Una gotita-enfoque basado en microfluidos y amplificación por PCR de microesfera para amplicones de ADN

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la técnica combinatoria del sistema microfluídico y el campo de la biotecnología molecular, como los dispositivos microfluídicos y el método de pcR de asimetría. Las principales ventajas de esta técnica son la generación eficiente de microesferas altamente homogeneizadas y la producción de ADN de una sola cadena sin ningún paso de separación adicional. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico o la terapia de diversas enfermedades.

Debido a que la generación de ADN de una sola cadena es clave para los ensayos ap-ta-mo-sis, se puede utilizar para la detección y el tratamiento. Aunque este método puede proporcionar información sobre el sistema microfluídico tridimensional en MEMS, también se puede aplicar a otros sistemas utilizados para la detección y el tratamiento de la enfermedad. Generalmente, los individuos nuevos en este método tendrán dificultades para controlar adecuadamente los fluidos de fluir en la dirección inversa.

La demostración visual de este método es fundamental para observar la formación de la microesfera en la geometría de enfoque de flujo y la solidificación de las microesferas generadas. En primer lugar, prepare 20 mililitros de prepolimero LÍQUIDO PDMS mezclando polímero base y catalizador en una proporción de 10 a uno. Vierta 10 mililitros de los PDMS líquidos en un molde SU-8 preparado sobre una oblea de silicio para la parte superior de la red microfluídica.

Para la parte plana inferior, vierta el mismo volumen de PDMS líquido en la oblea de silicio sin una estructura de molde. Coloque dos obleas de silicio recubiertas con prepolimero LÍQUIDO PDMS en una placa caliente y cure a 75 grados Centígrados durante 30 minutos. Después de esto, despegue manualmente la capa PDMS curada del molde SU-8.

Alinee una herramienta de perforación de orificios redondos de 1,5 milímetros de diámetro con el puerto de aceite de la red microfluídica replicada para interconectar canales de flujo a escala de micrones con las muestras de macrofluta. A continuación, perforar manualmente el orificio pasante. Después de repetir el proceso de punzonado tres veces, realice el tratamiento de la superficie hidrófila en las capas PDMS superior e inferior utilizando un tratamiento de corona portátil durante varios segundos por muestra.

Apile dos capas PDMS tratadas con plasma y caliente a 90 grados Centígrados durante 30 minutos en una placa de cocción para el proceso de unión de PDMS a PDMS. Vortex y centrifugar brevemente una sonda estándar con etiqueta de acririto de ADN de una sola cadena y una solución de stock de acrilamida bis de 19 a uno. Prepare la solución uno mezclando 25 microlitros de 40% de solución de acrilamida bis, 10 microlitros de ADN de una sola cadena, 10 microlitros de tampón 5X TBE y cinco microlitros de agua.

Preparar la solución dos con 50 microlitros de 20% de persulfato de amonio. Prepare dos jeringas llenas individualmente con solución uno y solución dos y colóquelas en la bomba de jeringa para introducir flujos de solución en la plataforma microfluídica. Preparar aceite mineral mezclado con 0.4%TEMED para la solidificación superficial de la microesfera.

Después de llenar una botella de vidrio con el aceite mineral, inserte dos tubos en los puertos neumáticos y fluidos en la tapa de la botella de vidrio como depósito microfluídico. Conecte los tubos entre la botella de vidrio y el puerto de aceite en el dispositivo microfluídico. Conecte los tubos a los dos puertos de solución del dispositivo microfluídico para suministrar las dos soluciones de las bombas de jeringa.

A continuación, inserte los tubos en el puerto de salida para transferir la microesfera generada en el vaso de precipitados. A continuación, ajuste el caudal de la bomba de jeringa a 0,4 a 0,7 mililitros por hora. Ajuste la presión de aire comprimido del compresor utilizando un regulador.

Coloque un vaso de precipitados de vidrio con una barra de agitación magnética en una placa de cocción y ajuste la velocidad de rotación. Operar la bomba de la jeringa y suministrar el aire comprimido generado por un compresor externo en la botella de vidrio utilizando el control de encendido-apagado de una válvula electromagnética. Usando un microscopio digital, observe la formación de microesferas en la geometría de enfoque de flujo y la solidificación de microesferas generadas en el vaso de precipitados de vidrio.

Observar la formación de microesferas es uno de los pasos más críticos porque es un proceso importante en este estudio para producir microesferas y sistema microfluídico. Después de esto, transfiera 100 microlitros de las microesferas a un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros. A continuación, retire el sobrenadante a través de una suave centrifugación y pipeteo.

Resuspender la sonda de cortesía modificada cianina-3 utilizando 100 microlitros de 1X Tampón TE con el fin de lograr una concentración final de 100 micromolares. A continuación, añada 100 micromolares de cianina-3 modificada por sonda complementaria a un tubo estéril de microterfurecitro de 1,5 mililitros que contenga microesferas copolymerizadas AP. Toque el tubo varias veces para mezclar e incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante una hora.

Después de la incubación, deseche el sobrenadante y retire el tampón residual a través del pipeteo. A continuación, enjuague tres veces con 500 microlitros de tampón TE. Coloque las microesferas en un portaobjetos de vidrio de 75 por 50 milímetros y cúbralos con papel de aluminio antes de la toma de imágenes.

Obtenga aproximadamente 25 microesferas a través del conteo microscópico utilizando un microscopio de luz con aumento de 40X. Después de esto, combine todos los reactivos como se describe en el protocolo de texto. Coloque las muestras en un termociclador e inicie la PCR asimétrica en las condiciones adecuadas.

La colección de un sobrenadante después de la PCR asimétrica es uno de los pasos más críticos porque es un proceso importante para generar ADN de una sola cadena con microesfera. Después de la amplificación, agregue ocho microlitros de búfer de carga 6X a cada muestra. Cargue 15 microlitros de cada muestra en un gel de 2% de agarosa.

A continuación, realice la electroforesis a 100 voltios durante 35 minutos en el búfer 1X TAE. Coloque las microesferas hibridas en un soporte y conecte el soporte a la etapa de un microscopio confocal. Seleccione el láser y enciéndalo en el control láser.

Seleccione la lente objetivo en el control del microscopio. A continuación, seleccione el filtro deseado para cianina-3 y canal en el control de configuración. Por último, inicie el experimento y observe la muestra.

La plataforma microfluídica polimérica fabricada basada en gotas consta de dos capas PDMS. Se utilizan tres tipos de redes de canales microfluídicos para generar microesferas, que son geometría de enfoque de flujo, un canal de serpentina para mezclar soluciones uno y dos, y un canal de polimerización para la solidificación de microesferas. Se utilizó un sistema de control neumático basado en laboratorio para el flujo continuo del aceite mineral y dos bombas de jeringa para el flujo de solución para generar microesferas en la plataforma microfluídica.

Si las microesferas están correctamente funcionalizadas con la sonda de ADN de arydite de cinco primos, deben dar lugar a la cobertura de la actividad fluorescente en la superficie durante el experimento de hibridación como se muestra en estas imágenes fluorescentes. Si la copolimerización no se produce correctamente, la imagen de la microesfera óptica exhibiría contaminación interna dentro de las microesferas. Manipular la superficie 3D de las microesferas con una sonda oligodesarma de ADN es un proceso mucho más rápido y una plataforma de síntesis de microesfera en flujo puede proporcionar una herramienta para la amplificación y purificación de ADN de una sola cadena.

El AP inicialmente copolymerizado de cinco primos proporciona un extremo hidroxilo de tres primos para la polimerización del ADN después de recocido a su plantilla complementaria. En el experimento asimétrico de PCR se observaron contaminantes de ADN de doble cadena. El ADN de una sola cadena resultante acumulado a partir de la PCR de microesfera se demostró en comparación con los marcadores de tamaño sintético a través del análisis de electroforesis de gel.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el conocimiento previo de los protocolos y ajustes que son comúnmente necesarios para optimizar los experimentos de PCR son necesarios para obtener el ciclo de amplificación, la temperatura de recocido y la secuencia de la sonda en este método. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del diagnóstico y la terapia conectaran dos regiones de la biotecnología molecular y la biomedicina. No olvide que trabajar con solución de acrilamida puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como usar guantes y abrigos de laboratorio durante la realización de este procedimiento.