Un ensayo desarrolló para evaluar la activación de células neuronales endógenos en un modelo murino de lesión medular mínima

Este método puede ayudar a responder preguntas relacionadas con el papel de las células precursoras neurales en la medicina regenerativa. En concreto, podemos preguntarnos cómo afecta la lesión al comportamiento de las células precursoras neurales. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un enfoque para estudiar el efecto de la lesión de la médula espinal en la cinética de las células precursoras neurales endógenas.

La demostración visual de estas técnicas es fundamental. Como los pasos quirúrgicos y de disección requieren precisión, y pueden ser difíciles de aprender, aunque se pueden perfeccionar con la práctica. Antes de comenzar el procedimiento, use un cortapelos para quitar el pelaje del dorso de un ratón anestesiado desde la mitad de la espalda hasta el cuello y las orejas.

Después de asegurar al ratón en un dispositivo estereotáctico, coloque cuatro o cinco piezas de gasa enrollada debajo del abdomen, mientras tira ligeramente de la base de la cola para enderezar el cuerpo y la columna vertebral. Empuje el rollo de gasa torácica rostralmente desde el abdomen del ratón hacia la parte superior del tórax para apoyar la columna torácica. Y use cinta de laboratorio para asegurar la cola y las extremidades en una orientación similar a la de una estrella.

Después de desinfectar la piel expuesta con hisopos secuenciales de etanol al 70% y povidona yodado, utilice una hoja de bisturí número 10 para realizar una incisión vertical paralela al eje longitudinal del animal, desde el punto medio de ambos omóplatos, hasta la curvatura de la columna torácica. Retraiga la piel para exponer los tejidos blandos y el contorno de la columna vertebral. E identifique el borde inferior de la almohadilla de grasa superescapular.

A continuación, utilice el bisturí para cortar con cuidado pero con fuerza a lo largo de ambos lados de la vertebral T5 a T8 y nueve huesos, para separar los tendones musculares de la espalda de la columna vertebral. Vuelva a colocar los retractores de modo que los dientes de los retractores se inserten en el sitio de la incisión a ambos lados de la columna vertebral. Y expanda cada retractor para ajustar la exposición, hasta que la columna vertebral esté lo suficientemente elevada sin ejercer demasiada presión sobre las capas musculares retraídas.

Bajo un microscopio quirúrgico, limpie cuidadosamente el músculo residual y otros tejidos blandos que recubren la columna vertebral, para exponer el hueso vertebral. Sujetar la apófisis espinosa de las vértebras con pinzas dentadas y mover las pinzas ligeramente hacia arriba y hacia abajo para identificar las vértebras que se van a extraer. A continuación, inserte una punta de un par de tijeras curvas y desafiladas en cada lado del agujero intervertebral expuesto, caudal a la lámina vertebral que se va a extirpar.

Y cortar las articulaciones intervertebrales de conexión bilateralmente. Luego, levante la lámina hacia arriba y corte la unión superior de la lámina para aislar y extraer el hueso. Al cortar y extirpar la lámina vertebral, tenga cuidado de inclinar siempre las tijeras hacia arriba para no dañar la médula espinal subyacente.

Con las venas de la línea media dorsal sirviendo como punto de referencia, inserte el eje doblado de 45 grados de una punta de aguja de calibre 30, con el lado biselado hacia arriba, a un milímetro de profundidad en la superficie lateral dorsal de la médula espinal. Y aproximadamente 0,5 milímetros laterales a cada lado de la línea media. Mueva la aguja unos dos milímetros desde la dirección caudal a la rostra, de modo que toda la longitud del bisel se inserte en el cordón.

A continuación, vuelva a trazar el camino de la entrada para retirar la aguja. Para cerrar la herida, retire el retractor y use una sutura absorbible 6-0 para unir los músculos de la espalda a ambos lados de la lesión a lo largo de la línea media. Y una sutura de seda 4-0 para cerrar la piel suprayacente.

Para aislar las neuroesferas, haga una incisión en la línea media de la piel a lo largo de toda la espalda para exponer el músculo y el contorno óseo vertebral. Levante la cara medial de cada escápula y use unas tijeras para cortar el tejido blando entre la escápula y las vértebras. Cuando la columna vertebral subyacente haya quedado expuesta, inserte las tijeras en la abertura torácica superior, siguiendo la curvatura de la columna vertebral, y corte las costillas, el músculo y los órganos internos adjuntos para aislar la columna vertebral.

Inserte las tijeras en el agujero vertebral caudal y corte las articulaciones intervertebrales a ambos lados de las láminas, teniendo cuidado de no dañar el cordón intacto. Cuando la longitud adecuada de la médula esté expuesta, corte con cuidado cualquier nervio espinal que se extienda lateralmente desde la médula, antes de transferir el tejido de la médula espinal a una placa de Petri de líquido cefalorraquídeo artificial regular en hielo. Bajo un microscopio de disección, corte el tejido de la médula espinal para incluir aproximadamente dos milímetros de tejido rostral y caudal al sitio de la lesión, y use dos pares de pinzas finas para separar suavemente el cordón en dos mitades longitudinales, a lo largo de las fisuras dorsal y ventral.

Utilice las microtijeras para cortar la sustancia blanca lateral dorsal lesionada. Y coloque el tejido lesionado en un tubo cónico de 15 mililitros. Sosteniendo una mitad de la médula espinal con las pinzas, extraiga y extraiga la sustancia blanca no lesionada con dos pares de pinzas a lo largo de la extensión caudal rostral de la médula espinal, para aislar la región periventricular adecuada.

Después de aislar la sustancia blanca lesionada y las regiones periventriculares asociadas de la otra mitad de la médula espinal de la misma manera, coloque los trozos de tejido periventricular en tubos cónicos individuales de 15 mililitros. Y use las micro tijeras para picar suavemente el tejido contra las paredes de los tubos. Una vez que se ha completado el procedimiento de digestión del tejido y se ha obtenido la suspensión de una sola célula, configure un cultivo de neurosfera agregando 10 mililitros del medio apropiado en un matraz de cultivo de tejido de 25 milímetros por condición celular.

Y añadir las células madre neurales aisladas hasta una densidad clonal de 10 células por microlitro para su cultivo en una incubadora de cultivos celulares. Después de 24 horas, agite suavemente los matraces y decante el contenido en tubos cónicos individuales de 15 mililitros para la centrifugación. Vuelva a suspender los gránulos en uno o dos mililitros de medio basal neural fresco para contar.

Y coloque las células a densidad clonal en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos por condición, que contenga 500 microlitros del medio suplementado con mitógenos correspondiente apropiado por pocillo. A continuación, cultive las neuroesferas en la incubadora de cultivos celulares durante siete días. Cinco días después de la lesión mínima de la médula espinal, el número absoluto de neuroesferas definitivas derivadas de células madre neurales es mayor que el número de neuroesferas derivadas de células madre neurales primitivas.

Las neuroesferas definitivas exhiben un diámetro mayor y un gran centro oscuro. Mientras que las neuroesferas primitivas son más pequeñas en tamaño y más compactas. Una lesión mínima de la médula espinal induce un aumento significativo de las neuroesferas que crecen desde el canal central a nivel de la lesión, en comparación con un aumento relativamente modesto en el canal central, rostral hasta el nivel de la lesión.

También se pueden generar neurosferas definitivas a partir de la sustancia blanca lesionada a nivel de la lesión. Una región que no contiene neurosfera formando células en animales de laminectomía solamente. Se observa un aumento similar en las células madre neurales primitivas después de la lesión, con la excepción de las neuroesferas primitivas en la sustancia blanca a nivel del sitio de la lesión.

Una vez dominada, la técnica quirúrgica se puede realizar en menos de 40 minutos. Y la disección y el aislamiento del tejido se pueden realizar en menos de 30 minutos, si se realizan correctamente. Después del procedimiento quirúrgico, dependiendo de la cepa del animal, se pueden utilizar metodologías adicionales, como la inmunohistoquímica y el choque lineal, para responder a preguntas adicionales, como la cinética de proliferación y el destino propio de las células precursoras neurales después de una lesión.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar el ensayo de la neurosfera para evaluar la activación de las células madre neurales, después de una lesión de la médula espinal.