Lo verbal-inducida fluorescentes pegilado Virus-como partículas por disulfuro de Dibromomaleimide química

Aquí, presentamos un procedimiento para fluorescencia funcionalizar los disulfuros de Qβ VLP con dibromomaleimide. Describimos Qβ expresión y purificación, la síntesis de moléculas de dibromomaleimide funcionalizados y la reacción de Conjugación entre dibromomaleimide y Qβ. La partícula conjugada fluorescente amarillo resultante puede utilizarse como una sonda de fluorescencia dentro de las células.

El objetivo general de este método de bioconjugación es funcionalizar fluorescentemente partículas similares a virus que contienen disulfuro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la reacción de bioconjugación para partículas similares a virus que tienen un número limitado de residuos de aminoácidos que se pueden funcionalizar. La principal ventaja de esta técnica es que mediante el uso de una reacción se pueden introducir nuevos grupos funcionales y se pueden formar fluoróforos inducidos por conjugación al mismo tiempo.

Además de QBeta, creemos que esta reacción se puede aplicar a cualquier partícula similar a un virus que posea enlaces disulfuro. Antes de comenzar el procedimiento de extracción del bacteriófago QBeta, limpie el área del banco con una solución de lejía:etanol 1:1. En un ambiente aséptico, haga dos cultivos iniciadores de tres mililitros agregando colonias individuales de E. coli BL21 en medios SOB.

Cultive los cultivos en una habitación de 37 grados centígrados y 0% de humedad relativa con agitación a 250 rpm durante la noche. Al día siguiente, retire los dos cultivos iniciadores de tres mililitros de la coctelera y, en un entorno aséptico, vierta cada cultivo iniciador en un matraz Erlenmeyer deflector de dos litros con un litro de medios SOB frescos. Coloque los dos matraces de medios inoculados en un agitador a 250 rpm en la sala de 37 grados centígrados y 0% de humedad relativa.

Cultive las bacterias hasta que alcancen una densidad óptica de 600 nanómetros o OD 600 de 0,9 a 1,0. Esto suele tardar unas cinco horas. Cuando los cultivos estén en el diámetro exterior deseado de 600, utilice una pipeta P1000 para añadir un mililitro de IPTG de un molar a cada matraz para inducir la expresión de proteínas.

Deje los frascos en la coctelera en la habitación cálida durante la noche. A la mañana siguiente, retire los matraces de la coctelera, transfiera el contenido de cada matraz a una botella de un litro y centrifugue a 20,621 veces la gravedad a cuatro grados centígrados durante una hora para recolectar las células. Cuando termine la centrifugación, deseche el sobrenadante vertiéndolo en un matraz con unos cinco mililitros de lejía para matar las bacterias.

Para recolectar el pellet de celda, use una espátula para raspar el pellet de celda del fondo de la botella de centrífuga y transfiera el pellet a un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Para comenzar el procedimiento de purificación de QBeta, vuelva a suspender cada pellet de celda con 20 a 30 mililitros de tampón de fosfato de potasio 0,1 molar, pH 7. Asegúrese de que la resuspensión no tenga trozos.

Lisar las células utilizando un procesador microfluidificador de acuerdo con el protocolo del fabricante. Lisar las células al menos dos veces para aumentar el rendimiento de las partículas. Transfiera los lisados a botellas de centrífuga de 250 mililitros y centrifugue a 20, 621 veces la gravedad a cuatro grados Celsius durante una hora.

Mide el volumen del sobrenadante en mililitros. Multiplique ese valor por 0,265 y luego agregue al sobrenadante esa cantidad en gramos de sulfato de amonio. Agregue una barra de agitación y revuelva en una placa de agitación a 200 rpm a cuatro grados centígrados durante al menos una hora para precipitar la proteína.

Centrifugar en botellas de 250 mililitros a 20, 621 veces la gravedad a cuatro grados centígrados durante una hora. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con unos 40 mililitros de tampón de fosfato de potasio 0,1 molar, pH 7. Añadir a la muestra bruta volúmenes iguales de cloroformo:n-butanol 1:1 y mezclar por vórtice durante unos segundos.

Transfiere la mezcla a un tubo de 38 mililitros. Centrifugar a 20, 621 veces la gravedad a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Utilice una pipeta para recuperar la capa acuosa superior.

Tenga cuidado de no tomar nada de la capa gelatinosa que se ha formado entre las capas acuosa y orgánica. A continuación, descongele seis gradientes de sacarosa prefabricados del 5 al 40%. Cargue aproximadamente dos mililitros del extracto en cada gradiente.

Ultracentrífuga a 99, 582 veces la gravedad a cuatro grados centígrados durante 16 horas con desaceleración libre. Cuando se complete la ultracentrifugación, haga brillar una luz de diodo emisora de luz debajo de cada tubo para confirmar que se vea una banda azul. Use una jeringa de aguja larga para recuperar estas partículas.

Ultra-pellet las partículas a 370, 541 veces la gravedad a cuatro grados centígrados durante 2,5 horas. La bolita resultante de partículas purificadas debe ser transparente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con tampón de fosfato de potasio 0,1 molar, pH 7.

Este esquema muestra la conjugación que se demostrará. Se utilizan 10 equivalentes de Tris(2-carboxietil)fosfina o TCEP en relación con los disulfuros en un miligramo de QBeta para reducir todos los disulfuros y generar las cápsidas reducidas de QBeta a temperatura ambiente en una hora. Justo antes de la reducción de disulfuros en QBeta, prepare una nueva solución de TCEP.

Disuelva 0,002 gramos de TCEP y un mililitro de agua ultrapura para hacer una solución madre 100X. Agregue 200 microlitros de cinco miligramos por mililitro QBeta en un tubo de microcentrífuga. A continuación, añada 20 microlitros de la solución madre 100X TCEP al tubo de microcentrífuga.

Incubar a temperatura ambiente durante una hora. Mientras tanto, prepare la solución de dibromomaleimida polietilenglicol o DB-PEG para la reacción posterior de repuenteo de disulfuros reducidos. Disolver 0,0017 gramos de DB-PEG en 100 microlitros de dimetilformamida.

Agregue 680 microlitros de solución de fosfato de sodio de 10 milimolares, pH 5. A continuación, agregue el QBeta reducido a la solución de DB-PEG y observe el proceso de mezcla bajo una lámpara UV portátil de 365 nanómetros. Al mezclar, una fluorescencia amarilla brillante debería ser inmediatamente visible.

Deje que la reacción proceda a temperatura ambiente en un asador durante la noche. A la mañana siguiente, purifique la mezcla de reacción mediante un filtro centrífugo utilizando 1X PBS a 3.283 veces la gravedad a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Por último, monitorizar la conjugación mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS no reductor y electroforesis en gel de agarosa nativa.

La conjugación de DB-PEG en QBeta se confirmó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS no reductor bajo tinción UV y azul de Coomassie. Todas las bandas fluorescentes colocalizadas con la tinción con azul de Coomassie, lo que representa una conjugación exitosa. La integridad de los conjugados QBeta-PEG se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa nativa y microscopía electrónica de transmisión.

La micrografía superior muestra QBeta-maleimida o QBeta-M y la micrografía inferior muestra QBeta-PEG. La espectroscopia de fluorescencia de QBeta-M y QBeta-PEG en 0,1 molar de tampón de fosfato de potasio mostró un máximo de excitación de alrededor de 400 nanómetros y un máximo de emisión de alrededor de 540 a 550 nanómetros. Cuando QBeta-PEG se incubó con células de macrófagos de ratón en medio DMEM libre de suero seguido de tinción de nucleos, las imágenes de colocalización muestran que las partículas fluorescentes amarillas fueron absorbidas por las células y se pueden rastrear después de cuatro horas de incubación.

Por el contrario, las partículas similares al virus QBeta no funcionalizadas muestran una fluorescencia insignificante. Este protocolo puede ayudar a los investigadores a purificar QBeta en cuatro días y realizar la reacción de conjugación de puente durante la noche. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la reacción de conjugación funciona mejor en condiciones ácidas, como pH 5.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo purificar QBeta VLP y volver a unir los enlaces disulfuro con los compuestos de dibromomaleimida para hacer una VLP marcada con fluorescencia. Después de su desarrollo, esta técnica proporcionó a los investigadores un mango funcional adicional que se puede utilizar para funcionalizar dualmente la superficie exterior del bacteriófago QBeta.