Name: Imágenes de Ca2 + respuestas durante la infección de Shigella de células epiteliales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprende a visualizar respuestas de calcio local y global en células HeLa infectadas con Shigella mediante microscopía de fluorescencia con sondas químicas. Este método optimizado permite estudiar señales atípicas inducidas por patógenos.

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Agradecemos a Jenny Lee Thomassin por su ayuda en editar el manuscrito. El trabajo fue financiado por la ANR otorga MITOPATHO y PATHIMMUN, subvenciones de la Labex Memolife y PSL IDEX Shigaforce. Chunhui sol es un recipiente de una beca de doctorado del Consejo de becas de China. Laurent Combettes y Guy Tran Van Nhieu reciben de un intercambio de WBI-Francia Tournesol programa N ° 31268YG (Wallonie-Bruxelles International, Fonds de la Recherche Scientifique, Ministère Français des Affaires étrangères et européennes, Ministerio de l ' enseignement supérieur et des de la Recherche dans le cadre dificultaría Hubert Curien).

1. preparaciones
<ol><li>
Preparación de bacterias
	<ol>
<li>Las bacterias de la placa: cepa de tipo salvaje deShigella expresando la adhesina de AfaE (M90T-AfaE) — en un tripticasa agar de soja (TCS) placa que contiene 0.01% Congo rojo (CR) e incubar de 18 h a 37 ° C. Nota: Para aumentar su reproducibilidad, las placas de Shigella obtenidas en el paso 1.1.1 se almacenan a 4 ° C y deben ser usadas dentro de una semana, porque todas las colonias en medio de CR se pondrá rojas eventualmente con el tiempo.</li>
		<li>Inocular el TCS caldo de cultivo previo escogiendo 3 colonias rojo de las placas de la raya. Nota: Se realiza una inoculación con 3 colonias para limitar la probabilidad de escoger una sola copia cuyo plásmido de virulencia ha sufrido una recombinación genética.</li>
		<li>Crecen cultivos bacterianos líquidos en un incubador de agitación por 16 h a 37 ° C a 200 rpm. Añadir ampicilina a una concentración final de 75 mg/mL. Las concentraciones de antibióticas no deben exceder 3 x la concentración inhibitoria mínima, como un exceso de antibiótico puede llevar a la pérdida del plásmido de virulencia grande. Nota: El mantenimiento del plásmido de virulencia de Shigella debe verificarse por los cultivos bacterianos sobre placas CR suplementados con concentraciones adecuadas del antibióticas de la galjanoplastia. La presencia de colonias blancas indica pérdida de plásmidos.</li>
		<li>Inocular el cultivo TCS con el cultivo bacteriano previo a la dilución 1: 100. Incubar a 37 ° C en un incubador de agitación durante 2 horas a 200 rpm. Asegúrese de que la densidad óptica a 600 nm (OD600 nm) es de 0.2 - 0.4.</li>
		<li>Centrifugar el cultivo bacteriano por 2 min a 13.000 x g a 21 ° C y resuspender el precipitado en un volumen equivalente de EM medio (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2, 5 mM de glucosa y 25 mM HEPES pH = 7.3).</li>
		<li>Diluir la suspensión bacteriana en un búfer de EM en un final de OD600 nm de 0,1 y usarlo inmediatamente o guarde a 21 ° C y usar dentro de los próximos 60 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de la célula
	<ol>
<li>Las células HeLa cultura en DMEM con 1 g/L de glucosa suplementado con 10% de suero fetal de ternero (FCS) y crecen a 37 ° C con 10% CO2. Crecer TC-7 cultivadas en DMEM con 4,5 g/L de glucosa, que contiene 10% de FCS y aminoácidos no esenciales en una incubadora de 37 ° C que contenga 10% CO2.</li>
		<li>Para el mantenimiento celular, dividir las celdas con regularidad para evitar una inhibición de crecimiento contacto vinculada a Estados confluentes; Esto es crítico para una Ca2 + sonda carga/transfección eficacia alta.</li>
		<li>Placa de células HeLa en cubreobjetos circulares estériles de 25 mm de diámetro en las placas de 6 pozos a una densidad de 3 x 105 células/pozo el día antes del experimento de las células HeLa.</li>
		<li>Las células TC-7, trypsinize y contar las células. Semilla en 4 x 105 células/pozo e incúbelos a 37 ° C en un 10% de CO2de 5-7 días-incubadora antes los experimentos para permitir una polarización.<ol>
<li>Actualizar el medio de cultivo celular todos los días hasta el día del experimento. Nota: Cámaras desechables de 35 mm de diámetro de fondo de cristal pueden usarse como alternativa a los pocillos que contienen el cubreobjetos. Si esta última se utiliza, control de temperatura a través de una platina calefactada u objetivo no es suficiente, y una cámara de incubación termostato montado en la platina del microscopio es necesaria.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>El día del experimento, quitarlo del medio y lavar las células 3 x medio de 1 mL EM a 21 ° C.</li>
	<li>Carga las células con 3 mM Fluo-4-AM14 en un búfer de EM durante 30 min a 21 ° C. Nota: Mientras que la carga de células HeLa el confluentes no plantea grandes problemas, la carga de polarizado células TC-7 suele ser heterogénea y poco eficiente. Para estas células, se encontró que la adición del agente dispersante es aumentar la eficiencia de carga: pluronic ácido — a una concentración final de 0.1% y el transportador de aniones inhibidores bromosulfophtalein en una concentración final de 20 μm a las EM de fluo-4-AM-que contiene. El uso de químico radiométrica sondas o codificado-FRET genéticamente sondas que requieren adquisición de doble no es compatible con la velocidad de adquisición necesario para la proyección de imagen de locales Ca2 + respuestas.</li>
	<li>Lavar las muestras 3 x con EM tampón y además les Incube en 1 mL de tampón de EM a 21 ° C para permitir que la hidrólisis de la molécula de AM. Uso Fluo-4 cargado células inmediatamente o en el siguiente minuto 90 (mantenida a 21 ° C).</li>
</ol>2. infección y adquisición de imagen de locales Ca2 + respuestas
<ol><li>Coloque el cubreobjetos que contiene las células Fluo-4 cargado en una proyección de imagen de cámara o cámara de fondo de cristal. Lavar las muestras en la sala de proyección de imagen o desechables de fondo de cristal de cámara x 3 con tampón de EM para separar compuestos potencialmente resultante de la lisis celular. Añadir 1 mL de tampón de EM.</li>
	<li>Coloque la cámara en un escenario de microscopio de fluorescencia invertido calentado a 33 º C. Nota: Esta temperatura es seleccionada como un compromiso entre la temperatura óptima compatible con el proceso de invasión de Shigella y la disminución de Ca2 + las respuestas para visualizar respuestas locales. Utilizamos un 63 X objetivo de aceite de inmersión (NA = 1.25) equipado con anillos de contraste de fase.</li>
	<li>Seleccione el campo de la microscopía y configurar los parámetros de adquisición, incluyendo el tiempo de exposición y binning si es necesario, para optimizar la señal fluorescente Fluo-4. Nota: Los principales desafíos de local Ca2 + proyección de imagen son la amplitud baja y la pequeña duración de las respuestas, que requieren la adquisición de por lo menos cada 30 ms. EM-CCD o CMOS retroiluminado disponibles comercialmente varios de la cámaras presente la necesaria sensibilidad para detectar locales Ca2 + respuestas utilizando Fluo-4. Sensibilidad de detección es también un tema importante para limitar el fotoenvejecimiento o artefactos como respuesta espontánea ligada a la excitación fluorescente de Fluo-4 en una frecuencia alta. Aquí, una iluminación basada en LED de 470 nm, con un filtro de excitación de 480 ± 40 nm band-pass, un filtro dicroico de 505 nm y un 527 ± 30 nm paso banda de emisiones en 5% de su máxima intensidad combinado con un filtro de densidad neutra 1,0 fueron utilizados para reducir al mínimo estos problemas bajo un chorro de adquisiciones de duración limitada. Habitualmente se realiza un análisis de Ca2 + señales locales por lotes de los arroyos s 120. En estas condiciones de baja iluminación, photobleaching fluoróforo no se observó durante las adquisiciones flujo min 2. Adquisiciones sucesivas sobre la misma muestra se pueden realizar, siempre y cuando se utilizan diferentes campos. Como regla general, una primera secuencia de adquisición se realiza en un campo de control en ausencia de estimulación de bacterias para asegurar la ausencia de respuestas espontáneas. Si se observan las respuestas espontáneas, las muestras se lavan con buffer EM hasta que no hay respuestas se observan.</li>
	<li>Para agregar las bacterias en la muestra, retire 500 μl de tampón de EM de la cámara y agregar 500 μl de la suspensión bacteriana preparada en el paso 1.1.6 para obtener un final OD600 nm de 0.05, con el cuidado adecuado para evitar mover el campo seleccionado de la microscopia; los volúmenes de aseguran una mezcla adecuada de las bacterias y una distribución homogénea de las bacterias en las muestras de células.</li>
	<li>Llevar a cabo una adquisición a la adición de bacteria. Como alternativa, realizar una adquisición 10 min después de la adición de bacteria, que se corresponde con el tiempo necesario para las bacterias al sedimento en las células bajo las condiciones. Al final de la secuencia de adquisición, adquirir una imagen de contraste de fase del campo seleccionado para visualizar la bacteria en contacto con las células y los volantes de membrana asociados a sitios de invasión bacteriana.</li>
	<li>Repita el procedimiento de adquisición como en el paso 2.5, a intervalos que son susceptibles a la duración de la adquisición de imagen, ahorro de archivos y selección de un nuevo campo para cubrir todo el proceso. Nota: Para Shigella, encontramos que la adquisición de secuencias cada 5 min por 20 min, después de la sedimentación bacteriana de 10 minutos, permitida cubrir la mayoría de los acontecimientos de la invasión.</li>
	<li>Al final del procedimiento de adquisición, añadir una concentración final de 2 μm de las Ca2 + ionóforo ionomycin muestras para determinar la amplitud máxima de las señales de Ca2 + . Adquirir imágenes cada 3-5 s hasta estabilización de la señal, generalmente de menos de 10 minutos.</li>
	<li>Seguir añadiendo una concentración final de 10 mM para determinar la señal de fluorescencia en ausencia de Ca2 +Ca2 + quelante EGTA. Adquirir imágenes cada 3-5 s hasta estabilización de la señal, generalmente de menos de 10 minutos. Nota: Debido a la dinámica relativamente lenta de las global Ca2 + variaciones, realizar estas adquisiciones cada 3-5 s (no en modo streaming), permitiendo para el Ca2 + la proyección de imagen en el mismo campo microscópico durante los tratamientos sucesivos.</li>
</ol>3. Análisis
<ol><li>Expresar variaciones de Ca2 + citosólicas en el tiempo como el porcentaje de ΔF/F0, donde ΔF representa la variación de la intensidad de fluorescencia media de la región de interés (ROI) y F0 la fluorescencia basal en el mismo ROI, a la que un región no relevantes del campo desprovisto de células se resta.<ol>
<li>Eliminar los niveles de fluorescencia basal de cada célula en diferentes campos, correspondientes a los niveles de línea base; Estos niveles se pueden determinar sin ambigüedades debido a la baja frecuencia y relativamente corta duración de local Ca2 + respuestas en la adquisición de una secuencia dada. Nota: Cuantificar características llamativas de las respuestas relacionadas con las preguntas y el modelo patógeno estudiados. Clásico, varios parámetros se tienen en cuenta para analizar el Ca2 + señales, incluyendo la frecuencia de células que tengan locales o globales Ca2 + las respuestas, así como la duración, amplitud y frecuencia de estas respuestas. En el caso de Shigella y respuestas locales, otro aspecto importante del análisis es la Asociación espacial de las respuestas con los sitios de invasión bacteriana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para cuantificar el porcentaje de células sensibles mostrando respuestas globales o locales, dibujar ROIs en células, en series de tiempo correspondiente a las variaciones de intensidad de Fluo-4.<ol>
<li>Establecer parámetros estrictos para identificar locales Ca2 + respuestas, como una amplitud de tres variaciones de fondo arriba de la línea de base de celular de intensidad de fluorescencia media y una duración de al menos 200 ms, para evitar marcar un falso positivo. Nota: Como regla general, incluso los pequeños locales Ca2 + respuestas pueden distinguirse de cualquier ruido de fondo por su perfil. El ROI debe ser lo bastante grande como para integrar suficientes señales de fluorescencia para la detección de variaciones locales. Dependiendo de la intensidad de la detección de Fluo-4, estos ROIs pueden corresponder a los círculos con diámetros desde 2-5 mM.</li>
		<li>Medir las variaciones de la intensidad media de fluorescencia de Fluo-4 en 2 regiones en una zona distinta de la misma célula, para determinar si las respuestas son locales o globales. Nota: El análisis de un gran número de células es facilitado por el uso de software que permite la visualización en pantalla en línea de las variaciones de la intensidad de fluorescencia media en el tiempo para las regiones seleccionadas de imágenes. Software de proyección de imagen disponible en el mercado tiene esa opción, pero esto también se puede realizar usando el freeware de Icy , usando el plugin de Evolución de intensidad de ROI .</li>
		<li>Determinar el porcentaje de células que muestran respuestas locales. Nota: Este porcentaje se calcula a partir del número total de células analizadas en el campo de la microscopía, que debe ser en número suficiente para apoyar una significación estadísticamente mediante una prueba no paramétrica.</li>
		<li>Determinar la duración de las respuestas locales. Nota: Local de Ca2 + las respuestas pueden distinguirse más lejos según sus rangos de duración (es decir, menos de 500 ms, entre 5 y 10 s, o superiores a 10 s) y su asociación con los sitios de invasión de Shigella .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuantificar la amplitud de las respuestas. En primer lugar, calibrar las máxima Ca2 + y la célula niveles de fondo determinados como en el paso 2.1.7. Puesto que la carga de Fluo-4 puede variar para cada celda, realizar estas determinaciones para las células individuales en el campo.<ol>
<li>Expresa la amplitud de las respuestas como un porcentaje relativo de la respuesta máxima.</li>
		<li>Realizar las pruebas estadísticas utilizando una prueba de normalidad, seguida por una prueba paramétrica para analizar posibles diferencias en la amplitud de las respuestas entre las muestras.</li>
		<li>Determinar la Asociación de estas respuestas en relación con los sitios de invasión bacteriana por su respectiva localización en las membrana bacteriana inducida por de volantes visualizados en las correspondientes imágenes de contraste de fase.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+and+host+interactions+in+the+gut+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier.</a> Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).</li>
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<li>Tran Van Nhieu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-based+confinement+of+calcium+responses+during+Shigella+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Actin-based confinement of calcium responses during Shigella invasion.</a> Nature Communications. 4, 1567(2013).</li>
<li>Niebuhr, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+PtdIns%284%2C5%29P%282%29+into+PtdIns%285%29P+by+the+S.+flexneri+effector+IpgD+reorganizes+host+cell+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology.</a> The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).</li>
<li>Konradt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Shigella+flexneri+type+three+secretion+system+effector+IpgD+inhibits+T+cell+migration+by+manipulating+host+phosphoinositide+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism.</a> Cell Host & Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).</li>
<li>Friedrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intriguing+Ca2%2B+requirement+of+calpain+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).</li>
<li>Thomas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+fluorescent+Ca2%2B+indicator+properties+and+their+use+in+measuring+elementary+and+global+Ca2%2B+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals.</a> Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).</li>
<li>Sun, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Shigella+type+III+effector+IpgD+recodes+Ca2%2B+signals+during+invasion+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells.</a> The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).</li>
<li>Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Shigella+flexneri+IpgD+and+IpgF+genes%2C+which+are+located+in+the+proximal+part+of+the+mxi+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus.</a> Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que declarar.

Este manuscrito describe el protocolo que hemos diseñados para seguir Ca2 + señales locales durante las cinéticas relativamente corto de una invasión de Shigella , así como Ca2 + respuestas globales durante la cinética extendida de Shigella. A continuación, clave se encuentran cuestiones que deben abordarse para optimizar la detección de Ca2 + señales y reducir al mínimo cualquier interferencia con los procesos biológicos.
Química y gené...

CA2 + regula todos los procesos de células conocidas, incluyendo la reorganización del citoesqueleto, las respuestas inflamatorias y vías de muerte celular relacionadas con las interacciones huésped-patógeno1,2,3. En condiciones fisiológicas, basal Ca2 + las concentraciones citosólicas son bajas, en los cientos de rango nM, pero pueden ser sometidas a aumentos transitorios sobre el estímulo del agonista. Estas variaciones demuestran a menudo comportamiento oscilatorio a través de la acción de las bombas y canales en las membranas del retículo endoplásmico y plasma. El patrón de estas oscilaciones se caracteriza por el período de duración y amplitud de Ca2 + aumenta y es desencriptado por las células que, a su vez, desencadenan respuestas específicas en lo que se conoce como el Ca2 + código4,5 . Un aumento sostenido en la citosólica Ca2 + concentración en condiciones patológicas puede conducir a la muerte celular asociada a la permeabilización de las membranas mitocondriales y la liberación de pro-apoptóticos o necróticos factores6, 7.
Shigella, el agente causal de la disentería bacilar, invade las células epiteliales mediante la inyección de efectores en las células del huésped utilizando un tipo III secreción sistema (T3SS)8,9. Una invasión de Shigella de las células huésped se asocia a locales y globales Ca2 + señales sacadas por el T3SS. En cuanto a la formación de poro las toxinas, el translocon T3SS que inserta en las membranas de la célula huésped y es necesario para la inyección de T3SS efectores es probable responsable de la activación de PLC y el trifosfato de inositol (1, 4, 5) (InsP3)-dependiente de Ca2 + lanzamiento. La combinación de la estimulación localizada del PLC y la acumulación de actina polimerizada en los sitios de un resultado de la invasión de Shigella en una anormalmente larga duración InsP3 dependiente de Ca2 + liberación10. Tipo III generador de efectos IpgD, una fosfatidil 4,5 bifosfato (PIP2) -4-fosfatasa, limita la cantidad local de PIP2, controlando así la cantidad de sustrato disponible para el PLC generar InsP3, que contribuye a la reclusión de local Ca2 + respuestas en los sitios de invasión bacteriana11,12. Estos Ca2 + respuestas locales probablemente contribuyen a la polimerización de la actina en la invasión de Shigella sitios10. Ca2 + respuestas globales que también son sacadas por Shigella, sin embargo, son prescindibles para el proceso de invasión bacteriana sino desencadenar la apertura de connexin hemichannels en la membrana plasmática y la liberación de ATP en el medio extracelular compartimiento. Lanzado ATP actúan de manera paracrina, a su vez, estimula la Ca2 + oscilatorias respuestas en las células al lado de la célula infectada. También es responsable de formar global Ca2 + respuestas erráticas respuestas aisladas con dinámica lenta IpgD. Finalmente, a una infección bacteriana prolongada, IpgD lleva a la inhibición de señales de InsP3 mediada por Ca2 + . A través de su interferencia con la Ca2 + señalización IpgD retrasa un Ca2 +-activación de calpaínas dependiente hacia el desmontaje de estructuras de adhesión focal y la separación prematura de infectado las células13.
Mientras que el Ca2 + señales están implicadas en aspectos críticos de la patogénesis, el uso de un microorganismo plantea una serie de desafíos técnicos que no se encuentran en estudios clásicos agonista. Los protocolos descritos aquí usan el utilizados fluorescente Ca2 + químico indicador Fluo-4 que hemos diseñados para caracterizar señales de Ca2 + locales durante una infección por Shigella . Pasos críticos para la detección de estas señales se discuten, así como procedimientos para su análisis cuantitativo que es necesaria para caracterizar el papel de efectores bacterianas en la señalización de Ca2 + .

<table><tbody><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph versión 7.7</td><td>Universal Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de iluminación CoolLED pE-2</td><td>Roper Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micro-plato 35 mm, alto&nbsp;</td><td>IBIDI</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de tripticasa de soja (TCS)</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>B11768</td></tr><tr><td>TCS agar</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>B11043</td></tr><tr><td>Congo rojo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>75768</td></tr><tr><td>M90T-AfaE</td><td>Sun et al. 2017</td><td>Shigella flexneri serotipo V. que expresa la AfaE adhesin</td><td></td></tr><tr><td>ipgD-AfaE</td><td>Sun et al. 2017</td><td>cepa mutante isogénica ipgD que expresa la adhesina</td><td></td> AfaE</tr></tbody></table>

imágenes de ca2 + respuestas durante la infección de shigella de células epiteliales

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

CA2 + es un ion omnipresente en todos los procesos celulares conocidos. Aunque global Ca2 + respuestas pueden afectar el destino de la célula, variaciones locales en libre Ca2 + citosólicas concentraciones, ligadas a la liberación de tiendas interiores o un flujo a través de canales de la membrana plasmática, regulan procesos celulares corticales. Patógenos se adhieren a o invadir el huésped células gatillo una reorganización del citoesqueleto de actina subyacente a la membrana plasmática de host, que probablemente afecta a nivel global y local de Ca2 + señalización. Porque estos eventos pueden ocurrir en frecuencias bajas de manera pseudo-estocástica sobre cinética extendida, el análisis de Ca2 + señales inducidas por patógenos plantea importantes desafíos técnicos que deben abordarse.
Aquí, Divulgamos los protocolos para la detección de Ca2 + señales globales y locales en una Shigella infección de células epiteliales. En estos protocolos, artefactos vinculados a una exposición prolongada y fotoenvejecimiento asociado con la excitación de Ca2 + fluorescentes puntas de prueba se removio controlando estrictamente los parámetros de adquisición durante períodos de tiempo definidos durante un Shigella invasión. Procedimientos se implementan para analizar rigurosamente la amplitud y la frecuencia de Ca2 + señales citosólicas globales durante la cinética de la infección extendida usando la sonda química Fluo-4.

Invasión de Shigella se asocia con anormal duradero Ca2 + respuestas locales:
Siguiendo el protocolo mencionado anteriormente, las células HeLa Fluo-4-cargado se desafiaron con WT Shigella y se realizaron adquisiciones de secuencia para analizar señales de Ca2 + . En figura 1, se muestra un experimento representativo con serie de Time-lapse de imágenes de la inte...

Aquí, presentamos protocolos para visualizar las respuestas de calcio (Ca2 +) provocadas por las células HeLa infectadas por Shigella. Optimización de los parámetros de infección bacteriana y la proyección de imagen con sondas fluorescentes de Ca2 + , se caracterizan atípicos globales y locales Ca2 + señales inducidas por bacterias sobre una amplia gama de cinética de la infección.

Imágenes de Ca2 + respuestas durante la infección de Shigella de células epiteliales

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

El objetivo general de este análisis de microscopía fluorescente utilizando sondas químicas es analizar las respuestas locales y globales de calcio provocadas por las células huésped durante la infección por Shigella patógena. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología celular, como la señalización inducida por patógenos que conduce a la reorganización del citoesqueleto o la muerte celular. La principal ventaja de esta técnica es que, mediante el uso de sondas químicas, se pueden seguir las señales locales de calcio asociadas a procesos locales desviados por el patógeno.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la configuración de parámetros que permiten seguir las señales locales de calcio mientras se preserva la integridad de las muestras biológicas. Para empezar, coloque Shigella de tipo salvaje que exprese la adhesión de AfaE en una placa de soja tripticasa o agar TCS que contenga 0,01% de rojo Congo e incube las placas a 37 grados centígrados durante 18 horas. Prepare los precultivos a partir de las placas rayadas seleccionando tres colonias rojas e inoculando el caldo TCS con 75 microgramos por mililitro de ampicilina.Cultive los cultivos líquidos en una incubadora agitadora a 37 grados centígrados y 200 rpm durante 16 horas. A continuación, inocule TCS con el precultivo bacteriano a una dilución de 1:100. Incubar el cultivo a 37 grados centígrados en una incubadora agitadora a 200 rpm durante dos horas.Asegúrese de que la densidad óptica a 600 nanómetros sea de 0,2 a 0,4. Centrifugar el cultivo a 13.000 g y 21 grados centígrados durante dos minutos y volver a suspender el pellet en un volumen equivalente de medio EM. Diluir la suspensión bacteriana en tampón EM a un diámetro exterior final de 600 de 0,1 y utilizarlo inmediatamente o almacenarlo a 21 grados centígrados y utilizarlo dentro de los próximos 60 minutos.Cultive células HeLa en DMEM con un gramo por litro de glucosa suplementada con 10% de FCS y cultive el cultivo a 37 grados Celsius con 10% de CO2. Cultive células TC7 en DMEM con 4,5 gramos por litro de glucosa, 10% de FCS y aminoácidos no esenciales y cultive a 37 grados Celsius y 10% de CO2. Para el mantenimiento de las células, divida las células regularmente para evitar la inhibición del contacto del crecimiento relacionada con los estados confluentes.Esto es fundamental para una alta carga de sonda de calcio y la eficiencia de la transfección. Tripsinar y contar las células TC7. El día antes del experimento con células HeLa, coloque las células en cubreobjetos circulares estériles de 25 milímetros de diámetro en placas de seis pocillos a una densidad de tres veces 10 por cinco celdas por pocillo.Luego, para permitir la polarización antes de los experimentos, siembre las células a cuatro veces 10 a cinco celdas por pocillo e incube durante cinco a siete días, reemplazando el medio todos los días. El día del experimento, retire el medio y use un mililitro de medio EM para lavar las células tres veces. Cargue las células con tres tampones micromolares Fluo-4 AM y EM e incube las placas a 21 grados centígrados durante 30 minutos.Con tampón EM, lave las muestras tres veces, luego agregue un mililitro de tampón EM e incube las células a 21 grados Celsius para permitir la hidrólisis de la fracción AM. Coloque el cubreobjetos que contiene las células cargadas con Fluo-4 en una cámara de imágenes o con fondo de cristal. Utilice el tampón EM para lavar la muestra tres veces para eliminar los compuestos que puedan resultar de la lisis celular.A continuación, añade un mililitro de tampón EM. Coloque la cámara en una platina de microscopio de fluorescencia invertida calentada a 33 grados centígrados. Seleccione un campo de microscopía y configure los parámetros de adquisición, incluido el tiempo de exposición y la agrupación, si es necesario, para optimizar la señal fluorescente Fluo-4.Para agregar bacterias a la muestra, retire con cuidado 500 microlitros de tampón EM de la cámara y agregue 500 microlitros de la suspensión bacteriana para obtener un OD final de 600 de 0,05. Realice inmediatamente una adquisición o espere 10 minutos para permitir que las bacterias se sedimenten en las células. Al final del flujo de adquisición, adquiera una imagen de contraste de fase del campo seleccionado para visualizar las bacterias que entran en contacto con las células y los nervios de la membrana asociados con los sitios de invasión bacteriana.Repita el procedimiento de adquisición a intervalos que sean adecuados a la duración de las adquisiciones de imágenes, el almacenamiento de archivos y la selección de un nuevo campo para cubrir todo el proceso. Al final del procedimiento de adquisición, agregue a la muestra dos micromolares de ionóforo de calcio ionomicina para determinar la amplitud máxima de las señales de calcio. Adquiera imágenes cada tres a cinco segundos hasta que la señal se estabilice, generalmente durante menos de 10 minutos.A continuación, añada el quelante de calcio EGTA a una concentración final de 10 milimolares para determinar la señal fluorescente en ausencia de calcio. Adquiera imágenes cada tres a cinco segundos hasta la estabilización de la señal, generalmente durante menos de 10 minutos. Realizar análisis de imágenes según el protocolo de texto.En este experimento, las células HeLa cargadas de Fluo-4 se desafiaron con Shigella de tipo salvaje y se realizaron adquisiciones de flujo para analizar las señales de calcio. Se promedia una serie de imágenes de lapso de tiempo de la intensidad de fluorescencia de la sonda Fluo-4 en una región de interés para una sola celda, y se muestra la imagen de contraste de fase correspondiente. Se observan aumentos locales atípicos de calcio citosólico libre en el sitio de invasión de Shigella con una amplitud variable y duraciones que oscilan entre 2,5 y cinco segundos, seguidos de aumentos globales en la célula infectada.En este ejemplo, una cepa mutante isogénica, deficiente para el efector de tipo III IpgD, una fosfatidil 4,5-bisfosfato fosfatasa, indujo respuestas locales más globales y menos atípicas con largas duraciones en comparación con la cepa Shigella de tipo salvaje. Como se ve en este experimento, las imágenes de las respuestas globales de calcio sobre la cinética de infección extendida muestran una disminución en la frecuencia de las respuestas 30 minutos después del desafío con Shigella de tipo salvaje. Por último, la cuantificación de las respuestas celulares dependientes de la dosis al agonista del calcio histamina ilustra la inhibición de la liberación de calcio dependiente del trifosfato de inositol en las últimas etapas de una infección por Shigella.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar todos los métodos que combinan simultáneamente fluidos compatibles y obtener imágenes para abordar el papel de las señales de calcio en un proceso determinado. No olvide que trabajar con patógenos puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como la eliminación de desechos, la limpieza de superficies o equipos contaminados mientras se realiza este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Vonaesch, P. et. al., Análisis de inmunofluorescencia de la formación de gránulos de estrés tras un desafío bacteriano en células de mamíferos. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demuestra la infección de las células epiteliales con la bacteria patógena Shigella flexneri y la respuesta celular del huésped resultante. Las proteínas efectoras bacterianas interrumpen la traducción del huésped, desencadenando la formación de orgánulos sin membrana llamados gránulos de estrés, que reflejan la...

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Source: Poore, K., et al. Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates an in vitro assay to assess Shigella invasion and intracellular replication in human colonic epithelial monolayers. It highlights steps for infection, antibiotic selection, host cell lysis, and recovery of intracellular bacteria for downstream analysis.

Intracellular Replication Assay for Shigella in Human Colonic Epithelial Cells

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Aprende a visualizar respuestas de calcio local y global en células HeLa infectadas con Shigella mediante microscopía de fluorescencia con sondas químicas. Este método optimizado permite estudiar señales atípicas inducidas por patógenos.

Imágenes de Ca^{2 +} respuestas durante la infección de Shigella de células epiteliales

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