Lo verbal-inducida fluorescentes pegilado Virus-como partículas por disulfuro de Dibromomaleimide química
27 de mayo de 2018
Aquí, presentamos un procedimiento para fluorescencia funcionalizar los disulfuros de Qβ VLP con dibromomaleimide. Describimos Qβ expresión y purificación, la síntesis de moléculas de dibromomaleimide funcionalizados y la reacción de Conjugación entre dibromomaleimide y Qβ. La partícula conjugada fluorescente amarillo resultante puede utilizarse como una sonda de fluorescencia dentro de las células.
El objetivo general de este método de bioconjugación consiste en funcionalizar fluorescentemente partículas tipo virus que contienen disulfuros. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la reacción de bioconjugación en partículas tipo virus que poseen un número limitado de residuos de aminoácidos que pueden ser funcionalizados. La principal ventaja de esta técnica radica en que, mediante una sola reacción, se pueden introducir nuevos grupos funcionales y formar simultáneamente fluoróforos inducidos por la conjugación. Además del Q-Beta, consideramos que esta reacción puede aplicarse a cualquier partícula tipo virus que posea enlaces disulfuro.
Antes de comenzar el procedimiento para expresar el bacteriófago Q-Beta, limpie el área de trabajo con una solución de hipoclorito de sodio:etanol en proporción 1:1. En un ambiente aséptico, prepare dos cultivos iniciadores de tres mililitros agregando colonias individuales de E.coli BL21 a medio SOB. Incube los cultivos durante la noche en una sala a 37 grados Celsius y 0 % de humedad relativa, agitando a 250 rpm. Al día siguiente, retire ambos cultivos iniciadores de tres mililitros del agitador y, en un ambiente aséptico, vierta cada cultivo en un matraz Erlenmeyer de dos litros con placas deflectoras que contenga un litro de medio SOB fresco. Coloque los dos matraces con medio inoculado en un agitador a 250 rpm, en la sala a 37 grados Celsius y 0 % de humedad relativa. Incube las bacterias hasta que alcancen una densidad óptica a 600 nanómetros (OD 600) de 0,9 a 1,0. Esto generalmente toma aproximadamente cinco horas. Cuando los cultivos alcancen la OD 600 deseada, utilice una pipeta P1000 para agregar un mililitro de IPTG uno molar a cada matraz, con el fin de inducir la expresión proteica. Deje los matraces en el agitador en la sala tibia durante la noche.
La mañana siguiente, retire los matraces del agitador, transfiera el contenido de cada matraz a una botella de un litro y centrifugue a 20.621 ×g a cuatro grados Celsius durante una hora para recolectar las células. Una vez finalizada la centrifugación, deseche el sobrenadante vertiéndolo en un matraz con aproximadamente cinco mililitros de lejía para eliminar las bacterias.
Para recoger el sedimento celular, utilice una espátula para raspar el sedimento celular del fondo del frasco de centrífuga y transfiera el sedimento a un tubo de centrífuga de 50 mililitros.
Para comenzar el procedimiento de purificación de Q-Beta, re-suspenda cada pellet celular con 20 a 30 mililitros de tampón de fosfato de potasio 0,1 molar, pH 7. Asegúrese de que la re-suspensión no tenga grumos. Lise las células utilizando un procesador microfluidizador según el protocolo del fabricante. Lise las células al menos dos veces para aumentar el rendimiento de las partículas. Transfiera los lisados a botellas de centrífuga de 250 mililitros y centrifugue a 20.621 ×g a cuatro grados Celsius durante una hora. Mida el volumen del sobrenadante en mililitros. Multiplique ese valor por 0,265 y luego añada al sobrenadante esa cantidad en gramos de sulfato de amonio. Añada una barra de agitación e agite en una placa agitadora a 200 rpm a cuatro grados Celsius durante al menos una hora para precipitar la proteína. Centrifugue en botellas de 250 mililitros a 20.621 ×g a cuatro grados Celsius durante una hora. Deseche el sobrenadante y re-suspenda el pellet con aproximadamente 40 mililitros de tampón de fosfato de potasio 0,1 molar, pH 7. Añada al muestra cruda volúmenes iguales de cloroformo:n-butanol 1:1 y mezcle por vortex durante unos segundos. Transfiera la mezcla a un tubo de 38 mililitros. Centrifugue a 20.621 ×g a cuatro grados Celsius durante 30 minutos. Utilice una pipeta para recuperar la capa acuosa superior. Tenga cuidado de no tomar ninguna parte de la capa gelatinosa que se ha formado entre las capas acuosa y orgánica.
A continuación, descongele gradientes de sacarosa preformados del 65 al 40 %. Cargue aproximadamente dos mililitros del extracto en cada gradiente.
Ultracentrifugar a 99.582 × g a cuatro grados Celsius durante 16 horas con desaceleración libre. Cuando finalice la ultracentrifugación, ilumine con una luz de diodo emisor de luz bajo cada tubo para confirmar que sea visible una banda azul. Utilice una jeringa con aguja larga para recuperar estas partículas. Ultracentrifugar el pellet a 370.541 × g a cuatro grados Celsius durante 2,5 horas. El pellet resultante de partículas purificadas debe ser transparente. Deseche el sobrenadante y re-suspenda el pellet con tampón de fosfato de potasio 0,1 molar, pH 7.
Este esquema muestra la conjugación que se demostrará. Se utilizan 10 equivalentes de tris(2-carboxietil)fosfina o TCEP con respecto a los disulfuros en un miligramo de Q-Beta para reducir todos los disulfuros y generar las cápsides de Q-Beta reducidas a temperatura ambiente en una hora. Justo antes de la reducción de los disulfuros en Q-Beta, prepare una solución fresca de TCEP.
Disuelva 0,002 gramos de TCEP y un mililitro de agua ultrapura para obtener una solución stock 100X. Añada 200 microlitros de Q-Beta a cinco miligramos por mililitro en un tubo de microcentrifugado. Luego, añada 20 microlitros de la solución stock 100X de TCEP al tubo de microcentrifugado. Incube a temperatura ambiente durante una hora.
Mientras tanto, prepare la solución de polietilenglicol dibromomaleimida o DB-PEG para la posterior reacción de reencadenamiento de los disulfuros reducidos. Disuelva 0,0017 gramos de DB-PEG en 100 microlitros de dimetilformamida. Añada 680 microlitros de solución de fosfato de sodio 10 milimolar, pH 5. A continuación, agregue el Q-Beta reducido a la solución de DB-PEG y observe el proceso de mezclado bajo una lámpara de luz ultravioleta portátil de 365 nanómetros. Al mezclar, debe observarse inmediatamente una fluorescencia amarillo brillante. Deje que la reacción transcurra a temperatura ambiente en un rotisero durante la noche.
Al día siguiente por la mañana, purifique la mezcla de reacción mediante un filtro centrífugo utilizando PBS 1X a 3.283 veces la gravedad a cuatro grados Celsius durante 20 minutos. Por último, supervise la conjugación mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS no reductora y electroforesis en gel de agarosa nativa.
La conjugación de DB-PEG en Q-Beta se confirmó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS no reductora bajo luz UV y tinción con azul de Coomassie. Todas las bandas fluorescentes co-localizaron con la tinción de azul de Coomassie, lo que indica una conjugación exitosa. La integridad de los conjugados Q-Beta-PEG se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa nativa y microscopía electrónica de transmisión.
La micrografía superior muestra Q-Beta-maleimida o Q-Beta-M y la micrografía inferior muestra Q-Beta-PEG. La espectroscopía de fluorescencia de Q-Beta-M y Q-Beta-PEG en tampón fosfato de potasio 0,1 molar mostró un máximo de excitación alrededor de 400 nanómetros y un máximo de emisión alrededor de 540 a 550 nanómetros. Cuando Q-Beta-PEG se incubó con células de macrófagos de ratón en medio DMEM sin suero seguido de tinción nuclear, las imágenes de co-localización muestran que las partículas fluorescentes amarillas fueron incorporadas por las células y pueden rastrearse tras cuatro horas de incubación.
En contraste, las partículas tipo virus Q-Beta sin funcionalizar muestran una fluorescencia despreciable.
Este protocolo puede ayudar a los investigadores a purificar Q-Beta en cuatro días y realizar la reacción de conjugación con puente invertido durante la noche. Al llevar a cabo este procedimiento, es importante recordar que la reacción de conjugación funciona mejor en condiciones ácidas, como un pH de 5.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo purificar el VLP de Q-Beta y volver a unir los enlaces disulfuro con compuestos dibromo-maleimida para obtener un VLP marcado con fluorescencia. Tras su desarrollo, esta técnica proporcionó a los investigadores un nuevo mango funcional que puede utilizarse para dual-funcionalizar la superficie exterior del bacteriófago Q-Beta.
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Resumen
Este artículo presenta un método de bioconjugación para funcionalizar fluorescentemente partículas tipo virus que contienen disulfuros, específicamente partículas tipo virus Qβ. La técnica permite la introducción de nuevos grupos funcionales y la formación de fluoróforos inducidos por conjugación en una sola reacción.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Bioconjugación
- Partículas similares a virus
- Etiquetado fluorescente
Antecedentes
- Los enlaces disulfuro en partículas similares a virus limitan las opciones de funcionalización.
- Las sondas fluorescentes son esenciales para los estudios celulares.
- El bacteriófago Qβ sirve como modelo para este método.
- Las técnicas asépticas son cruciales para experimentos exitosos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para funcionalizar disulfuros en partículas tipo virus Qβ.
- Posibilitar el estudio de reacciones de bioconjugación en partículas tipo virus.
- Crear sondas fluorescentes para aplicaciones celulares.
Métodos Utilizados
- Expresión y purificación del bacteriófago Qβ.
- Síntesis de moléculas funcionalizadas con dibromomalaimida.
- Reacción de conjugación entre dibromomalaimida y Qβ.
- Uso de técnicas asépticas en la preparación de cultivos iniciadores.
Resultados Principales
- Funcionalización fluorescente exitosa de partículas tipo virus Qβ.
- Formación de partículas conjugadas fluorescentes de color amarillo.
- Aplicación potencial del método a otras partículas tipo virus.
- Demostración de una reacción única que introduce múltiples grupos funcionales.
Conclusiones
- El método etiqueta eficazmente con fluorescencia partículas similares a virus que contienen disulfuros.
- Esta técnica puede mejorar el estudio de la bioconjugación en virología.
- Las aplicaciones futuras podrían extenderse a diversas partículas similares a virus que poseen enlaces disulfuro.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la bifuncionalización de partículas similares a virus mediante la introducción de ligandos sintéticos y la generación de fluorescencia intrínseca en un solo paso, abordando las limitadas opciones de bioconjugación en VLP ricas en disulfuros. Las sondas fluorescentes resultantes permiten estudios de captación celular y el seguimiento en tiempo real in vitro, mejorando los flujos de trabajo en la validación de dianas y el desarrollo de ensayos. Al ampliar el conjunto de herramientas químicas para la modificación de VLP, la técnica incrementa la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento y reduce la ambigüedad mecanicista en la investigación sobre la entrega de cargas útiles.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la funcionalización específica de sitios en enlaces disulfuro expuestos al solvente en partículas virales similares a virus (VLPs).
- Valor operativo: Combina la unión de ligandos y la generación de fluoróforos en una sola reacción, agilizando la síntesis de sondas para estudios de interacción con dianas.
- Valor predictivo: Genera VLPs fluorescentes detectables que permiten ensayos de internalización celular y modelado de biodistribución.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Produce lotes estandarizados de partículas virales pseudotipadas marcadas con fluorescencia, adecuados para cribado de alto contenido y ensayos de unión.
- Valor operativo: Utiliza conjuntos de filtros disponibles comercialmente (excitación ~400 nm, emisión 540–550 nm) para una detección sencilla sin necesidad de instrumentación personalizada.
- Escalabilidad: Permite la preparación de bibliotecas de sondas para estudios de relaciones estructura-actividad en interacciones ligando-receptor.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Los VLP fluorescentes demuestran captación celular en modelos de macrófagos, lo que apoya el perfilado de biodistribución y farmacocinética.
- Reducción de Riesgos: Permite evaluar el impacto de modificaciones superficiales en la estabilidad de los VLP y en el reconocimiento inmune antes de realizar estudios in vivo.
- Alineación con Biomarcadores: Facilita la correlación de la localización de los VLP con marcadores celulares en protocolos de imagen de co-localización.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en la secuencia de descubrimiento desde la producción de partículas virales similares a virus (VLP) hasta la identificación de fármacos líderes, permitiendo la generación rápida de sondas funcionalizadas para ensayos posteriores y estudios mecanicistas.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis al permitir la modificación dual de partículas virales pseudotipadas (VLP) con grupos de seguimiento y terapéuticos.
- Tamizaje: Genera VLP fluorescentes estandarizadas para ensayos cuantitativos de unión e internalización.
- Análisis: Proporciona lecturas basadas en fluorescencia para cuantificar las interacciones entre VLP y células, así como la eficiencia de conjugación.
- Investigación Traducional: Se conecta con trabajos preclínicos mediante la evaluación demostrada de la captación por macrófagos y la estabilidad.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma modular para la funcionalización de VLP aplicable a múltiples sistemas que contienen disulfuros.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación del blanco al permitir sondas de partículas virales pseudotipadas (VLP) precisas y trazables para estudios del mecanismo de acción.
- Valor operativo: Estandariza la conjugación en condiciones ácidas definidas (pH 5) para garantizar la reproducibilidad entre lotes.
- Valor estratégico: Reduce la necesidad de pasos separados de marcado y purificación, mejorando la eficiencia del capital en el desarrollo de sondas.
- Impacto en el portafolio: Apoya el avance ajustado al riesgo al proporcionar datos funcionales tempranos sobre constructos basados en VLP.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la expresión y purificación de proteínas, así como en el manejo anaeróbico de proteínas que contengan disulfuros.
- Necesita acceso a microfluidizadores, ultracentrífugas y sistemas de detección de fluorescencia con conjuntos de filtros adecuados.
- Exige técnica aséptica y conocimiento sobre endotoxinas para aplicaciones celulares.
- Puede ser necesaria una optimización al extender el método a partículas tipo virus (VLPs) con distinta accesibilidad de disulfuros o carga superficial.
- Limitación práctica: La eficiencia depende del mantenimiento de condiciones reductoras durante el reensamblaje de disulfuros y de la prevención de la degradación oxidativa.
