistema abierto, algunas especies en la boca pueden ser visitantes transitorios. Sin embargo, ciertos microorganismos colonicen pronto después de nacimiento y forma organizan de biofilms2. Estas se encuentran en la superficie de los dientes por encima de la grieta gingival, la grieta subgingival, lengüeta, superficies de la mucosa y prótesis dentales y rellenos3. Las bacterias también pueden estar presentes como flóculos y células planctónicas en el lumen del conducto del diente, entremezcladas con tejido pulpar necrótico o suspendidas en una fase fluida.
Existe una activo, continua interferencia entre las células del huésped y la microbiota residente4. Las bacterias se comunican dentro de y entre especies, y sólo una pequeña proporción de los colonizadores naturales puede adherirse a los tejidos, mientras que otras bacterias se conecte a estos colonizadores primarios. Por ejemplo, Unión célula-célula entre microorganismos es clave para la integración de colonizadores secundarios en biofilms orales y construcción de redes complejas de interacción de las células microbianas de4. Alrededor del 70% de agregados bacterianos en una muestra de saliva se forman por Porphyromonas SP., Streptococcus SP., Prevotella SP, Veillonella SP. y no identificado Bacteroidetes. F. nucleatum es un colonizador intermedio en la biopelícula subgingival y agregados con los colonizadores finales p. gingivalis, T. denticola y Tannerella forsythia, que están implicados en la periodontitis5. Además, Streptococcus mitis ocupa hábitats de mucosa y dentales, mientras que S. sanguinis y S. gordonii prefieren colonizar los dientes3. Así, S. sanguinis está presente en incisivos inferiores y caninos, mientras que el Actinomyces naeslundii se ha encontrado en dientes anteriores superiores6.
Además, lo indígenas microbioma juega un papel en el mantenimiento de la salud2. Microbiota residente participa en la educación inmune y en la prevención de la expansión de patógenos. Esta resistencia a la colonización se produce porque las bacterias nativas pueden ser mejor adaptado en la fijación a las superficies y más eficiente en metabolizar los nutrientes disponibles para el crecimiento. Aunque cepas probióticas sobreviven el paso gastrointestinal y permanecen activas, la persistencia de las bacterias autóctonas que se ingiere desde una ubicación superior del tracto gastrointestinal no se ha descrito completamente. Por lo tanto, sometimos a una comunidad artificial, representante del ecosistema oral, a las condiciones del tránsito gastrointestinal simulada. Viabilidad de las células bacterianas se evaluó mediante un modelo multicompartment que se asemeja al epitelio intestinal. Simuladores de tripa actual ofrecen reproducibilidad adecuada en términos de análisis de la comunidad microbiana luminal7. Sin embargo, adherencia bacteriana e interacción microbio host son por separado dirigidas, como la combinación de líneas celulares con comunidades microbianas es un reto8. Por el contrario, presentamos un marco que proporciona la explicación mecanicista potencial de colonización exitosa eventos registrados en la interfaz de la tripa. De hecho, este modelo puede conjuntamente utilizar con un modelo estático de la tripa para evaluar el impacto de las comunidades microbianas en señalización de superficie de host.

<table><tbody><tr><td><fuertes>CEPAS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aggregatibacter actinomycetemcomitans </td><td>American Type Culture</td><td>Collection ATCC 43718</td><td></td></tr><tr><td>Fusobacterium nucleatum </td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 10953</td><td></td></tr><tr><td>Porphyromonas gingivalis </td><td>American Type Culture Colección</td><td>ATCC 33277</td><td></td></tr><tr><td>Prevotella intermedia </td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 25611</td><td></td></tr><tr><td>Streptococcus mutans </td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 25175</td><td></td></tr><tr><td>Streptococcus sobrinus </td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 33478</td><td></td></tr><tr><td>Actinomyces viscosa </td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 15987</td><td></td></tr><tr><td>Streptococcus salivarius&nbsp; TOVE-R</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptococcus mitis </td><td>American Colección de cultivos</td><td>tipo ATCC 49456</td><td></td></tr><tr><td>Streptococcus sanguinis </td><td>BCCM/LMG Colección de bacterias</td><td>LMG 14657</td><td></td></tr><tr><td>Veillonella parvula </td><td>Instituto Leibniz DSMZ-Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares DSM</td><td>2007</td><td></td></tr><tr><td>Streptococcus gordonii </td><td>Colección de Cultivos Tipo Americanos</td><td>ATCC 49818</td><td></td></tr><tr><td><LÍNEAS >CELULARES FUERTES</células ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caco-2</td><td>fuertes Colección Europea de Cultivos Celulares Autentificados</td><td>86010202</td><td></td></tr><tr><td>células HT29-MTX</td><td>Colección Europea de Cultivos Celulares Autentificados</td><td>12040401</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>REACTIVOS Y CONSUMIBLES</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brain Caldo de infusión de corazón (BHI)</td><td>Oxoid</td><td>CM1135</td><td></td></tr><tr><td>Agar Sangre 2</td><td>Oxoid</td><td>CM0055</td><td>Medio Agar Sangre</td></tr><tr><td>Menadione</td><td>Sigma</td><td>M9429</td><td></td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Sigma</td><td>H9039</td><td></td></tr><tr><td>5% sangre de caballo estéril desfibrilada</td><td>E& O Laboratories</td> <td>Ltd,P030</td><td></td></tr><tr><td>InnuPREP PCRpure Kit</td><td>Analytik Jena</td><td>845-KS-5010250</td><td>Kit de purificación de PCR</td></tr><tr><td>Big Dye</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>4337454 Dye para secuenciación ABI</td></tr><tr><td>Prism BigDye Terminator v3.1 kit de secuenciación de ciclo</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337456</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&nbsp; Green I</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td></td></tr><tr><td>Iduro de propidio</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>T25 matraces de cultivo sin recubrimiento, tratados con cultivo celular, ventilados, estériles</td><td>VWR</td><td>734-2311</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tripsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3924-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Trypan Blue 0,4%, líquido, filtrado estéril</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Medios de cultivo celular DMEM, con tecnologías GlutaMAX y Pyruvate</td><td>Life</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>Insertos de cultivo celular de membrana de poliéster Corning Transwell</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3450-24EA</td><td></td></tr><tr><td>Mucina de estómago porcino Tipo II&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2378</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino inactivado</td><td>Greiner Bio One</td><td>758093</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico (100X)</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100 para biología molecular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DPBS sin calcio, magnesio</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Pierce LDH Kit de ensayo de citotoxicidad</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88953</td><td></td></tr><tr><td>Corning HTS Transwell-24 pozo, tamaño de poro 0,4 y micro; m</td><td>Corning Costar Corp</td><td>3450</td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasas</td><td>Electroforesis Serva</td><td>28539010</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td>Neubauer cámara de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>conteo mejorada</td><td>Carl Roth</td><td>T729.1</td><td></td></tr><tr><td>BD Accuri C6 Citómetro de flujo</td><td>BD Biosciences</td><td>653118</td><td></td></tr><tr><td>PowerLyzer 24 Homogeneizador</td><td>MoBio</td><td>13155</td><td></td></tr><tr><td>T100 Termociclador</td><td>BioRad</td><td>186-1096</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de descarga</td><td>a</td> <td>medida-InnOva</td> 4080 Incubadora Agitador New <td></td></tr><tr><td></td><td>Brunswick Scientific</td><td>8261-30-1007</td><td>Agitador para incubadora</td></tr><tr><td>Memmert CO2</td><td>Memmert GmbH & Co.</td><td>ICO150med</td><td></td></tr><tr><td>Millicell ERS (Sistema de Resistencia Eléctrica)</td><td>EMD Millipore, Merck KGaA</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Millipore Milli-Q academic, sistema de agua ultra pura</td><td>Millipore, Merck KGaA-Shaker</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(ROCKER 3D basic)</td><td>IKA</td><td>4000000</td><td>Shaker para 6.10</td></tr></tbody></table>

evaluar la viabilidad de un consorcio bacteriano sintético en la interfaz de host-microbio in vitro gut

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

La interacción entre huésped y microbiota ha sido reconocida desde hace mucho y ampliamente descrito. La boca es similar a otras secciones del tracto gastrointestinal, como microbiota residente se produce y evita la colonización por bacterias exógenas. De hecho, más de 600 especies de bacterias se encuentran en la cavidad bucal, y una sola persona puede llevar alrededor de 100 diferentes en cualquier momento. Bacterias orales poseen la capacidad de adherirse a los diferentes nichos en el ecosistema oral, integrándose así dentro de las comunidades microbianas residente y que favorece crecimiento y supervivencia. Sin embargo, se ha propuesto el flujo de bacterias en el intestino durante la ingestión de perturbar el equilibrio de la microbiota intestinal. De hecho, la administración oral de p. gingivalis cambió de puesto la composición bacteriana en la microflora ileal. Utilizamos una comunidad sintético como una representación simplificada del ecosistema oral natural, a la supervivencia y viabilidad de bacterias orales sometidos a condiciones de tránsito gastrointestinal simulada. Catorce especies fueron seleccionadas sometidas a en vitro salival, gástrica y procesos de la digestión intestinal y presentó a un modelo de multicompartment de la célula que contiene las células Caco-2 y HT29-MTX para simular el epitelio de la mucosa intestinal. Este modelo sirve para desentrañar el impacto de bacterias ingeridas en células que participan en la circulación enterohepática. Utilizando las comunidades sintéticas permite la capacidad de control y reproducibilidad. Por lo tanto, esta metodología puede ser adaptada para evaluar viabilidad del patógeno y la subsecuentes inflamación asociados cambios, capacidad de colonización de las mezclas de probióticos, y en última instancia, bacteriana potencial impacto en la circulación presistémica.

Este protocolo conduce a la generación de un modelo adecuado para elucidar la supervivencia y viabilidad de bacterias orales sometidos a condiciones de tránsito gastrointestinal simulada. Las cuentas de las células intactas de cepas individuales es de aproximadamente 108 células antes de mL-1 la creación de la comunidad sintético, mientras que el multiespecífico microcosmos contenido sobre el 90% de células viables durante el establecimiento de la comunidad ( <strong...

Interacciones de host-microbio intestinal fueron evaluadas usando un nuevo enfoque que combina una comunidad oral sintético, en vitro la digestión gastrointestinal y un modelo del epitelio del intestino delgado. Presentamos un método que puede ser adaptado para evaluar invasión celular de patógenos y biofilms multiespecies, o incluso para probar la supervivencia de las formulaciones probióticas.

Evaluar la viabilidad de un consorcio bacteriano sintético en la interfaz de Host-microbio In Vitro Gut

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Este modelo es el siguiente paso en el establecimiento de microdirecciones del huésped para el tracto digestivo superior. Está permitiendo abordar cuestiones de investigación mecanicistas y ofrece muchas oportunidades para la industria alimentaria, farmacéutica y nutracéutica, así como para la toxicología. La principal ventaja de esta técnica es que combina un modelo del sistema gastrointestinal con la microinterfaz del huésped, incluyendo una comunidad microbiana compleja.Es muy aplicable y también es muy flexible. Esta metodología puede adoptarse utilizando otros tipos de células para evaluar la viabilidad del patógeno y la información posterior. Los cambios también se pueden utilizar para ayudar a la capacidad de colonización de las mezclas de probióticos y, en última instancia, al efecto potencial de las bacterias en la circulación sistémica.Para comenzar, autoclave el medio y luego agregue cinco microgramos por mililitro de hemen y un microgramo por mililitro de menadiona. Dispense nueve mililitros del medio en tubos Hungate y cierre los tubos con un tapón de goma y una tapa de aluminio. A continuación, enjuague los tubos con una mezcla de 90% de nitrógeno y 10% de dióxido de carbono.Utilice la jeringa para extraer un mililitro de medio anaeróbico y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Elija colonias individuales de cada especie bacteriana y vuelva a suspenderlas en el medio. A continuación, transfiera las colonias al RHI anaeróbico modificado e incube a 37 grados centígrados durante 48 horas.Después de la incubación, use PBS esterilizado filtrado para diluir los cultivos a 10 a la quinta célula por mililitro. A continuación, utilice la citometría de flujo con la tinción de yoduro de propidio cyber green para medir el número de células. Evaluar la composición y viabilidad de la comunidad del microbioma es esencial para evitar sesgos en nuestro experimento.Retire el medio de cultivo celular de los matraces, luego use cinco mililitros de PBS sin calcio o magnesio para lavar las células una vez. Agregue dos mililitros de solución de tripsina EDTA a las células. Distribuya la solución moviendo suavemente el matraz.A continuación, retire 1,5 mililitros de la solución de tripsina e incube el matraz a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Después de comprobar al microscopio si las células se han desprendido, añadir cinco mililitros de medio de cultivo celular suplementado al matraz para inactivar la tripsina, y pipetear hacia arriba y hacia abajo para obtener una suspensión unicelular homogénea. Mezcle inmediatamente una alícuota de 50 microlitros de la suspensión celular con una solución estéril de azul de tripano al 0,4% en una proporción de volumen a volumen de 1:1 para células KCO2 para un volumen de 1:5 a volumen para HT29MTX.Mezcle mediante pipeteo y cargue la suspensión en una cámara de recuento antes de contar las células bajo el microscopio. Después de preparar las suspensiones de KCO2 y células de HT29MTX de acuerdo con el protocolo de texto, homogeneice las suspensiones y agregue el volumen correspondiente de células de KCO2 y HT29MTX a un recipiente estéril prellenado con medio de cultivo celular suplementado. Aspirar el medio preincubado desde el lado apical de la cámara previamente preparada.Mezcle suavemente la suspensión celular mediante pipeteo y transfiera 1,5 mililitros al compartimento apical de los insertos de la cámara, mezclando la suspensión celular cada uno a tres pocillos para garantizar una homogeneización constante. Mueva suavemente las placas de un lado a otro y luego de derecha a izquierda para distribuir uniformemente las células en el pocillo. Transfiera las placas a la incubadora y repita el movimiento de las placas.El asentamiento de las células debe realizarse con una homogeneización constante de la suspensión celular para garantizar una distribución uniforme en el pocillo. Para medir la integridad de la barrera epitelial antes de iniciar el ASA, asegúrese de que el equipo de nivel esté completamente cargado antes de comenzar las mediciones. Desconecte el equipo de nivel de la fuente de alimentación y cúbralo con una bolsa de autoclave de plástico.Haga un agujero en la bolsa para introducir el electrodo en el puerto de entrada del medidor. A continuación, rocíe la bolsa con etanol al 70% antes de transferir el equipo de nivel al armario de flujo. Para desinfectar el electrodo, sumerja las puntas de los electrodos en etanol al 70% durante 15 minutos.Deje que las puntas se sequen al aire durante 15 segundos, luego use medio de cultivo celular para enjuagar el electrodo. Permita que las celdas alcancen la temperatura ambiente dentro del gabinete de flujo. Asegúrese de que el medidor esté desconectado del cargador, luego configure el interruptor de modo en Ohmios y encienda el interruptor de encendido.Mida la resistencia de la celda sumergiendo el electrodo con la punta más corta en el inserto y la punta más larga fuera del pocillo. Mantenga el electrodo en un ángulo de 90 grados con respecto al inserto de la placa. Para simular la digestión oral, transfiera tres mililitros de la comunidad bacteriana en un tubo estéril de 50 mililitros y mezcle con tres mililitros de líquido de saliva simulado o SSF.Añadir 75 unidades por mililitro de alfa-amilasa de saliva humana tipo 9A y dos gramos por litro de mucina de estómago porcino tipo 2. Incubar la mezcla a 37 grados centígrados y 100 RPM durante dos minutos. Recoger una muestra de dos mililitros para la extracción de ADN y la cuantificación por citometría de flujo.Para simular la digestión gástrica, agregue cuatro mililitros de líquido gástrico simulado o SGF a tres mililitros de la bacteria. Utilice un molar de HCl para ajustar el pH a tres si es necesario. Incubar la muestra a 37 grados centígrados y 100 RPM durante dos minutos.A continuación, recoge una muestra de dos mililitros. Para las digestiones del intestino delgado, agregue cuatro mililitros de líquido intestinal simulado o SIF a las bacterias. Use hidróxido de sodio para ajustar el pH si es necesario.Luego incube la muestra a 37 grados centígrados y 100 RPM durante dos minutos. Y recoge una muestra de dos mililitros. Después de lavar y ajustar la densidad celular de la digestión del intestino delgado de acuerdo con el protocolo de texto, retire el medio apical del sistema transwell y agregue 1,5 mililitros de la suspensión bacteriana.Co-cultivo del sistema en condiciones generales de cultivo celular durante dos horas. Después de la incubación, mida los valores de los niveles para evaluar la integridad de la barrera epitelial, como se demostró anteriormente en el video. Añadir 0,5 mililitros de n-acetilcisteína de 10 milimolares y HPSS para solubilizar la mucosidad producida por el HT29MTX y recuperar las bacterias adheridas.Incubar las placas a 37 grados centígrados durante una hora bajo agitación. Recupere el NAC HPSS en un tubo de microcentrífuga y use un mililitro de DPBS para lavar las celdas dos veces. Añada 0,5 mililitros de 0,5%triton-x100 encima de las monocapas y rompa las células pipeteando.Luego, recupere rápidamente el líquido en vórtice durante un minuto. La velocidad es crucial para evitar dañar las células bacterianas con el detergente. Analice las muestras de acuerdo con el protocolo de texto.Como se informó aquí, los recuentos de células intactas de cepas individuales eran de aproximadamente 10 a la octava celda por mililitro antes de la creación de la comunidad sintética, mientras que el microcosmos multiespecie contenía más del 90% de células viables durante el establecimiento de la comunidad. Sobre la base de la cuantificación de vivos y muertos, la viabilidad bacteriana disminuye después de cada paso de la digestión como resultado del pH ácido durante el paso gástrico y de las biosales contenidas en los fluidos de digestión del intestino delgado. Las duras condiciones de la digestión del estómago y el intestino delgado pueden convertir las bacterias en células viables, pero no en cultivables, que son bacterias vivas que no crecen ni se dividen.Como se demuestra en esta figura, las células viables recuperadas de la interfaz mucosa son de color azul en el gráfico de citometría de flujo. Sin embargo, no se observó crecimiento cuando estas muestras de moco se colocaron en el suelo. La fracción en la que las bacterias muestran tasas de viabilidad más altas son los desechos celulares, como lo revela el recuento de placas.El número de colonias puede ser variable, pero la presencia de bacterias metabólicamente activas se encuentra en las muestras menos diluidas. Después de este desarrollo, esta técnica puede ser utilizada por investigadores de los campos de la nutrigenómica o la farmacomicrobiómica para estudiar microcósmicamente al huésped. Siguiendo este protocolo, se pueden realizar otras técnicas como el transcriptoma o el análisis metabólico para obtener una comprensión mecanicista en el proceso de colonización exitoso en consecuencia.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo establecer un modelo in vitro complejo representativo de los procesos digestivos, incluida la comunicación cruzada entre las células huésped y el resto del microbioma. No olvide que trabajar con bacterias patógenas puede ser extremadamente peligroso, y es importante tener en cuenta las precauciones de bioseguridad.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

El diseño de un operón que codifica sintético tanto el aparato secretor y los monómeros estructurales de fibras curli se describe. La sobreproducción de estos amiloides y polímeros adherentes permite una ganancia apreciable de adhesión de...

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Fuente: Calatayud Arroyo, M., et al. Evaluación de la viabilidad de un consorcio bacteriano sintético en la interfaz intestino-microbio in vitro. J. Vis. Exp. (2018).Este vídeo demuestra un modelo intestino-microbio in vitro para estudiar la viabilidad bacteriana. Se incuba un cocultivo de células Caco-2 y HT29-MTX con bacterias pretratadas bajo condiciones digestivas simuladas. Se evalúa la integridad de la barrera epitelial utilizando resistencia eléctrica transepitelial, y se recogen...

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