Name: Una gotita-enfoque basado en microfluidos y amplificación por PCR de microesfera para amplicones de ADN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Aprende a fabricar plataformas microfluídicas basadas en gotitas con microesferas de poliacrilamida para amplificación PCR. Este método genera ADN monocatenario sin separación adicional, útil para diagnóstico y terapia de enfermedades.

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Este estudio es apoyado por un proyecto titulado "programa investigación cooperativa de agricultura ciencia y tecnología desarrollo (proyecto no. PJ0011642) "financiado por la dirección de Desarrollo Rural, República de Corea. Esta investigación fue apoyada también en parte por una subvención (NRF-2017R1A2B4012253) del programa de investigación en ciencia básica a través de la Fundación Nacional de investigación (NRF) financiado por el Ministerio de ciencia, TIC y planeación de futuro, República de Corea. Esta investigación también fue apoyada por una beca (N0000717) del programa de educación creativa y convergencia Industrial financiado por el Ministerio de comercio, industria y energía, República de Corea.

1. fabricación de una plataforma de microfluídica PDMS
<ol><li>Prepare 20 mL de líquido prepolímero PDMS mezclando polímero base y catalizador en una proporción de volumen de 10:1. Vierta 10 mL de líquido PDMS en un molde de SU-8 preparado sobre una oblea de silicio en la parte superior de la red de microfluidos. Para la parte plana del fondo, vierta el mismo volumen de líquido PDMS en la oblea de silicio sin estructura de molde. Nota: La red de microfluidos es diseñada en un programa CAD y luego se convierte en un photomask para fabricar a un maestro mediante el proceso de fotolitografía típico (ver Figuras suplementales). Este máster está compuesto por el photoresist negativo 8 SU molde en la oblea de silicio11.</li>
	<li>Coloque dos obleas de silicio cubiertas con líquido prepolímero PDMS en la placa y la curación a 75 ° C durante 30 minutos.<ol>
<li>Retire manualmente la capa PDMS curada del molde de SU-8. Alinear un diámetro 1,5 mm redondo agujero troqueladora para el puerto petrolero en la red de microfluidos replicada para interfaces de canales de flujo de microescala con las muestras de líquido de la macro. Perfore el agujero a través de manualmente.</li>
		<li>Repita este proceso tres veces para la formación de las dos soluciones y el orificio de salida de la perforación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar tratamiento superficial hidrofílica en la parte superior y capas PDMS de fondo usando un hand-held corona treater12 durante varios segundos por muestra.<ol>
<li>Apilar dos tratados con plasma capas PDMS y la calor a 90 ° C durante 30 minutos utilizando un plato caliente para el proceso de vinculación de PDMS-PDMS. Suministrar el agua a presión mediante la bomba de jeringa en tres puertos de entrada para la vinculación estructural y pruebas de fugas del dispositivo fabricado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. producción de Oligo-microesferas de poliacrilamida
<ol><li>Preparar mezcla de grano detallada en la tabla 1.</li>
	<li>Vórtice y brevemente centrífuga la acrydite ssDNA estándar etiquetados como sonda (Ap, 100 μM) y acrylamide:bis (19:1) solución.</li>
	<li>Preparar la solución que mezclando 25 μL de 40% acrilamida bis solución, 10 μL de ssDNA (punta de prueba de acrydite), 10 μL de tampón de x TBE 5 (1,1 M Tris, borato de 900 mM, 25 mM EDTA) y 5 μL de agua. Preparar la solución II con 50 μL de persulfato de amonio 20%.</li>
	<li>Preparar dos jeringas individualmente lleno de solución de solución II y I y montarlos en la bomba para introducir flujos de solución en la plataforma de microfluidos. Preparar aceite mineral mezclado con 0.4% TEMED por solidificación superficial de la microesfera. Nota: TEMED es conocida como un estabilizador de radicales libres. Los radicales libres pueden acelerar la velocidad de formación de polímero con persulfato de amonio (APS) para catalizar la polimerización de la acrilamida.</li>
	<li>Llenar un frasco con 4 mL de aceite mineral para generar un flujo continuo.</li>
	<li>Inserte dos tubos a dos puertos en la tapa de la botella de vidrio como un reservorio de microfluidos: el puerto neumático para aplicar el aire comprimido en la botella de vidrio del compresor de aire y el puerto de fluido para suministrar el aceite a presión a la red de canal micro de la botella de vidrio. Conectar tubos entre la botella de vidrio y el puerto petrolero en el dispositivo de microfluidos.<ol>
<li>Conectar los tubos a los puertos de dos solución en el dispositivo de microfluidos para suministrar las soluciones de dos de las bombas de jeringa. Introduzca los tubos en el puerto de salida para transferir la microesfera generada en el vaso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fijar el caudal de la bomba de jeringa a presión 0,4 - 0,7 mL/h. ajustar del aire comprimido del compresor con el regulador (82-116 kPa). Fijar las revoluciones (500 rpm) de la barra de agitador magnético en el vaso de vidrio sobre una placa caliente. Accione la bomba de jeringa y suministrar el aire comprimido generado por un compresor externo dentro de la botella de vidrio con el control ON/OFF de una válvula electromagnética13.</li>
	<li>Observar la formación de microesferas en el enfoque de flujo de geometría y solidificación de microesferas generadas en el vaso de vidrio con un microscopio digital. Nota: La velocidad de producción y tamaño de la microesfera dependen del caudal de soluciones y la presión para el flujo de aceite mineral (tabla 2).
</li>
</ol>3. realización de Oligo-microesferas de poliacrilamida cuenta
<ol><li>Para la cuantificación del hemocitómetro, tome una pequeña cantidad (aproximadamente 100 μL) de solución acuosa de oligo-microesferas de poliacrilamida y el lugar en el hemocitómetro de vidrio y rellenar suavemente la suspensión de microesferas hasta el pozo de la cámara de conteo. Nota: Para obtener más información, consulte http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer.</li>
	<li>Utilizar un microscopio y la mano de contador-registrador para contar las microesferas en un conjunto de 16 plazas. Luego, mueva el hemocitómetro para el siguiente conjunto de la cámara y continuar contando hasta que se cuentan todos los conjuntos de cuatro esquinas 16.</li>
	<li>Determinar el recuento de microesferas promedio y calcular el número de microesferas en la suspensión original del grano.</li>
	<li>Transfiera 100 μL de microesferas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Quite el sobrenadante a través de centrifugación (400 x g) y pipeteo suave.</li>
</ol>4. realizar hibridación de ADN en la superficie del Oligomicrosphere de poliacrilamida
Nota: Una misma sonda de ADN con un 5'-NH2-grupo en lugar de 5'-acrytide modificación es agregado en solución I y probados para las microesferas que contienen Ap en paralelo. Resultados de hibridación de DNA se muestran en la figura 2. La solución de oligonucleótidos complementarios marcado con Cy3 sondas (PAC) debe colocarse en un cuarto oscuro.
<ol><li>Resuspender con 100 μL de tampón de 1xTE Cy3-cAp (tampón TE: 10 mM Tris y 1μM de EDTA, pH 8.0) con el fin de lograr una concentración final de 100 μM. Por ejemplo, resuspender 1 pmol de PAC en 100 mL de buffer TE y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga cubierto con papel de aluminio. Nota: Para las secuencias de la cadena, consulte la tabla 3.</li>
	<li>Añadir 100 μM de Cy3-cAp a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL estéril que contiene microesferas copolymerized Ap.</li>
	<li>Golpee el tubo varias veces para mezclar e incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 1 hora.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y elimine el tampón residual a través de pipeteo.</li>
	<li>Enjuague tres veces con 500 μL de tampón TE.</li>
	<li>Suspender microesferas golpeando suavemente el tubo de microcentrífuga. A continuación, repita el paso 4.4.</li>
	<li>Coloque las microesferas en el portaobjetos de vidrio (75 mm x 50 m m) y cubierta con papel de aluminio antes de la proyección de imagen.</li>
</ol>5. asimétrico PCR para amplificar ssDNA
<ol><li>Preparar una mezcla asimétrica de reactivos PCR para la amplificación de ssDNA a analizar. Descongelar los reactivos en la tabla 4 en el hielo. No mantenga la enzima polimerasa de Taq (50 U/μL) en el hielo, pero más bien almacenarlo a-20 ° C hasta que se necesite.</li>
	<li>Vórtice suavemente todos los reactivos y entonces brevemente centrifugar los tubos a 10.000 x g durante 10 s.</li>
	<li>Todos los reactivos se combinan como se describe en cuadro 4.
</li>
	<li>Coloque las muestras en un termociclador y comenzar la PCR asimétrica bajo las siguientes condiciones: 25 ciclos (95 ° C por 30 s, 52 ° C por 30 s y 72 ° C por 30 s), 85 ° C por 5 min, mantener a 4 ° C.</li>
</ol>6. microesferas de PCR para amplificar ssDNA
Nota: Esta sección describe el protocolo de amplificación de ssDNA en un tubo de reacción de PCR. Se realizaron reacciones de PCR de microesfera en 50 μL de volumen de reacción. Las secuencias de detallado utilizadas para amplificar ssDNA se enumeran en la tabla 5. En este caso, Ap en la superficie de microesferas puede templar a las plantillas de ADN al azar de manera complementaria. Este es un paso muy importante para la producción de filamentos de la DNA complementarios (filamento de ADN antisentido, figura 3). El ADN extendido se utiliza como plantilla para la amplificación por PCR de la microesfera.
<ol><li>Preparar la mezcla de reactivo de microesfera-PCR. Descongelar los reactivos en la tabla 6 sobre el hielo; sin embargo, no tener la enzima polimerasa de Taq en hielo. Almacenar a-20 ° C hasta que se necesite.</li>
	<li>Vórtice suavemente todos los reactivos y entonces brevemente centrifugar los tubos a 10.000 x g durante 10 s.</li>
	<li>Obtener aproximadamente ~ 25 microesferas mediante recuento microscópico. Nota: La cantidad de microesferas en tubo de una reacción se calcula utilizando un microscopio con 40 aumentos. Microesferas de unos ~ 25 se utilizan para la amplificación por PCR de la microesfera. Información más detallada está en el paso 3.</li>
	<li>Todos los reactivos se combinan como se describe en tabla 6.
</li>
	<li>Coloque las muestras en un termociclador y comenzar la PCR asimétrica bajo las siguientes condiciones: 25 ciclos (95 ° C por 30 s, 52 ° C por 30 s y 72 ° C por 30 s), 85 ° C por 5 min, mantener a 4 ° C.</li>
	<li>Siguiente amplificación, añadir 8 μL de 6 x de buffer de carga y carga 15 μL de cada muestra en gel de agarosa al 2%. Entonces, realizar la electroforesis a 100 V durante 35 min en 1 x TAE (Tris-acetato-EDTA, 40 mM Tris acetato, 1 mM EDTA, pH 8.2) buffer.</li>
</ol>7. adquisición de confocal de la microscopia
Nota: Los resultados de la hibridación de la sonda de DNA de microesfera son fotografiados con un microscopio confocal. Análisis de imagen se realizan con ImageJ.
<ol><li>Fijar hibridizadas microesferas a la etapa del microscopio en un porta.</li>
	<li>Seleccione el láser (laser de helio/neón, 543 nm línea) y encienda en el control de láser.</li>
	<li>Seleccione la lente del objetivo en el control del microscopio.</li>
	<li>Seleccionar el filtro deseado para Cy3 y canal de control de configuración.</li>
	<li>Iniciar el experimento y observar la muestra. Configuración del microscopio confocal se resume en la Tabla 7.</li>
</ol>

<ol><li>Smith, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+exonuclease+III+for+preparing+single+stranded+DNA+for+use+as+a+template+in+the+chain+terminator+sequencing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method.</a> Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).</li>
<li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptabody-aptatope+interactions+in+aptablotting+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Aptabody-aptatope interactions in aptablotting assays.</a> Nanoscale. 9 (22), 7464-7475 (2017).</li>
<li>Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+RNA+polymerase-promoter+interaction+by+using+ssDNA-dsDNA+probe+on+a+surface+addressable+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray.</a> Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).</li>
<li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+copper+binding+aptamotif+and+aptamer+integrated+recovery+platform+%28AIRP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP).</a> Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).</li>
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<li>Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-demand+one-step+synthesis+of+monodisperse+functional+polymeric+microspheres+with+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics.</a> Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).</li>
<li>Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-Integrated+Glass+Capillary+Device+for+Preparing+Small-Sized+Water-in-Oil-in-Water+Emulsion+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets.</a> Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-Flow+Synthesis+of+Co-Polymerizable+Oligo-Microspheres+and+Application+in+ssDNA+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification.</a> PLoS One. 11 (7), e0159777(2016).</li>
<li>Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. <a target="_blank" href="https://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.1537519">Formation of dispersions using &#34;flow focusing&#34; in microchannels.</a> Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).</li>
<li>Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0045793014002217">Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device.</a> Computers & Fluids. 100, 218-226 (2014).</li>
<li>McDonald, J. C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28dimethylsiloxane%29+as+a+material+for+fabricating+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices.</a> Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).</li>
<li>Olsen, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Microfluidic+Selex+Using+Free+Solution+Electrokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Electrochemical+Society%22%5BJournal%5D)">Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics.</a> Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).</li>
<li>Dorris, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodeoxyribonucleotide+probe+accessibility+on+a+three-dimensional+DNA+microarray+surface+and+the+effect+of+hybridization+time+on+the+accuracy+of+expression+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios.</a> BMC Biotechnology. 3, 6(2003).</li>
<li>Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+strategies+to+optimize+asymmetric+PCR+conditions+as+a+reliable+method+to+generate+large+amount+of+ssDNA+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Applied+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.

Contaminantes de dsDNA son una cuestión importante en la amplificación de ssDNA. Sigue siendo difícil minimizar la amplificación de dsDNA de amplificación PCR asimétrico convencional15. Además, aunque mejoras técnicas para la generación de ssDNA nos han permitido aumentar la eficiencia de producción de muestras, aislamiento de ssDNA es todavía problemática debido a sus altos costos y rendimientos de depuración incompleta.
PCR asimétrico es uno de los métodos más difícil...

ADN monocatenario (ssDNA) ha sido ampliamente considerado como un elemento de reconocimiento molecular (MRE) debido a sus propiedades intrínsecas para hibridación de ADN-DNA1,2. El desarrollo de sistemas sintéticos ssDNA puede conducir a aplicaciones biológicas como ADN microarrays3, oligotherapeutics, diagnóstico y detección molecular integrado basado en interacciones complementarias4,5.
Hasta la fecha, las partículas de polímero de micrómetro-escala han demostrado con éxito utilizando dispositivos microfluídicos. Varias técnicas de microfluidos han demostrado para ser potentes para la producción de microesferas muy homogéneas en un flujo continuo en el entorno de microchannel6,7.
En el estudio de Lee et al. se informó de 8, una plataforma de microfluídica basada en gotas para la síntesis de microfluídica de amplificación microesfera de oligo y ssDNA copolymerizable. La plataforma de microfluidos consiste en dos capas PDMS (polidimetilsiloxano): una parte superior con una red de canal de microfluidos para la generación de la microesfera y un fondo plano parte. Éstos consisten en tres tipos de canales fluídicos PDMS: 1) un flujo enfoque canal para la generación de gotas, 2) un canal serpenteante para la mezcla de dos soluciones y 3) un canal de polimerización secuencial para la solidificación de la microesfera. Una vez que se introducen dos flujos inmiscibles en un solo canal fluídico de PDMS, los flujos pueden ser forzados a través de la estructura del orificio estrecho. Los comportamientos de flujo tales como la geometría del canal, caudal y la viscosidad afectan el tamaño y la morfología de la microesfera. Por lo tanto, la corriente líquida principal puede dividirse en microescala monospheres9,10.
Aquí, se proporciona un protocolo detallado de microesfera-PCR para la amplificación de ssDNA. En primer lugar, se describe un proceso de diseño de dispositivos microfluídicos basada en gotas. A continuación, se explica la manera en que la poliacrilamida microesferas pueden ser funcionalizadas con plantilla de ADN al azar de manera complementaria. Por último, se muestra un protocolo de microesfera-PCR para amplificar ssDNA.

<table><tbody><tr><td>polidimetilsiloxano líquido, PDMS</td><td>Dow Corning Inc.</td><td>Sylgard 184</td><td>Componentes de la viruta</td></tr><tr><td>40% Solución de acrilamida:bis (19:1)</td><td>Bio-rad</td><td>1610140</td><td>Componentes de la oligomicrosfera copolimerizable</td></tr><tr><td>Persulfato de amonio, APS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td>Endurecedor de solución de acrilamida:bis</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrametiletilendiamina, TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td>Catalizador de persulfato de amonio</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5904</td><td>Tabla 1. Solución III. Componente de los reactivos de microsfera</td></tr><tr><td>marcados con Cy3 con sondas de oligonucleótidos complementarios</td><td>sintetizadas por</td><td>Bioneer</td><td>Tabla 3. Información de secuencia&nbsp;</td></tr><tr><td>sonda marcada con acridita ssDNA</td><td>Bioneer</td><td>sintetizada Tabla</td><td>1. Solución I. Componente de los reactivos de microesferas</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Biosesang</td><td>&nbsp; T1016</td><td>Componentes del tampón TE, solución tampón de pH</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td>Componentes del tampón TE, eliminación de iones (Ca2+)</td></tr><tr><td>Ex taq</td><td>Takara</td><td>RR001A</td><td>amplificación de ssDNA</td></tr><tr><td>Microscopio confocal&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>Identificación de oligonucleótidos, exposición de la superficie de la microesfera</td></tr>, <tr><td>Microscopio óptico</td>, <td>Nikon Instruments, Inc.</td><td>eclipse 80i</td><td>Pulverización del número de microesferas</td></tr><tr><td>Termociclador T100</td><td>Bio-rad</td><td>1861096</td><td>amplificación de ssDNA</td></tr><tr><td>Tratador de corona portátil</td><td>Electro-Technic</td><td>BD-20AC Tratador de corona de laboratorio</td><td>Tratamiento hidrofílico de superficies</td></tr><tr><td>Placa calefactora</td><td>Como una</td> placa calefactora <td>HI-1000</td><td>para el curado de PDMS líquido</td></tr><tr><td>Bomba de jeringa</td><td>kd Scientific 78-1100</td><td></td><td>Flujo uniforme de la solución I y la solución II</td></tr><tr><td>Compresor</td><td>Kohands</td><td>KC-250A</td><td>Control de flujo de la solución III</td></tr><tr><td>Hemacitómetro Bright-Line</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Caculación Número de microesferas</td></tr></tbody></table>

una gotita-enfoque basado en microfluidos y amplificación por pcr de microesfera para amplicones de adn

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

Microfluídica basada en gotita permite la producción confiable de microesferas homogéneas en el canal microfluídico, controlado tamaño y morfología de la microesfera obtenida. Una microesfera copolymerized con una sonda de ADN acrydite se fabricó con éxito. Diferentes métodos como PCR, digestión de exonucleasa y aislamiento en bolas magnéticas recubiertas de estreptavidina asimétrica pueden utilizarse para sintetizar ADN monocatenario (ssDNA). Sin embargo, estos métodos no utilizan eficientemente grandes cantidades de ssDNA altamente purificado. Aquí, describimos un protocolo de PCR microesfera detallando cómo ssDNA puede ser eficientemente amplificado y separado de dsDNA simplemente transfiriendo de un tubo de reacción de PCR. La amplificación de ssDNA puede aplicarse como potencial reactivo de los microarrays de DNA y DNA-SELEX (evolución sistemática de los ligandos por el enriquecimiento exponencial) procesos.

La plataforma fabricado microfluídicos poliméricos basados en la gota consiste en dos capas PDMS (Figura 1a). Se utilizan tres tipos de redes de canales de microfluidos para generar microesferas: geometría 1) el enfoque de flujo como se muestra en la Figura 1b, 2) un canal serpenteante para mezclar solución I solución II y 3) un canal de polimerización para microesfera solidificación. La altura de todos los canales fue 60 μm. La ...

Este trabajo proporciona un método para la fabricación de plataformas de microfluídica basada en la gota y la aplicación de microesferas de poliacrilamida para la amplificación por PCR de la microesfera. El método de microesfera-PCR hace posible obtener amplicones de ADN monocatenario sin la separación del ADN de doble hebra.

Una gotita-enfoque basado en microfluidos y amplificación por PCR de microesfera para amplicones de ADN

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la técnica combinatoria del sistema microfluídico y el campo de la biotecnología molecular, como los dispositivos microfluídicos y el método de pcR de asimetría. Las principales ventajas de esta técnica son la generación eficiente de microesferas altamente homogeneizadas y la producción de ADN de una sola cadena sin ningún paso de separación adicional. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico o la terapia de diversas enfermedades.Debido a que la generación de ADN de una sola cadena es clave para los ensayos ap-ta-mo-sis, se puede utilizar para la detección y el tratamiento. Aunque este método puede proporcionar información sobre el sistema microfluídico tridimensional en MEMS, también se puede aplicar a otros sistemas utilizados para la detección y el tratamiento de la enfermedad. Generalmente, los individuos nuevos en este método tendrán dificultades para controlar adecuadamente los fluidos de fluir en la dirección inversa.La demostración visual de este método es fundamental para observar la formación de la microesfera en la geometría de enfoque de flujo y la solidificación de las microesferas gener

a-droplet-based-microfluidic-approach-microsphere-pcr-amplification

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Gota de plataformas basadas en microfluidos son candidatos prometedores para la experimentación de alto rendimiento, ya que son capaces de generar picolitros, la auto-compartimentado barcos bajo costo en las tasas de kHz. Mediante la integración con rápido, sensible y de alta resolución espectroscópica métodos de fluorescencia, la gran cantidad de información generada dentro de estos sistemas se puede extraer de manera eficiente, aprovechar y utilizar.

Métodos de detección de fluorescencia para las plataformas de las gotas de microfluidos

En este video, presentamos un procedimiento paso a paso para generar nano-gotas emulsionadas para detectar ácidos nucleicos objetivo mediante la reacción en cadena de la polimerasa digital o dPCR.

Reacción en cadena de la polimerasa digital en gotasas: un método para generar reacciones de PCR con nanogotas para detectar mutaciones tumorales raras

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Este video demuestra la técnica de reacción en cadena de la polimerasa por gotas multiplex para la cuantificación simultánea de regiones de ADN metiladas en diferentes poblaciones de glóbulos blancos como biomarcador temprano para el diagnóstico clínico y el pronóstico.

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Este video demuestra la utilidad de la PCR digital en formato de chip en un tubo para la detección de variaciones de un solo nucleótido en muestras de ADN. Una sola reacción de PCR se divide en cámaras que actúan como reacciones de PCR independientes, y la detección de señales de fluorescencia de los objetivos amplificados en las cámaras se utiliza para calcular la frecuencia del alelo variante en la muestra.

PCR digital basada en chip en tubo para la cuantificación de variantes de un solo nucleótido

Describimos un ensayo digital de punto final para cuantificar ácidos nucleicos con una lectura simplificada (analógica). Medimos la fluorescencia masiva de ensayos digitales basados en gotas utilizando una máquina de qPCR estándar en lugar de instrumentación especializada y confirmamos nuestros resultados mediante microscopía.

Lectura granel simple de Digital ácidos nucleicos Cuantificación ensayos

Sola célula secuencia revela heterogeneidad genotípica en los sistemas biológicos, pero las tecnologías actuales carecen de la capacidad necesaria para el perfilado profundo de la función y composición de la comunidad. Aquí, describimos un flujo de trabajo de microfluidos para la secuencia &gt; 50.000 genomas unicelulares de diversas poblaciones de la célula.

Una plataforma de ultra rendimiento microfluidos para la secuenciación del genoma de unicelular

Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar con precisión múltiples alteraciones genéticas de una región de destino en una sola reacción usando ddPCR de bajada y un único par de sondas de hidrólisis.

Reacción en cadena polimerasa Digital sola gota para la detección integral y simultánea de mutaciones en las regiones de Hotspot

Aquí, presentamos un protocolo para detectar mutaciones somáticas tumorales en el ADN circulante presente en fluidos biológicos del paciente (biofluidos). Nuestro método basado en la reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas (dPCR) permite cuantificar la frecuencia alélica de la mutación tumoral (MAF), facilitando un complemento mínimamente invasivo para el diagnóstico y el monitoreo temporal de la respuesta tumoral.

Detección y seguimiento del ADN circulante asociado a tumores en biofluidos del paciente

Los marcadores epigenéticos se utilizan para la subtipificación de glóbulos blancos (CMB) mediante la cuantificación de los patrones de metilación del ADN. Este protocolo presenta un método de reacción en cadena de la polimerasa de gotas múltiples (mdPCR) utilizando un dispositivo microfluídico basado en elastómero termoplástico (TPE) para la generación de gotas que permite la cuantificación objetivo precisa y múltiplex específica de metilación de los recuentos diferenciales del CMB.

Metilización Específica Multiplex Droplet PCR usando el Dispositivo Generador de Gotas de Polímero para Diagnóstico Hematológico

Los ensayos de gotas de agua en aceite son útiles para la química analítica, la evolución enzimática y el análisis de células individuales, pero generalmente requieren microfluídica para formar las gotas. Aquí, describimos la emulsificación con plantilla de partículas, un enfoque libre de microfluídica para realizar ensayos de gotas.

La emulsificación con plantilla de partículas permite ensayos de gotas sin microfluídica

Aprende a fabricar plataformas microfluídicas basadas en gotitas con microesferas de poliacrilamida para amplificación PCR. Este método genera ADN monocatenario sin separación adicional, útil para diagnóstico y terapia de enfermedades.

Una gotita-enfoque basado en microfluidos y amplificación por PCR de microesfera para amplicones de ADN

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