2 en 1: purificación de la afinidad para el análisis paralelo de proteínas y complejos de proteína-metabolito de un solo paso

Este método se puede utilizar no solo para abordar preguntas clave en la investigación básica, sino también para contribuir a los campos médico, farmacéutico y biotecnológico, al delinear nuevos ligandos moleculares pequeños de proteínas esenciales. La principal ventaja de esta técnica es que permite el análisis paralelo de la proteína y los socios metabólicos de la proteína elegida en condiciones muy reales. Este método ayuda a pescar moléculas que interactúan sin estar restringido a ligandos preseleccionados.

Aunque este método se desarrolló para plantas, también se puede aplicar para otros sistemas, como las células HeLa, E. coli y S. Cerevisiae. Para comenzar, prepare el medio MSMO y ajuste el pH a 5.7 con un molar de hidróxido de potasio. Luego, autoclave la solución durante 15 minutos a 121 grados Celsius.

Agregue los suplementos al medio justo antes del inicio del experimento. Ahora, cultive células transgénicas de PSBL Arabidopsis thaliana en 50 mililitros de medio MSMO en un matraz de 100 mililitros. A continuación, coloque el matraz en un agitador de plataforma orbital y agite suavemente las celdas a 130 rpm a 20 grados centígrados a la luz.

Cada siete días, subcultive las células en medio fresco en una solución de uno a 10. A continuación, utilice un embudo de vidrio con una malla de nailon colocada en un matraz cónico, conectado a una bomba de vacío para recolectar las células durante la fase de crecimiento logarítmico. Luego, envuelva las células secas en papel de aluminio y congele en nitrógeno líquido.

Utilizando un molino mezclador preenfriado, ajustado a una frecuencia vibratoria de 20 hercios. Homogeneizar el material celular vegetal cosechado y congelado hasta convertirlo en un polvo fino durante dos minutos. A continuación, alícuota tres gramos del polvo molido por muestra utilizando nitrógeno líquido, equipo preenfriado para evitar que se descongele.

A continuación, utilizando un mortero de nitrógeno líquido preenfriado, triturar el polvo molido con tres mililitros de tampón de lisis helada hasta que se descongele. Divida la muestra descongelada inmediatamente en dos tubos de microcentrífuga de mililitros. Centrifugar las muestras a 20,817 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados para eliminar los restos celulares.

Mientras se centrifuga la muestra, alícuota 100 microlitros de perlas de sefarosa IgG por muestra. Agregue un mililitro de tampón de lisis y vuelva a suspender las perlas mediante vórtice. Centrifugar rápidamente durante tres segundos a 2.000 g y desechar el tampón de lisis.

Finalmente, vuelva a suspender las perlas en 400 microlitros de tampón de lisis. Después de la centrifugación, transfiera tres mililitros del lisado de la planta clara a un tubo de centrífuga cónico de 15 mililitros. Agregue las perlas preequilibradas al lisado de la planta e incube la mezcla en una rueda giratoria durante una hora a cuatro grados centígrados.

Transfiera la mezcla a una jeringa conectada a una tapa con bloqueo de señuelo en una columna de centrifugado con un filtro de tamaño de poro de 35 micrómetros ubicado en la parte superior del colector de vacío. Haga pasar el lisado a través de la unidad encendiendo la bomba de vacío con una presión suave para evitar daños a las perlas. El lisado no unido se drena en la estación de residuos ubicada en la base del colector y los complejos de proteínas, unidos a las perlas, permanecen en el filtro.

Una vez que la jeringa se haya vaciado del lisado celular, agregue 10 mililitros de tampón de lavado para lavar las perlas. A continuación, añada un mililitro de tampón de elución para realizar el segundo paso de lavado. Ahora, retire la jeringa y la tapa de bloqueo del señuelo.

Cierre la tapa inferior de la columna y añada 400 microlitros del tampón de elución que contiene 50 unidades de la forma mejorada del virus del grabado del tabaco, la proteasa, a las perlas. Coloque la columna en un agitador de mesa, ajustado a 1.000 rpm durante 30 minutos a 16 grados centígrados. A continuación, añada 50 unidades adicionales de la proteasa a la columna e incube la mezcla en el agitador como en el paso anterior.

A continuación, retire la tapa inferior y vuelva a colocar la columna en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros. Centrifugar a 20,817 g durante un minuto para recoger el eluido y proceder a la extracción de proteínas y metabolitos. Para comenzar la extracción, agregue un mililitro de solvente de agua de metanol MTBE de tres a uno a uno al eluido.

Invierta el tubo para mezclar con la muestra. A continuación, añada 0,4 mililitros de una a tres soluciones de agua con metanol a la mezcla e invierta el tubo para mezclar la muestra. A continuación, centrifugar la muestra a 20,817 g durante dos minutos a temperatura ambiente para permitir la separación de fases.

Con una pipeta manual de manipulación de líquidos de un mililitro, elimine la fase superior que contiene lípidos. A continuación, añade 0,2 mililitros de metanol e invierte el tubo para mezclar la muestra. Centrifugar a 20,817 g durante dos minutos a temperatura ambiente y recoger la fase polar en un nuevo tubo para las mediciones de metabolitos.

Deje aproximadamente 50 microlitros de la fase polar en el fondo del tubo para evitar que se desprenda la bolita de proteína. A continuación, seque el tubo que contiene la fase polar en un evaporador centrífugo durante la noche. Seque los tubos de pellet de proteína durante 30 a 60 minutos para evitar que se sequen demasiado.

Utilizando la purificación por afinidad en un solo paso, junto con espectrometría de masas, se han identificado las interacciones proteína-proteína y proteína-metabolito en cultivos celulares transgénicos de Arabidopsis thaliana. Los cultivos celulares que expresan NDPK1 muestran un enriquecimiento significativo en valina-leucina, glutamato de isoleucina, leucina isoleucina y fenilalanina de isoleucina en comparación con las muestras de vector vacío, NDPK2 y NDPK3. Para buscar interacciones conocidas proteína-proteína y proteína-metabolito, se comparan 13 proteínas y cuatro dipéptidos coeluyentes con NDPK1 con la base de datos de puntos.

Las principales asociaciones se observan entre el ortólogo APX1 y la familia de las aldehídos deshidrogenasas, y el factor de iniciación de la traducción, FBR12, con el factor de iniciación de la traducción dos subunidades alfa homólogo. Los dipéptidos identificados no muestran socios proteicos reportados. Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en cuatro horas, si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante mantener las muestras, el equipo y los reactivos fríos durante todo el experimento. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la termoforesis microscópica o el ensayo de actividad, con el fin de determinar la interacción directa entre las moléculas o la inferencia de su ligando en la actividad de las proteínas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo manipular la muestra durante todo el procedimiento para obtener resultados confiables e identificar los ligandos de su proteína de elección.

No olvide que trabajar con una solución de metanol y MTBE puede ser extremadamente peligroso. Se debe usar el equipo de protección personal adecuado y siempre se deben tomar precauciones, como trabajar debajo de la campana extractora, mientras se realiza este procedimiento.