Aislamiento, caracterización y alto rendimiento análisis de flujo extracelular de ratón células epiteliales tubulares renales primarias

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el metabolismo renal, como la oxidación de ácidos grasos, que está estrechamente relacionada con el desarrollo de fibrosis renal y otras nefropatías. La principal ventaja de esta técnica es el uso de una plataforma de alto rendimiento para detectar compuestos que regulan la bioenergética mitocondrial en células epiteliales tubulares renales. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de la enfermedad metabólica renal, ya que permite un cribado de alta intensidad de los compuestos que regulan el metabolismo mitocondrial en las células epiteliales renales.

Para preparar las placas de Petri de 60 milímetros recubiertas de colágeno, agregue dos mililitros de ácido acético prefiltrado de 20 milimolares seguido de 35 microlitros de solución de colágeno I a cada plato. Luego, incuba la placa a temperatura ambiente durante una hora, sécala al aire y expóngala a los rayos UV. A continuación, enjuague los residuos de ácido acético con PBS. Realiza tres enjuagues.

Luego, guarde el plato en una incubadora de cultivo celular libre de dióxido de carbono a 37 grados centígrados. Después de preparar al ratón para la cirugía, retire el pelaje del pecho y el abdomen con una crema depilatoria. Luego, desinfecte la piel con yodo y limpie los residuos de yodo.

A continuación, haga una incisión para abrir la cavidad abdominal y exponer el corazón y los riñones. Ahora, configure una bomba de perfusión a 32 mililitros por minuto y elimine las burbujas en el tubo antes de comenzar la perfusión. Use una aguja de calibre 27 al final de la línea.

Para continuar, inserte una aguja en el ventrículo izquierdo a través del vértice cardíaco. Tan pronto como el tampón llene el corazón, haga un orificio en la aurícula derecha para crear una salida para el tampón de perfusión. A continuación, cambie al tampón de digestión y reduzca ligeramente la velocidad de la bomba a 30 mililitros por minuto para la digestión.

Después de haber perfundido 20 mililitros de tampón de digestión, retire ambos riñones para el aislamiento de las células tubulares. Para procesar los riñones extraídos, primero, extraiga las cápsulas renales y la médula. Luego, pica ambos riñones en pedazos pequeños e incubalos en 10 mililitros de un tampón de digestión en un horno a 37 grados centígrados con rotación suave durante cinco minutos.

Después de la digestión, elimine los tejidos no digeridos pasando el tampón a través de un filtro de 70 micras. Después de recolectar el tejido digerido, agregue 10 mililitros de medio de cultivo para detener la digestión. A continuación, centrifugar la suspensión de tejido filtrado a 50 g durante cinco minutos para granular las células tubulares.

A continuación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo, añada cinco mililitros de medio de cultivo y repita la centrifugación para recoger las células tubulares restantes. Ahora, vuelva a suspender el primer pellet en 20 mililitros de medio de cultivo y centrifugue a 50 g durante cinco minutos para purificar aún más las células recolectadas. Deseche el sobrenadante.

Luego, vuelva a suspender ambos gránulos en 10 mililitros de medio de cultivo. A continuación, cuente las células vivas con tinción con azul de tripano. Luego, siembra hasta 10 millones de células en un plato de 60 milímetros recubierto de colágeno y deja que las células tubulares se adhieran durante la noche.

Para empezar, siembra células tubulares P1 en 40.000 células en pocillos de una microplaca de 96 pocillos recién preparada y recubierta de colágeno. Utilice 100 microlitros de medio de cultivo por pocillo. La optimización de la densidad celular y la concentración de compuestos en el ensayo de flujo extracelular es clave para el éxito de un experimento.

Recomendamos un experimento piloto de valoración para identificar la densidad celular óptima y la concentración de compuestos. A continuación, hidrate el cartucho del sensor. Primero, levante el cartucho del sensor y llene cada pocillo de la placa con 200 microlitros de solución de calibración.

A continuación, vuelva a colocar el cartucho para sumergir los sensores e incube el conjunto durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, aspire el medio viejo y reemplácelo con 175 microlitros de glucosa o medios de ensayo de ácidos grasos. Luego, continúe la incubación durante una hora sin dióxido de carbono.

Durante la incubación de la célula, cargue el puerto A del cartucho con 25 microlitros de oligomicina, cargue el puerto B con FCCP, cargue el puerto C con rotenona/antimicina A y cargue el puerto D y todos los demás puertos con agua. Ahora, guarde el cartucho en la incubadora sin dióxido de carbono hasta que la configuración esté lista para la calibración. Proceda encendiendo el analizador de flujo extracelular y el controlador.

A continuación, abra el software del analizador, elija un ensayo estándar y pulse la opción Asistente de ensayo. A continuación, en la pestaña Compuestos, asigne los compuestos a los puertos adecuados. En la pestaña Corrección de fondo, seleccione los pozos que no contienen celdas.

A continuación, utilice la pestaña Grupos y etiquetas para etiquetar los grupos experimentales. A continuación, en la pestaña Protocolo, establezca los ciclos de mezcla y medición adecuados utilizando los comandos disponibles. Estos ajustes se indican en el protocolo de texto y, una vez introducidos, guardan la plantilla para su uso futuro.

Ahora, presione Finalizar Asistente para continuar. Ahora, presione Iniciar para comenzar la calibración. A continuación, el analizador expulsa el soporte de la placa y solicita que se inserte la placa del cartucho.

Este proceso de calibración tarda entre 20 y 25 minutos en completarse. Una vez que el sistema esté calibrado, presione el comando de solicitud para cambiar la placa de calibración por la placa de celda y continúe la ejecución. Una vez finalizada la ejecución, guarde los datos de OCR y retire la placa del analizador.

Ahora, agregue Hoechst a cada uno de los pocillos de ensayo e incube la placa durante cinco minutos a 37 grados centígrados. A continuación, cuente las células utilizando una excitación de 355 nanómetros y una emisión de 460 nanómetros, y normalice los datos de OCR al recuento de células. En este protocolo, se cultivó una población heterogénea de células renales, túbulos digeridos incompletamente y otros restos de tejido en placas recubiertas de colágeno.

Al día siguiente del aislamiento, los medios de cultivo se centrifugaron para eliminar los residuos y se volvieron a colocar las células tubulares. Posteriormente, las células se adhirieron más fácilmente y, al quinto día de cultivo, estaban en un 80 a 90% de confluencia. A continuación, los TEC renales se subcultivaron y crecieron hasta la confluencia en una semana.

Un crecimiento similar ocurrió en los siguientes dos pasajes. La monocapa de células tomó una formación de cúpula, levantándose de la placa y permaneciendo unida por uniones estrechas. La respiración mitocondrial de los TEC primarios aislados se midió utilizando el análisis de flujo extracelular descrito del OCR a diferentes densidades de siembra como se describe.

40.000 células por pocillo cubrieron la superficie de la placa mejor que cualquier otra densidad de recubrimiento, lo que la convierte en la concentración óptima para probar las interacciones entre células y compuestos. Por ejemplo, se aplicaron medios que contenían sustrato de ácidos grasos a los TEC junto con 2DG, un inhibidor de la glucólisis, para evaluar directamente la oxidación de ácidos grasos en los TEC en los pasajes uno y dos.

Al intentar este procedimiento, es importante mantener siempre un registro de los volúmenes y concentraciones exactos en cada pozo. Las alteraciones en las concentraciones finales de los componentes pueden hacer que todo el experimento falle. Tras su desarrollo, esta técnica allanará el camino para que los investigadores en el campo de la nefrología exploren el papel del metabolismo de los ácidos grasos tubulares en la patogénesis de diversas nefropatías.