Preparación de sílice funcional utilizando un método Bioinspirados

Las principales ventajas de este método son que es rápido, fácil, respetuoso con el medio ambiente y permite la adaptación de los materiales. Este método puede proporcionar información sobre cómo se forma la sílice bioinspirada, las formas disponibles de incorporación de biomoléculas y el tratamiento posterior al material sintético. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la formación de sílice es rápida y es necesario agregar rápidamente una cantidad específica de ácido para obtener los resultados óptimos.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos dimos cuenta de lo suave que era, de modo que las condiciones eran compatibles con las enzimas. Pensamos en utilizar este método para mejorar el rendimiento y la estabilidad de las enzimas. La demostración visual de este método es fundamental, ya que el paso de neutralización del ácido es el más importante para las propiedades finales del material.

Primero, pesa 318,2 miligramos de silicato de sodio pentahidratado en un recipiente de plástico de 180 mililitros y disuelve en 20 mililitros de agua desionizada. En un segundo recipiente, pesa 58,1 miligramos de hexamina de pentaetileno o PEHA y disuelve en 20 mililitros de agua desionizada. Reste esta cantidad de agua del volumen de agua desionizada que se utilizará para la disolución del silicato de sodio pentahidratado.

Para realizar la encapsulación in situ durante la síntesis, disuelva una masa predeterminada de proteína en cinco mililitros de agua desionizada y coloque la solución en el refrigerador para su disolución total. Compruebe de vez en cuando el progreso de la disolución, preferiblemente sin remover. Combine las soluciones de silicato de sodio pentahidratado y PEHA en uno de los recipientes y agregue suficiente agua desionizada para que el volumen de la solución final sea de 41,5 mililitros.

Coloque la mezcla recién preparada en la parte superior de un plato para revolver y agregue una barra para revolver para proporcionar una mezcla consistente. A continuación, suspenda una sonda de pH en la solución de agitación y registre el pH inicial. Comience la síntesis añadiendo una cantidad predeterminada de ácido clorhídrico de un molar y observe la evolución inmediata de la turbidez.

El primer paso crítico es la adición rápida de ácido para iniciar la formación de sílice. El pH debe bajarse a siete lo más rápido posible. Si se está llevando a cabo la encapsulación, agregue la solución encapsulante tan pronto como se complete la adición de ácido.

Luego registre el pH después de cinco minutos para determinar la finalización de la reacción. Una vez finalizada la reacción, modifique la composición de la sílice producida añadiendo más ácido clorhídrico a la mezcla hasta alcanzar el pH deseado entre dos y siete y permita que la suspensión se estabilice durante aproximadamente un minuto. A continuación, decantar la suspensión de sílice bioinspirada en tubos de centrífuga de 50 mililitros y, a continuación, centrifugar la suspensión a 5.000 g durante 15 minutos.

Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y guárdelo para su posterior análisis. Vuelva a llenar los tubos de centrífuga con agua desionizada y vuelva a suspender la sílice con un mezclador de vórtice. En el caso de la incorporación de biomoléculas, un paso crítico es dar lavado a los sobrenadantes de la sílice bioinspirada para su posterior análisis.

Después de repetir los pasos de centrifugación y resuspensión dos veces, retire el sobrenadante y raspe la sílice en crisoles cerámicos. Seque la sílice en un horno durante la noche a 85 grados centígrados. En un vial de plástico de cinco mililitros, diluir 300 microlitros de reactivo de azul de molibdeno previamente preparado con tres mililitros de agua desionizada.

A continuación, añade 10 microlitros de solución de ácido salicílico y agita para mezclar. Después de 15 minutos, agregue 1,6 mililitros de agente reductor de sulfato de para-aminofenol previamente preparado para reducir el complejo de silicomolibdato amarillo a su isómero azul. A continuación, mida la absorbancia de la muestra a 810 nanómetros en un espectrofotómetro UV-vis y calcule la concentración de silicio contra una curva de calibración.

Con puntas de pipeta desechables, agregue una cantidad predeterminada de reactivo Bradford y muestra en cada cubeta asignada. Mezclar cada cubeta invirtiendo tres veces y dejar que se desarrolle durante 10 minutos. A continuación, mida la absorbancia a 595 nanómetros utilizando sobrenadante puro como blanco.

Calcule la absorbancia original de cada cubeta restando la absorbancia de la muestra de control de cada medición. Ahora, cree una curva de calibración para cada conjunto de experimentos trazando la absorbancia medida frente a la concentración de BSA para evitar fluctuaciones aleatorias que puedan afectar la sensibilidad del ensayo. Por último, determine el contenido de proteínas de cada muestra durante la resuspensión para controlar la posible pérdida de proteínas.

El rendimiento de la reacción de formación de sílice suele ser de 58 más o menos 6,5%El método espectroscópico de azul de molibdeno detectó la cantidad de especies de silicato monomérico sin reaccionar, así como aquellas especies que reaccionaron para formar polisilicatos u oligómeros pero que no han logrado alcanzar el tamaño suficiente para coagularse. Una vez que se completa la coagulación, las superficies del material se pueden modificar fácilmente mediante el uso de elución ácida que permite el ajuste fino de las propiedades del material, como la composición, la porosidad y la actividad química del aditivo. Se detectó alrededor del 50% de BSA en el sobrenadante después de la primera centrifugación, lo que se relaciona con una eficiencia de inmovilización del 50%.

Como no se detectó BSA en los siguientes lavados, el BSA pudo encapsularse de forma segura durante la síntesis sin lixiviación. El espectro FTIR de la sílice mostró bandas amida características en las muestras con BSA, pero no en las muestras control. Cuando se añadió BSA a los reactivos sin reaccionar, no hubo diferencias considerables en la eficiencia de la inmovilización ni en la cantidad de BSA en el compuesto resultante.

Cuando se agregó BSA durante la formación de sílice, la eficiencia de inmovilización y la cantidad de BSA en el producto fueron significativamente menores. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de cinco minutos si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar ser preciso con los pesos y volúmenes de los reactivos y agregar rápidamente el ácido en una dosis.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como FTIR, SCM, porosimetría y ensayos enzimáticos para responder preguntas adicionales sobre las propiedades y la morfología del material, así como sobre la actividad de las biomoléculas. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la formación de sílice bioinspirada exploraran un método rápido, fácil, controlable y respetuoso con el medio ambiente para sintetizar sílice con la capacidad de encapsulación in situ de biomoléculas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar sílice utilizando un método bioinspirado, encapsular biomoléculas in situ, medir la eficiencia de encapsulación y realizar la elución postsintética de los aditivos.

No olvide que trabajar con aminas, ácidos, biomoléculas puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el EPP y la prevención de derrames al realizar este procedimiento.