Ex Vivo Proyección de imagen de calcio para la visualización de las respuestas cerebrales a la señalización endocrina en Drosophila

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la endocrinología, así como en el campo de la neurociencia, como nuestra investigación para revisar las respuestas del cerebro a las señales endocrinas. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden examinar los efectos directos de las señales endocrinas en el cerebro separado de otros tejidos. Para comenzar este procedimiento, use fórceps para rascar el centro inferior de un plato de cultivo de plástico para crear una abolladura para facilitar el montaje del ganglio ventral del cerebro de la larva después de la disección.

Con un palillo, coloca una pequeña gota de superpegamento a cada lado de la abolladura y une una varilla de tungsteno al pegamento. Luego, usando un pequeño trozo de adhesivo reutilizable similar a la masilla, haga una pared circular alrededor de la abolladura. Para diseccionar el cerebro de las larvas, de 90 a 120 horas después de la puesta de huevos, recoja las larvas y lávelas al menos tres veces con agua destilada para eliminar los restos de comida adheridos.

A continuación, coloque una larva en un vidrio de reloj cuadrado de una pulgada y media lleno de PBS helado. Usa un par de pinzas para agarrar suavemente la parte media de la larva. Use otro par de pinzas para agarrar y tirar de los ganchos bucales suavemente para separar la parte anterior de la larva que contiene el cerebro del resto del cuerpo.

Luego, sostenga la punta anterior con las pinzas y voltee la larva al revés. Extirpar los tejidos extraños adheridos al cerebro, como los discos imaginales, los cuerpos grasos y las glándulas anulares. Separe suavemente el cerebro de las partes de la boca.

A continuación, aplique 200 microlitros de PBS en el interior del anillo adhesivo preparado anteriormente en la cámara de imagen. Succionar suavemente el cerebro diseccionado con PBS en una pipeta Pasteur y transferirlo a la cámara de imágenes. En la cámara de imágenes, agarre las fibras musculares que se extienden desde los ganglios ventrales e inserte el cerebro suavemente en la hendidura debajo del alambre de tungsteno.

Luego, tire del alambre de tungsteno ligeramente hacia arriba para colocar el cerebro en la posición correcta para la toma de imágenes. Para adquirir imágenes de fluorescencia de calcio, coloque la cámara de imágenes que contiene el explante cerebral bajo el microscopio. Baje la lente del objetivo hasta que toque el PBS y, bajo iluminación de campo claro, coloque el cerebro y enfóquelo.

Cambie a luz fluorescente y ajuste el enfoque en las celdas etiquetadas como exitosas de GCaMP. Inicie la adquisición a 250 ms/fotograma, a una resolución de 512 x 512 píxeles en modo refrigerado por agua. A continuación, ajuste el tiempo de exposición para obtener los valores de fluorescencia dentro del rango dinámico de la cámara CCD, pero no inferior a 1000 unidades arbitrarias con imágenes de 16 bits.

Una vez determinados los parámetros de imagen, se deben tomar las imágenes durante un minuto antes de la administración del péptido para detectar las intensidades de señal basales. A continuación, se aplica el péptido problema directamente, pipeteando 100 microlitros de la solución peptídica preparada en el baño larval. Registre la emisión de éxito de GCaMP durante unos minutos.

Para analizar los datos, abra el software de análisis y utilice el primer fotograma que estaba antes de la aplicación del péptido como imagen de referencia. A continuación, seleccione Plugins, TurboReg. Elija el archivo de imagen de serie como Origen y la imagen de referencia como Destino.

A continuación, verifique Cuerpo rígido y Preciso para el método de procesamiento y la calidad, respectivamente. A continuación, haga clic en Lote para iniciar el procesamiento de la imagen. Seleccione varias regiones de interés mediante Analizar, Herramientas, Administrador de ROI, en la bandeja de imágenes.

A continuación, mida la intensidad de los píxeles haciendo clic en Más, Multimedida, Aceptar, en la ventana del Administrador de ROI. En este experimento, el cerebro de tipo salvaje fue expuesto a CCHa2, grelina y nociceptina, mientras que el cerebro mutante del receptor CCHa2 fue expuesto a CCHa2. Las señales de GCaMP6 en las células productoras de insulina se detectaron mediante microscopía confocal a 250 ms/fotograma, y aquí están las imágenes fijas de los puntos de tiempo seleccionados.

Se trazó la relación entre el cambio de la intensidad del ROI y la intensidad de la señal de referencia en cada punto de tiempo. Los ROI se establecieron en cuerpos celulares que se detectaron en el mismo plano focal. Las líneas continuas indican la media de cinco a 10 muestras, y las líneas punteadas marcan los límites superior e inferior del error estándar de la media.

Las áreas sombreadas indican la variación de las señales en los experimentos. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una hora, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar preparar la muestra de cerebro rápidamente, para evitar dañarla.

Este procedimiento se puede combinar con la genética para responder a preguntas adicionales, como la especificidad del receptor. El sistema utilizado en este protocolo es fácil de preparar y reutilizable. Por lo tanto, este protocolo será útil, al igual que en el cribado.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la endocrinología y la neurociencia exploraran las redes hormonales que controlan la función cerebral en Drosophila.