Grabación espacial restringido a oscilaciones en el hipocampo de ratones de comportarse
1 de julio de 2018
Este protocolo describe la grabación de potenciales de campo local con caña múltiples sondas de silicona lineal. La conversión de las señales mediante análisis de densidad de fuente actual permite la reconstrucción de la actividad eléctrica local en el hipocampo del ratón. Con esta técnica, se pueden estudiar las oscilaciones del cerebro espacialmente restringida libremente mover ratones.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como cómo se organizan las actividades de la red neuronal a escalas temporales y espaciales finas. La principal ventaja de esta técnica es que el análisis de datos de corriente mediante el uso de sondas lineales de silicio permite la reconstrucción de oscilaciones locales que no se pueden detectar fácilmente en los registros de potencial de campo convencionales. Para comenzar este procedimiento, esterilice los instrumentos quirúrgicos con un esterilizador de perlas calientes, luego, limpie todas las superficies de trabajo con etanol al 70%.
A continuación, monte al animal anestesiado en un marco estereotáxico insertando suavemente las barras de los oídos en el canal auditivo. Una vez que la cabeza del ratón esté estabilizada por las barras de las orejas, coloque una boquilla sobre el hocico para la administración continua de isoflurano, luego aplique ungüento en los ojos para evitar que se sequen. Posteriormente, coloque una almohadilla térmica debajo del ratón e inyecte buprenorfina por vía subcutánea para asegurar la analgesia postoperatoria.
Posteriormente, afeitar su cabeza y desinfectar la piel con etanol al 70%. Con unas tijeras quirúrgicas, haga una incisión en la piel a lo largo de la línea media del cráneo y abra la piel con pinzas quirúrgicas. Alinee la cabeza del animal con la ayuda de una herramienta de alineación estereotáxica para nivelar bregma y lambda.
Debe haber menos de 50 micrómetros de distancia de altura entre bregma y lambda. Además, nivele la cabeza a lo largo del eje medial-lateral midiendo la profundidad a una distancia definida del bregma tanto en el lado izquierdo como en el derecho. Ajuste la cabeza si está inclinada.
Limpie la cabeza con peróxido de hidrógeno al 3% y séquela con toallitas de algodón estériles. Determinar la localización de la craneotomía en relación con el bregma utilizando un atlas estereotáxico adecuado. Con una cabeza de perforación de 0,9 milímetros, taladre dos orificios para tornillos en el hueso sobre el cerebelo para colocar los tornillos de tierra y de referencia.
Además, taladre de uno a tres orificios para anclar los tornillos para estabilizar el implante. La ubicación de los tornillos de anclaje dependerá de la ubicación de la craneotomía. Inserte los tornillos en el hueso con un destornillador adecuado.
Tenga cuidado de no penetrar en el cerebro. Ahora, realice la craneotomía adelgazando lentamente el cráneo con el taladro en un área rectangular alrededor del lado de implantación. Humedecer frecuentemente el hueso con tampón de fosfato esterilizado.
Perfore suavemente el cráneo adelgazado restante con una aguja de inyección de calibre 27 y retírelo con un par de pinzas. A continuación, perfore cuidadosamente la duramadre con una aguja de inyección de calibre 27. Con un par de pinzas, forme un pequeño gancho doblando la punta de la aguja y use este gancho para quitar la duramadre.
Luego, aplique tampón de fosfato para evitar que la superficie del cerebro se seque. A continuación, monte la herramienta de inserción de electrodos en un soporte estereotáxico y ponga a cero la sonda en bregma. Mueva la sonda a las coordenadas estereotáxicas sobre la craneotomía y penetre lentamente en la superficie cerebral.
Asegúrese de que los ejes de la sonda no se doblen y evite implantarse a través de los vasos sanguíneos. Luego, baje lentamente la sonda hasta unos 200 micrómetros por encima de la profundidad deseada. A continuación, cubra la craneotomía y los vástagos de la sonda de silicona con vaselina esterilizada para su protección.
Posteriormente, aplicar cemento dental para fijar la base de la sonda al tornillo de anclaje en el cráneo. Inmediatamente después de la aplicación del cemento, mueva lentamente la sonda a la profundidad objetivo. Avance los últimos 200 micrómetros después de aplicar el cemento para reducir el movimiento lateral de la sonda y garantizar un daño mínimo al tejido en el área objetivo.
Después de que el cemento se haya curado, libere la sonda de la herramienta de inserción derritiendo la cera con un cauterizador. A continuación, suelte la placa de conexión del dispositivo de inserción y colóquela en un lugar adecuado del cráneo con una pinza de cocodrilo. Fije la placa de conexión al cráneo con cemento dental.
En el caso de implantación de una sonda en el hipocampo, coloque la placa de conexión en el hueso parietal contralateral. Luego, suelde los cables de tierra y de referencia de la placa de conectores a los cables conectados a los dos tornillos sobre el cerebelo. Ajuste la cubierta protectora a la altura correcta y colóquela sobre la sonda de silicona.
Luego, fije la cubierta de la placa de conexión y el cráneo con cemento dental, evitando la piel alrededor del cráneo expuesto. Después de la cirugía, aplique el tratamiento analgésico adecuado al ratón durante al menos dos días. Aloje el ratón en una sola casa para evitar daños en el implante.
Aquí se muestran las grabaciones de las sondas de silicio implantadas crónicamente dirigidas al área CA1. El análisis de densidad de la fuente de corriente se aplica a lo largo de los vástagos individuales de la sonda. En este ejemplo, un solo evento de ondulación de onda aguda conduce a un sumidero de corriente prominente en el estrato radiado de CA1 y en el segundo ejemplo, se registraron dos sitios distintos en la capa de células granulosas del giro dentado.
La banda gamma alta se aisló aplicando un filtro de paso de banda de 60 a 80 hercios, revelando ráfagas gamma locales en uno de los dos sitios de registro ubicados en la capa de células granulosas. Tenga en cuenta que la actividad de oscilación gamma local solo se puede detectar después de la conversión de las señales registradas a CSD. Las señales CSD, pero no las LFP, identifican los períodos de fase y amplitud asincrónica entre ambos sitios de registro.
Este segmento muestra una breve época de actividad gamma sincronizada. Las trazas aquí ilustran la diferencia de fase y el índice de diferencia de amplitud para las trazas LFP y CSD. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo implantar sondas de silicona en el hipocampo.
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Descripción general
Este protocolo describe la grabación de potenciales de campo locales mediante el uso de sondas de silicio lineales con múltiples brazos para investigar la actividad eléctrica local en el hipocampo de ratón. Mediante el análisis de densidad de corriente, permite el estudio de oscilaciones cerebrales espacialmente restringidas en ratones libres de movimiento.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Electrofisiología
- Función del hipocampo
Antecedentes
- Comprensión de la organización de redes neuronales a escalas finas.
- El análisis de densidad de corriente de fuente mejora la detección de oscilaciones cerebrales.
- Las sondas multibrazo permiten la cartografía precisa de la actividad eléctrica.
- Las oscilaciones del hipocampo son fundamentales para las funciones cognitivas.
Objetivo del estudio
- Elucidar la organización espacial y temporal de las actividades neuronales.
- Mejorar las metodologías para registrar la actividad eléctrica cerebral.
- Investigar las oscilaciones locales con una resolución más fina que los métodos convencionales.
Métodos Utilizados
- Se implantaron sondas lineales de silicio con múltiples brazos en el hipocampo.
- El modelo utilizado consistió en ratones libres de movimiento para estudiar la dinámica cerebral in vivo.
- No se mencionaron flujos de trabajo de multiómica.
- Se describieron las técnicas clave quirúrgicas y estereotáxicas para la implantación de las sondas.
- Se aplicó análisis de densidad de corriente fuente tras la grabación para interpretar los datos.
Resultados principales
- Centrarse en el análisis de eventos de onda aguda con rizo en grabaciones del hipocampo.
- Se demostró una detección mejorada de oscilaciones gamma localizadas.
- Se observaron diferencias notorias en fase y amplitud en los potenciales de campo locales tras la conversión a CSD.
- Los resultados resaltan las ventajas del uso de CSD frente a los análisis convencionales de LFP.
Conclusiones
- Este estudio valida la utilidad de las sondas de silicio para la investigación profunda del hipocampo.
- No se discutieron datos de multiómica; el enfoque se mantuvo en los conocimientos electrofisiológicos.
- Las implicaciones sugieren que una mejor comprensión de las dinámicas oscilatorias neuronales podría mejorar el conocimiento de los procesos de memoria y aprendizaje.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la detección de alta resolución de oscilaciones neuronales espacialmente restringidas en el hipocampo, abordando un desafío clave en la neurociencia preclínica: distinguir la actividad verdadera de redes locales de las señales conducidas por volumen. Al aplicar el análisis de densidad de corriente de fuente (CSD) a grabaciones multilaminares de potenciales de campo locales (LFP) obtenidas mediante sondas de silicio, los investigadores pueden aislar dinámicas a nivel de microcircuitos relacionadas con la memoria y la función cognitiva. Esto apoya la validación de dianas y la reducción mecanicista de riesgos en las fases iniciales del descubrimiento, al proporcionar lecturas reproducibles y cuantificables de los estados de red hipocampal en modelos con comportamiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la organización de microcircuitos del hipocampo subyacentes a las ondas agudas con ráfagas y a las oscilaciones gamma, que están implicadas en la consolidación de la memoria.
- Valor operativo: Proporciona lecturas electrofisiológicas con resolución espacial que ayudan a distinguir efectos específicos del blanco de perturbaciones de red no específicas.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera perfiles cuantitativos de sumideros/fuentes de corriente específicos por capas que sirven como biomarcadores robustos del compromiso del circuito local.
- Valor operativo: Estandariza la medición de la actividad oscilatoria entre estrías y animales, favoreciendo la reproducibilidad del ensayo en estudios longitudinales.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor Científico: Relaciona los patrones oscilatorios derivados de LFP con estados conductuales en ratones libres de movimiento, mejorando la validez predictiva para los puntos finales cognitivos.
- Valor Operativo: Permite la detección de la desacoplamiento fase-amplitud entre sitios de registro que solo es visible en CSD, ofreciendo una métrica sensible para la disfunción de la red.
Integración de la Línea de Procesamiento y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento que va desde la comprobación de hipótesis en biología temprana hasta la optimización de fármacos, donde los fenotipos oscilatorios de la red pueden aportar información sobre la interacción con el blanco y la selectividad del circuito.
- Biología del descubrimiento: Apoya la investigación mecanicista de las oscilaciones en red del hipocampo para aclarar los efectos mediados por el blanco sobre la sincronía neuronal.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas estandarizadas de CSD (por ejemplo, potencia en banda gamma, incidencia de ripples) adecuadas para la selección de alta fidelidad de moduladores farmacológicos.
- Análisis: Permite extraer índices de asimetría de fase y amplitud a partir de trazas de CSD, ofreciendo medidas objetivas de la coordinación de la red neuronal.
- Investigación traslacional: Conecta las firmas oscilatorias locales con el comportamiento, apoyando la alineación de biomarcadores con dominios cognitivos relevantes para indicaciones neuropsiquiátricas.
- Reutilización empresarial: Establece una plataforma electrofisiológica reutilizable para el monitoreo longitudinal del estado de la red en diversos modelos de enfermedad y cohortes de tratamiento.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al aislar verdaderas oscilaciones locales de señales de conducción volumétrica confusas en los datos de potenciales de campo locales (LFP).
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante protocolos estandarizados de colocación de sondas, cálculo de densidad de corriente de fuente (CSD) y filtrado de banda (por ejemplo, 60–80 Hz para gamma alta).
- Valor estratégico: Reduce la incertidumbre en la desvinculación biológica al permitir la detección de cambios sutiles en la red (por ejemplo, desincronización de fase) que pasan inadvertidos en los LFP convencionales.
- Impacto en la cartera: Informa decisiones de avance o no avance basadas en la participación del objetivo a nivel de red, en lugar de cambios en la actividad general.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cirugía estereotáxica, electrofisiología y transformación matemática de CSD.
- Depende de la instrumentación con sondas de silicio lineales, sistemas de adquisición capaces de grabar LFP multicanal y herramientas de posprocesamiento para la estimación de derivadas espaciales.
- Necesita la estandarización entre equipos de la profundidad de la sonda, la orientación del brazo y los parámetros de filtrado para garantizar la comparabilidad entre estudios.
- La adaptación a otras regiones cerebrales requiere el ajuste de las coordenadas estereotáxicas y la validación de la estructura laminar para una interpretación precisa de CSD.
- Las limitaciones prácticas incluyen la invasividad quirúrgica, la deriva de la señal en implantes crónicos y la necesidad de validación experta de los sumideros/fuentes de CSD frente a referencias histológicas.
