Name: Lo verbal-inducida fluorescentes pegilado Virus-como partículas por disulfuro de Dibromomaleimide química (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Aprende a funcionalizar fluorescente partículas similares a virus con disulfuros usando dibromomaleimida. Este método permite introducir grupos funcionales y fluoróforos en una sola reacción con Qβ.

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J.J.G. reconoce la Fundación de ciencia nacional (DMR-1654405) y cáncer prevención Research Institute of Texas (CPRIT) (RP170752s) por su apoyo.

1. preparación
<ol><li>Hacer agar caldo (LB) de lisogenia y verter placas12.</li>
	<li>
Transformar BL21(DE3) con un plásmido pET28 que contiene la secuencia de la proteína de wtQβ capa.
	<ol>
<li>Descongelar las células competentes de e. coli BL21(DE3) en un baño de hielo. Depositar 50 μL de las células en un tubo de microcentrífuga.</li>
		<li>Añadir 2 μL del plásmido en un tubo y mueva suavemente el tubo. Luego incubar en hielo durante 30 minutos.</li>
		<li>Choque térmico las células para 45 s en un baño de agua a exactamente a 42 ° C. Coloque el tubo en el baño de hielo inmediatamente después del choque de calor e incubar durante 5 minutos.</li>
		<li>Agregar 950 μL de medio LB que no contiene ningún antibiótico.</li>
		<li>Agitar el cultivo a 200 rpm por 60 min a 37 ° C.</li>
		<li>Placa de 100 μL de la cultura en placas de agar LB (con kanamicina) e incubar la placa durante la noche a 37 ° C. Seleccione colonias blancas cuando sea necesario.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hacer los medios caldo óptimo Super (sollozo).
	<ol>
<li>Autoclave 2 L había desconcertado matraces Erlenmeyer en un ciclo de superdry.</li>
		<li>En un ambiente aséptico, pesar y añadir 20,0 g de triptona, extracto de 5,0 g de levadura, 2,469 g de sulfato de magnesio anhidro, 0,584 g de cloruro de sodio y 0,186 g de cloruro de potasio a cada matraz.</li>
		<li>Llevar el volumen a 1 L con agua ultrapura en cada frasco y autoclave en el ciclo líquido.</li>
		<li>Una vez que los medios de comunicación SOB ha alcanzado temperatura ambiente después de la esterilización en autoclave, añadir 1 mL de kanamicina (100 mg/mL) a cada litro de medio y guardar a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hacer el tampón de fosfato de potasio de 0.1 M (pH 7,00).
	<ol>
<li>Hacer solución monobásico de potasio de 1 M disolviendo 68,045 g de potasio monobásico en 500 mL de agua ultrapura.</li>
		<li>Hacen 1 M potasio dibásico solución disolviendo 87,09 g de potasio dibásico en 500 mL de agua ultrapura.</li>
		<li>Añadir 38,5 mL de solución de potasio monobásico y 61,5 mL de potasio dibásico a una botella de 1 L.</li>
		<li>Ajustar pH a 7.00 si es necesario y llevar a un volumen de 1 L.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hacer 5 – 40% gradientes de sacarosa en tampón de fosfato de potasio de 0.1 M (pH 7,00).
	<ol>
<li>En tubos de centrífuga de 50 mL, preparar soluciones con sacarosa al 5 – 40% (aumentando en incrementos de 5%) disuelto en tampón de fosfato de potasio de 0.1 M (pH 7,00).</li>
		<li>Depósito de 3,3 mL de solución de sacarosa al 5% en la parte inferior de un tubo de fondo redondo policarbonato 38 mL usando una jeringa de aguja larga y repetir este proceso para los otros cinco tubos.</li>
		<li>Depositar cuidadosamente 3,3 mL de solución de sacarosa del 10% en la parte inferior del tubo y retire con cuidado la aguja para no molestar el gradiente. Repita para los otros cinco tubos. 
		 </li>
	</ol>
</li>
	<li>Seguir depositar capas de 3,3 mL de soluciones de sacarosa, aumentando de 15% a 40% en cada tubo, teniendo cuidado para no perturbar el gradiente.</li>
	<li>Cuando termine, cubrir la parte superior de los gradientes con papel de aluminio y almacenar a-80 ° C.</li>
</ol>2. expresión de Qβ
<ol><li>Limpie el área del Banco con lejía y etanol de 1:1.</li>
	<li>Hacer dos culturas de arrancador 3 mL en un ambiente aséptico añadiendo solo colonias de e. coli BL21(DE3) en 3 mL de medio de sollozo en un ambiente aséptico.</li>
	<li>Crecen durante la noche en un agitador a 250 rpm en una habitación de 37 ° C y 0% de humedad relativa (HR).</li>
	<li>
Sembrar cultura de arrancador en medio del sollozo:
	<ol>
<li>Sacar ambas culturas de arrancador 3 mL de la coctelera y, en un ambiente aséptico, vierta cada cultura de arrancador en uno de los dos 2 L desconcertado matraces Erlenmeyer con 1 L de frescas SOB los medios de comunicación en cada uno.</li>
		<li>Colocar el medio inoculado en un agitador a 250 rpm en una habitación de 37 ° C y 0% rH.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Crecen las bacterias en un agitador a 250 rpm en una habitación de 37 ° C y 0% rH hasta OD600 0.9 – 1.0.</li>
	<li>Añadir 1 mL de 1 M isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) usando una pipeta P1000 para inducir la expresión de la proteína.</li>
	<li>Deja los medios de comunicación en la coctelera a 250 rpm en una habitación de 37 ° C y 0% HR durante la noche.</li>
	<li>Retire los medios de comunicación de la coctelera la mañana siguiente y centrífuga usando botellas de 1000 mL en 20.621 × g durante 1 h a 4 ° C para cosechar las células.</li>
	<li>
Deseche el sobrenadante y recoger el precipitado de células.
	<ol>
<li>Vierta el sobrenadante en un matraz con aproximadamente 5 mL de blanqueador para matar las bacterias. Se trata de residuos.</li>
		<li>Use una espátula para raspar el precipitado de células de la parte inferior de la botella de centrífuga y poner el sedimento en un tubo de centrífuga de 50 mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. purificación de Qβ
<ol><li>Resuspender el precipitado de células con ~ 20-30 mL de tampón de fosfato de potasio de 0.1 M (pH 7,00).</li>
	<li>Asegúrese de que la resuspensión no tiene trozos y lyse las células usando un procesador microfluidizer según protocolo del fabricante (véase Tabla de materiales). Lyse las células de al menos dos veces para aumentar el rendimiento de las partículas.</li>
	<li>Centrifugue el lisado en botellas de centrífuga de 250 mL a 20.621 x g durante 1 hora a 4 ° C.</li>
	<li>Descarte el precipitado y medir el volumen del sobrenadante en mL. Multiplicar ese valor por 0.265 y añadir esa cantidad de g de sulfato de amonio en el sobrenadante.</li>
	<li>Revuelva en 4 ° C durante al menos 1 h en una placa de agitación a 200 rpm a precipitar hacia fuera la proteína.</li>
	<li>Centrifugue en botellas de 250 mL a 20.621 x g durante 1 h a 4 ° C.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado con unos 10 mL de tampón de fosfato de potasio de 0.1 M (pH 7,00).</li>
	<li>Añadir volúmenes iguales de cloroformo 1:1 / n-butanol a la muestra cruda y mezclar con un vórtex durante unos segundos.</li>
	<li>Centrifugar en tubos de 38 mL en 20.621 × g durante 30 minutos a 4 ° C.</li>
	<li>Recuperar la capa acuosa superior utilizando una pipeta Pasteur. Tenga cuidado no para tomar el gel como capa que se ha formado entre la capa acuosa y orgánica.</li>
	<li>Descongelar seis 5 – 40% gradientes de sacarosa hecha de antemano y cargar unos 2 mL del extracto en cada uno.</li>
	<li>Ultracentrífuga 99.582 x g durante 16 horas a 4 ° C con la desaceleración libre.</li>
	<li>Brillar una luz de diodo (LED) en cada tubo de emisión de luz y una banda azul debe ser visible. Recuperar estas partículas con una jeringa de aguja larga.</li>
	<li>Ultrapellet las partículas a 370.541 x g durante 2,5 h a 4 ° C.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado transparente de partículas purificadas con tampón de fosfato de potasio de 0.1 M (pH 7,00).</li>
</ol>4. cuantificación y confirmación del producto
<ol><li>Utilice análisis de Bradford para cuantificar el producto13.</li>
	<li>Reducir la marcha y no reducir sodio dodecil sulfato poliacrilamida gel electroforesis (SDS-PAGE) para confirmar el producto14. Nota: Reducción de SDS-PAGE se utiliza para confirmar el peso molecular de la proteína de la capa; no reducción de SDS-PAGE es confirmar la estructura de orden superior.</li>
</ol>5. conjugar los compuestos DB en Qβ
<ol><li>
Reducir disulfuros en Qβ.
	<ol>
<li>Disolver 0,0020 g de tris(2-carboxyethyl) fosfina (TCEP) en 1 mL de agua ultrapura para hacer una solución stock de 100 x. Nota: Preparar TCEP fresco antes de la reducción.</li>
		<li>Añadir 200 μL de Qβ (5 mg/mL) en un tubo de microcentrífuga.</li>
		<li>Siga añadiendo 20 μl de solución stock de 100 x TCEP.</li>
		<li>Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Volver a puente disulfuro reducido utilizando polietilenglicol dibromomaleimide (DB-PEG).
	<ol>
<li>Se disuelven 0,0017 g de dibromomaleimide-polietilenglicol (PEG-DB) en 100 μl de DMF.</li>
		<li>Añadir 680 μl de solución de fosfato de sodio 10 mM (pH 5.00).</li>
		<li>Añadir reducido Qβ en la solución de DB-PEG y observar el proceso de mezcla bajo una lámpara de UV 365 nm. La fluorescencia amarillo brillante puede ser visualizada inmediatamente con 365 nanómetro portátil UV lámpara con mezcla.</li>
		<li>Que la reacción proceda durante la noche a temperatura ambiente (RT) en un asador estilo rotisserie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificar la mezcla de reacción por filtro centrífugo (COMW = 10 kDa) tres veces utilizando 1 x PBS a 3.283 x g por 20 min a 4 ° C.</li>
	<li>Supervisar la conjugación por no reducción de SDS-PAGE y electroforesis del gel de agarosa al nativo. Nota: VLPs ejecutan como partículas intactas en gel de agarosa nativa, y son separados en base a su carga, tamaño y forma.</li>
</ol>

<ol><li>Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Virus-Based+Polymer-Protein+Nanoparticles+by+Atom+Transfer+Radical+Polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).</li>
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<li>Fiedler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Mutations+Change+the+Structure+and+Stability+of+a+Virus-+Like+Particle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Engineered Mutations Change the Structure and Stability of a Virus- Like Particle.</a> Biomacromolecules. 13 (8), 2339-2348 (2012).</li>
<li>Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+Virus-like+Particles+with+Poly%282-oxazoline%29s%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).</li>
<li>Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Functionalized+Bacteriophage+Q%CE%B2+as+a+Photocaged+Drug+Carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier.</a> Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

En comparación con purificación de proteínas más pequeñas, un único paso en la purificación de bacteriófago Qβ es la centrifugación del gradiente de sacarosa. Después del paso de extracción de cloroformo/n-butanol, Qβ más se purifica mediante gradientes de sacarosa 5-40%. Durante la centrifugación, las partículas se separan en base a sus tamaños. Las partículas más grandes viajan a la región de densidad más alta, mientras que las partículas más pequeñas permanecen en la región de más baja densidad. Qβ viaja hasta el terc...

Utilizando nanopartículas de cápsida viral ha surgido como un campo interesante, que pretende ampliar el alcance de las aplicaciones en investigación biomédica1,2,3. Por vía recombinante expresadas virus-como partículas (VLPs) son estructuralmente derivadas de virus, pero tienen el material genético viral original haciendo que no infecciosas proteináceas nanopartículas. Como las características superficiales están genéticamente programadas y cada cápside se expresa idénticamente a los antes y después de él, es posible conocer la ubicación y el número de cadenas laterales reactivas de los aminoácidos con precisión atomística. En muchos casos, las superficies exteriores e interiores poseen muchos tipos de residuos de solvente aminoácidos expuesta, que factible pueden ser funcionalizados a través bioconjugation reacciones - reacciones que forman enlaces covalentes entre una biomolécula y sintéticos molécula de4,5.
Reacciones bioconjugation ayudan biomoléculas de interés tienen funcionalidades más diversas de una manera relativamente sencilla. Moléculas de interés, como drogas terapéuticas6, etiquetas fluorescentes7 y polímeros8,9 pueden ser previamente sintetizadas y caracterizadas antes de que se colocan en la superficie de VLPs. Una VLP particularmente común en biomédica y la investigación de biomateriales ha sido la VLP basado en bacteriófago Qβ, que, como expresa por vía recombinante, es un 28 nm cápside viral icosaédrica10. Los sitios más comunes de la reacción en Qβ son lisinas por un amplio margen, aunque recientemente hemos comunicado verbal exitosa11 de dibromomaleimide compuestos a los disulfuros reducidos que los poros de Qβ vía una reacción Haddleton-Baker. La reacción procede con buen rendimiento y, lo que es igualmente importante, sin perder la estabilidad térmica de las partículas. Al mismo tiempo, esta reacción genera fluorescencia inducida por la verbal, que puede utilizarse para rastrear la captación de estas partículas en las células. En este trabajo demostramos la conjugación de polietilenglicol (PEG) en la superficie de Qβ a través de la reacción Haddleton-Baker, que se traduce en un fluoróforo amarillo brillante. Estas partículas pueden rastrearse como se toman las células. El Protocolo adjunto ayudarán a los investigadores generar pegilado fluorescente nuevas nanopartículas proteínico basadas en Qβ, aunque sus principios son aplicables a uno de los muchos otros VLPs que contienen solvente disulfuros expuestas.

<table><tbody><tr><td>Caldo LB (Miller)&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Triptona, Poweder</td><td>Research Products International</td><td>T60060-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura, Poweder</td><td>Research Products International</td><td>Y20020-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio anhidro</td><td>P212121</td><td>CI-06808-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (cristalino/ACS certificado)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Elga Sistema de purificación de agua PURELAB Flex 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>4474524</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio dibásico anhidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>S25590B</tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>096-041053</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de amonio</td><td>P212121</td><td>KW-0066-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Alfa Aesar</td><td>32614-M6</td><td></td></tr><tr><td>1-butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-4</td><td></td></tr><tr><td>SW 28 Ti Rotor, cucharón oscilante, aluminio</td><td>Beckman Coulter</td><td>342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Juego</td><td></td>de cubos</tr><tr><td>tipo 70 Ti Rotor, ángulo fijo, Titanio, 8 x 39 mL,Beckman</td> <td>Coulter</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie (Bradford) Ensayo de proteínas</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI23200</td><td></td></tr><tr><td>TRIS Clorhidrato de</td><td>Investigación Productos Internacionales</td><td>T60050-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiamina</td><td>Alfa Aesar</td><td>J63734-AC</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de Tris(2-carboxietil)fosfina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>2 3-Dibromomaleimida 97%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>553603-5G</td><td></td></tr><tr><td>Politilenglicol Alfa</td><td>Aesar</td><td>41561-22</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424375000</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida/bis-Acrilamida</td><td>P212121</td><td>RP-A11310-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771-100G</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179-100</td><td></td></tr><tr><td>FV3000 microscopio de barrido láser confocal</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>FV3000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Revólver Labnet Rotador Ajustable&nbsp;</td><td>Thomas Scientific&nbsp;</td><td>1190P25&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Botella de alto rendimiento Sorvall de 1000 mL, PC, con tapa de aluminio&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>010-1459</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de centrífuga Nalgene con tapas, copolímero de polipropileno</td><td>Thermo Scientific</td><td>3141-0250</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Tubos de fondo redondo; 38 mL; PC</td><td>Thermo Scientific</td><td>3117-0380</td><td></td></tr><tr><td>Matraces Erlenmeyer de boca estrecha de 2 L con borde de alta resistencia</td><td>Pyrex</td><td>4980-2L</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Unidades de filtro centrífugo</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>M-110P Microfluidizador Procesador de materiales</td><td>Microfluídica</td><td>M-110P</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Policarbonato de alta velocidad Tubos de centrífuga de fondo redondo</td><td>Thermo Scientific</td><td>3117-0380PK</td><td></td></tr><tr><td>Botella, con Conjunto de Tapón, Policarbonato</td><td>Beckman Coulter</td><td>41121703</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro, Graduado - Polipropileno 250 mL</td><td>PolyLab</td><td>80005</td><td></td></tr><tr><td>Serie 533LS-E Esterilizadores de Vapor</td><td>Getinge</td><td>533LS-E</td><td></td></tr><tr><td>TrueLine, Placa de Cultivo Celular, Tratada, PS, 96 Pocillos, con Tapa</td><td>LabSource</td><td>D36-313-CS</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga cónico Falcon de 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentífugo: 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital VWR Os-500</td><td>Productos VWR Scientifc 14005-830</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistemas de fundición a mano Tetra</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000FC</td><td></td></tr><tr><td>Polipropileno, 250 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>41121703</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofluorómetro NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3300</td><td></td></tr><tr><td>Aguja larga&nbsp;</td><td>Hamilton &nbsp;</td><td>7693</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas Exel International 5 a 6 cc Luer Lock</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-841-46</td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>P200 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>P100 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123615</td><td></td></tr><tr><td>P20 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>P10 Pipetman</td><td>Gilson</td><td></td><td></td>F144802</tr><tr><td>Intel Pesaje PM-100 Laboratorio Clásico Balanza de laboratorio de alta precisión</td><td>Tecnología de ponderación inteligente</td><td>IWT_PM100</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL Tubo de centrífuga cónico</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 pocillos, 50 y micro; l</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1084</td><td></td></tr></tbody></table>

lo verbal-inducida fluorescentes pegilado virus-como partículas por disulfuro de dibromomaleimide química

Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry

La reciente subida de partículas similares a virus (VLPs) en biomédica y la investigación de materiales puede ser atribuido a su facilidad de biodegradabilidad, tamaño discreto, programación genética y biosíntesis. Mientras que son altamente susceptibles a reacciones bioconjugation por adición de ligandos sintéticos en su superficie, la gama en metodologías bioconjugation en estos cápsida nacido acuosa es relativamente limitada. Para facilitar la dirección de investigación de biomateriales funcionales, deben considerarse reacciones bioconjugation no tradicionales. La reacción que se describe en este protocolo utiliza dibromomaleimides para introducir nuevas funcionalidades en el solvente a base de disulfuro expuesta de una VLP al bacteriófago Qβ. Además, el producto final es fluorescente, que tiene la ventaja de generar una sonda rastreables en vitro usando un conjunto de filtros comercialmente disponibles.

Los derivados de dibromomaleimide se pueden sintetizar mediante la reacción de condensación entre el anhídrido dibromomaleimide y aminas primarias15. Como alternativa, un método sintético suave16 usando N-Metoxicarbonil activado 3,4-dibromomaleimide fue explotada aquí reaccionando con metoxipolietilen glicol (PEG) al rendimiento DB-PEG (figura 1). NMR fue utilizada para identificar la estructura compuesta (<stro...

Aquí, presentamos un procedimiento para fluorescencia funcionalizar los disulfuros de Qβ VLP con dibromomaleimide. Describimos Qβ expresión y purificación, la síntesis de moléculas de dibromomaleimide funcionalizados y la reacción de Conjugación entre dibromomaleimide y Qβ. La partícula conjugada fluorescente amarillo resultante puede utilizarse como una sonda de fluorescencia dentro de las células.

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The recent rise in virus-like particles (VLPs) in biomedical and materials research can be attributed to their ease of biosynthesis, discrete size, ...

El objetivo general de este método de bioconjugación consiste en funcionalizar fluorescentemente partículas tipo virus que contienen disulfuros. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la reacción de bioconjugación en partículas tipo virus que poseen un número limitado de residuos de aminoácidos que pueden ser funcionalizados. La principal ventaja de esta técnica radica en que, mediante una sola reacción, se pueden introducir nuevos grupos funcionales y formar simultáneamente fluoróforos inducidos por la conjugación. Además del Q-Beta, consideramos que esta reacción puede aplicarse a cualquier partícula tipo virus que posea enlaces disulfuro.Antes de comenzar el procedimiento para expresar el bacteriófago Q-Beta, limpie el área de trabajo con una solución de hipoclorito de sodio:etanol en proporción 1:1. En un ambiente aséptico, prepare dos cultivos iniciadores de tres mililitros agregando colonias individuales de E.coli BL21 a medio SOB. Incube los cultivos durante la noche en una sala a 37 grados Celsius y 0 % de humedad relativa, agitando a 250 rpm. Al día siguiente, retire ambos cultivos iniciadores de tres mililitros del agitador y, en un ambiente aséptico,

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Método para la medición de la cinética de fusión viral a nivel de partícula

Aprovechando los avances en el desarrollo de fluoróforo y la tecnología de imágenes, un método sencillo de Alexa Fluor etiquetado de los virus del dengue se ideó para visualizar las primeras interacciones entre el virus y la célula.

Visualización de virus del dengue a través de Alexa Fluor etiquetado

Partículas de adenovirus se han diseñado para contener la natural azidohomoalanine análogo del ácido amino o el azúcar...

Modificación de superficies quimioselectiva virales a través de Química Haga clic en Bioorthogonal

Nanopartículas de plantas virales (VNPs) son prometedoras plataformas para aplicaciones en biomedicina. A continuación, se describen los procedimientos para la propagación de plantas VNP, purificación, caracterización y bioconjugación. Finalmente, mostramos la aplicación de VNPs para la recalada del tumor y la formación de imágenes mediante un modelo de xenotrasplante de ratón y de imágenes de fluorescencia.

Las nanopartículas virales para<em&gt; En vivo</em&gt; Imágenes de tumores

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

Un protocolo rápido y modular para la generación de virus recombinantes de la vacuna que expresan las proteínas fluorescente marcadas simultáneamente usando el método de selección dominante transitoria se describe aquí.

Metodología Para La Generación Eficiente De Proteínas Del Virus Vaccinia Marcadas Fluorescentemente

La unión de viriones a una superficie es un requisito para la obtención de imágenes de viriones individuales mediante imágenes de fluorescencia de súper resolución o microscopía de fuerza atómica (AFM). Aquí se demuestra un método de preparación de la muestra para la adhesión controlada de viriones a las superficies de vidrio adecuado para su uso en AFM y super-resolución de imágenes de fluorescencia.

Preparación de muestras para microscopía de fuerza atómica de virión único e imágenes de fluorescencia de súper resolución

Ilustramos aquí un ensayo de unión a membranas in vitro en el que las interacciones entre el Gag del VIH-1 y las membranas lipídicas se analizan visualmente utilizando Gag marcado con YFP sintetizado en un sistema de traducción in vitro basado en germen de trigo y GUVs preparados por una técnica de electroformación.

Visualización de VIH-1 Gag unión a Giant unilamelares vesículas membranas (GUV)

Hemos diseñado la proteína de la cápside del virus de la hepatitis E como una nanopartícula de teranosis (HEVNP). HEVNP uno mismo-monta en una jaula icosaédrica estable en la prestación de la mucosa. Aquí, describimos la modificación de HEVNPs para el tumor por mutando residuos superficie expuesta a las cisteínas, que conjugan sintético ligandos que se unen específicamente a las células del tumor.

Funcionalización superficial de nanopartículas de Virus de Hepatitis E métodos de conjugación química

El protocolo aquí descrito permite a los investigadores modificar específicamente cápsida de adenovirus en sitios seleccionados por simple química. Blindado adenovirus vectores partículas pueden generarse vectores de transferencia génica versión y vector host interacciones pueden ser estudiadas.

Combinado de modificaciones genéticas y químicas cápside de vectores basados en Adenovirus la transferencia de genes para blindar y dirigidos a

Aquí se presenta un protocolo para un enfoque de imágenes de fluorescencia, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA y protein (MICDDRP), un método capaz de la visualización simultánea de fluorescencia unicelular de proteínas virales y ácidos nucleicos de diferente tipo y varamiento. Este enfoque se puede aplicar a una amplia gama de sistemas.

Imágenes de fluorescencia multiplexada de una sola célula para visualizar ácidos nucleicos y proteínas virales y monitorear el VIH, el HTLV, el VHB, el VHC, el virus del Zika y la infección por influenza

Aprende a funcionalizar fluorescente partículas similares a virus con disulfuros usando dibromomaleimida. Este método permite introducir grupos funcionales y fluoróforos en una sola reacción con Qβ.

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