Name: Preparación de sílice funcional utilizando un método Bioinspirados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Aprende a sintetizar sílice bioinspirada con inmovilización enzimática in situ mediante neutralización ácida rápida. Este método eficiente y ecológico permite personalizar propiedades del material para aplicaciones en biomateriales.

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Los autores agradecen el apoyo financiero del Departamento de química e ingeniería biológica (Universidad de Sheffield) y el EPSRC (EP/L017059/1 y EP/P006892/1).

1. preparación de disoluciones precursoras (y soluciones Encapsulant opcional)
<ol><li>En un recipiente de plástico de 180 mL, mide 1,5 mmol de silicato de sodio pentahidratado (318,2 mg) y disolver en 20 mL de agua desionizada.</li>
	<li>Del mismo modo, en un segundo recipiente, medir 0.25 mmol de pentaethylene hexamina (PEHA, 58,1 mg) y disolver en 20 mL de agua desionizada.<ol>
<li>Cuando se utiliza la alternativa que contiene amina compuestos p. ej.,diethylenetriamine (DETA) o triethylenetetraamine (TETA), asegúrese de que la relación de topo Si:N total permanece constante en 1 (es decir, correspondientes a 0,5 mmol de DETA o 0,375 mmol de TETA en el procedimiento descrito)15.</li>
		<li>Cuando utilice poliméricos amina aditivos por ejemplo,poly(ethyleneimine) (PEI) o poly(allylamine hydrochloride) (PAH), mantener una concentración de 1 mg/mL (volumen de reacción final)15. PRECAUCIÓN: Manipule estas aminas sólo dentro de una campana de humos, como son corrosivos o tóxicos en sus formas puras (especialmente como vapores).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para realizar en situ encapsulado durante síntesis, disolver una masa predeterminada de proteína (aquí 50 mg de albúmina sérica bovina, BSA) en 5 mL de agua desionizada. Restar esta cantidad de agua del volumen de agua desionizada para la disolución de silicato de sodio pentahidratado.<ol>
<li>Para facilitar la disolución de proteína sin alterar su estructura, una vez mezclado con agua desionizada, tapa el recipiente y almacenar a 4 ° C. De vez en cuando revisar el progreso de la disolución, sin revolver.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. sílice síntesis
<ol><li>Combinar las soluciones de silicato de sodio pentahidratado y PEHA en uno de lo envase de 180 mL y añadir agua desionizada para hacer la final 41 mL de volumen de solución (o 46 si se omite en situ encapsulado).</li>
	<li>Coloque la mezcla recién preparada de silicato de sodio y soluciones PEHA en la parte superior de una placa de agitador, agregando una barra agitadora para proporcionar una mezcla consistente.</li>
	<li>En esta nave, suspender una sonda de pH y registrar el pH inicial.<ol>
<li>En esta etapa, opcionalmente, eliminar una alícuota 750 de μl de la mezcla de partida para la posterior determinación de la concentración inicial de [Si] mediante el análisis espectrofotométrico de azul de molibdeno, como se describe en el paso 8.1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Comenzar la síntesis por adición de una cantidad predeterminada de 1 M de HCl, calculada a partir de la figura 1y observar la evolución inmediata de turbidez (ver figura 2)</li>
	<li>Tan pronto como es la adición de ácido, añadir la solución de encapsulante (si existe) lo antes posible. Nota: El volumen final dado estas cantidades es 50 mL de mezcla de reacción total, llevando a concentraciones de Si y N de 30mM. Esto puede ser escalado como deseado multiplicando todo por encima de las cantidades por una cantidad constante.</li>
	<li>Registrar el pH después de 5 minutos para determinar la finalización de la reacción; Asegúrese de que el pH es 7 ± 0.05.</li>
</ol>3. ácido elución de los materiales
<ol><li>Modificar la composición de sílice producido después de la reacción ha llegado a conclusión (o como un coágulo como hecho por resuspender una muestra sintetizada anterior de sílice) por la adición de más ácido.</li>
	<li>Si resuspender sílice, mezclar aproximadamente sílice de Bioinspirados preparado como 150 mg con 100 mL de agua desionizada en un contenedor plástico de 180 mL y colocar sobre una placa de agitador.</li>
	<li>Una vez que la suspensión está bien mezclada, suspender una sonda de pH en el recipiente.</li>
	<li>Valorar en más HCl hasta que se alcanza el pH deseado (entre 7 y 2) y deje que se estabilice durante aprox. 1 minuto.</li>
	<li>Esperar un más 5 minutos para asegurar el sistema ha totalmente equilibrada y luego proceder a aislar la silicona sólida.</li>
</ol>4. sílice separación y secado
<ol><li>Decantar la suspensión de sílice Bioinspirados en tubos de centrífuga de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión a 5.000 g durante 15 minutos.</li>
	<li>Quite el sobrenadante después de centrifugación y de tienda para su posterior análisis (p. ej., ensayo de Bradford, ver más abajo). Rellenar los tubos de centrífuga con agua desionizada y vuelva a suspender la sílice con un mezclador de vórtice.</li>
	<li>Repetir dos veces la resuspensión, centrifugación y almacenamiento flotante.</li>
	<li>Después de la última centrifugación, eliminar el sobrenadante y quitar la silicona en un crisol.</li>
	<li>Seca en una estufa durante la noche a 85 ° C.<ol>
<li>Si encapsulación ha tenido lugar, utilice una instalación de liofilización o un horno de funcionamiento en vacío para evitar la desnaturalización de la proteína.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. producción de molibdeno azul reactivo (MBR) para la determinación de [Si]
<ol><li>A un matraz aforado de 1 L plástico, agregue 8 mmol (10 g) amonio molibdato tetrahidratado en una vitrina.</li>
	<li>Esto disolver en 500 mL de agua desionizada con agitación.</li>
	<li>Acidificar la solución con cuidado añadiendo 60 mL de disolución de HCl de 10 M.</li>
	<li>Ajustar el volumen final de 1 L.</li>
</ol>6. producción de para-aminofenol sulfato reductor (RA) para la determinación de [Si]
<ol><li>Coloque un matraz aforado de vidrio de 500 mL en un baño de agua a temperatura ambiente en un plato agitador dentro de un armario del humo.</li>
	<li>Añadir 111 mmol (10 g) de ácido oxálico anhidro, 19.5 mmol (3,35 g) de sulfato de para-aminofenol y 16 mmol (2 g) de sulfito de sodio y disolver en 250 mL de agua.</li>
	<li>Cuidadosamente y lentamente añada 92 g (50 mL) de ácido sulfúrico saturado mientras revuelve y esperar a que la solución se enfríe.</li>
	<li>Por último, diluir hasta 500 mL con agua desionizada.</li>
</ol>7. Silicomolybdic ácido ensayo sobre especies de sílice monomérico
<ol><li>En un frasco de plástico de 5 mL, diluir a 300 μL de MBR producen en paso 5.4 con 3 mL de agua desionizada.</li>
	<li>Añadir 10 μl de una solución de la prueba de ácido silícico y agitar para mezclar. Nota: Esta solución se convertirá poco a poco amarillo.</li>
	<li>Después de exactamente 15 minutos, añadir 1,6 mL de preparado de la sección 6 para reducir el silicomolybdate amarillo complejo a su isómero azul el agente de reducción.</li>
	<li>Permite una coloración azul a desarrollar para al menos 2, pero no más de 24 h.</li>
	<li>Medir la absorbancia de la muestra a 810 nm en un espectrofotómetro UV-vis y calcular [Si] contra una curva de calibración.</li>
</ol>8. Silico ensayo de ácido molíbdico en especies de sílice polimérica
<ol><li>Para medir la concentración de especies polysilicate utilizando el método de azul de molibdeno, en un tubo de microcentrífuga, combinan 750 μl de solución de hidróxido sódico de 2 M con suspensión de sílice de 750 μl.</li>
	<li>Sello y el lugar en un flotador de microcentrífuga.<ol>
<li>Asegurar suficiente espacio libre queda en el tubo para evitar la explosión debido a la acumulación de presión. Nota: Un espacio de 500 μl es suficiente para evitarlo. Alternativamente, el procedimiento puede realizarse en frascos abiertos que es responsable de pérdida de líquido por evaporación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Los tubos de microcentrífuga de flotador en un baño de agua calentado a 80 ° C y dejar disolver durante 1 hora.</li>
	<li>Transcurrido 1 h, retirar los tubos de microcentrífuga y seque el exterior.</li>
	<li>Una vez fríos, [Si] puede ser determinado como se describe anteriormente, como se describe en los pasos 7.2 a 7.5.</li>
</ol>9. Bradford procedimiento de ensayo para la determinación de la concentración de proteína en sílice
<ol><li>Introduzca una cantidad predeterminada (temperatura ambiente) Bradford reactivo y muestra en cada cubeta asignado (ver tabla 1 y tabla 2 para volúmenes específicos). Utilizar puntas de pipeta desechables para cada cubeta para evitar alteraciones de volumen debido a la naturaleza del reactivo y repetir cada punto por triplicado.</li>
	<li>Mezcle cada cubeta invirtiendo 3 veces y dejar hacer durante 10 minutos.</li>
	<li>Medir la absorbancia a 595 nm utilizando el sobrenadante pura como blanco.</li>
	<li>Calcular la absorbancia original de cada cubeta restando de cada medición de la absorbancia de la muestra de control (cubeta Nº 0 en ambos ensayos).</li>
	<li>Calcular la concentración de proteína de la muestra desconocida utilizando una curva de calibración (figura 3). En caso de dilución de la muestra original, el factor de dilución debe ser contabilizados.<ol>
<li>Crear una curva de calibración para cada conjunto de experimentos trazado medido absorbencia contra concentración de BSA para evitar fluctuaciones aleatorias que pueden afectar la sensibilidad del ensayo.</li>
		<li>Aunque este ensayo de proteína pretende utilizar BSA como estándar para cuantificar cualquier tipo de proteína, crear una curva de calibración para cada proteína específica de interés para la exactitud mejorada.</li>
		<li>Si el contenido de proteína de la muestra desconocida se espera que sea mayor que el rango cubierto de la curva de calibración, diluir según sea necesario.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinar el contenido de proteína para cada muestra durante re-suspensión para controlar la pérdida posible de la proteína.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no declaran competencia interés financiero.

En el presente trabajo, presentamos un método para precipitar rápidamente materiales de sílice Bioinspirados y encapsulantes de biomoléculas en esto. Demostramos los pasos críticos en el procedimiento, es decir, la cantidad de inicio de reacción ácido a añadir y el momento de adición de la biomolécula encapsulante. Les mostramos el efecto de la cantidad de ácido agregado en progresión de reacción y rendimiento (figura 4 y figura 5, respectivamente) y demostrado un método para el control estricto sobre las condiciones de síntesis, lo que permite consistencia a pesar de esta sensibilidad. Con respecto a la encapsulación de especies activas, aunque sencillo en términos de procedimiento, encapsulado se muestra sensible a las condiciones del experimento (orden de adición, pH de adición, condiciones ambientales), sin embargo, consistencia en el material propiedades nuevo es factible.
Las condiciones de síntesis pueden modificarse mediante el uso de diferentes aditivos, muchos de los cuales han sido publicados en otros lugares,15 ofrece una variedad de morfologías y porosidades. Los sintéticas, más técnicas para modificar y adaptar químicamente los materiales de silicona Bioinspirados se han divulgado como decoración de purificación suave superficie y13 amina. 20 finalmente, debido a la naturaleza suave y acuosa de la síntesis, en situ encapsulado es posible para una amplia gama de sustratos que demostró aquí, que van desde enzimas17,18 a células enteras,21 sales de metal, ingredientes farmacéuticos activos22 ,23 y quantum dots. 24
A diferencia de otras síntesis de sílice orgánica mediada (por ejemplo, el MCM-41 o SBA-15 familia de materiales), el carácter polifuncional de Bioinspirados aditivos no pueden producir ordenó poro estructuras, ni altamente monodispersa distribuciones de tamaño de partícula característica de sílice Stöber tipo. 25 esto es debido a la falta de comportamiento bien definidos micellization Bioinspirados añadidos (fuera de casos especiales)26 junto con su creciente actividad catalítica sobre aditivos que contienen amina monofuncionales. 26
Por otro lado, este tipo aditivos polifuncionales permite el uso de más cortos tiempos de reacción más suave temperatura y presión comparado con otras síntesis de sílice orgánica mediada. Esto también conduce a la posibilidad de elución aditivo de temperatura como se describe anteriormente, que tiene todavía ser alcanzada para estas otras familias de sílice debido a las particularidades de su química superficial. 27 , 28 , 29 por consiguiente, materiales de sílice Bioinspirados han demostrado ser más económico y práctico para producir a una escala mayor, conduce al desarrollo y comercialización más fácil. 14
En Resumen, síntesis de sílice Bioinspirados representa un método rápido y fácil para la producción de especies activas de soportes o medios absorbente de gas. A través de un control estricto del pH durante y después de la reacción, una amplia gama de compuestos de sílice-amina puede sintetizarse con varias propiedades, que además se complementa con la posibilidad de en situ la encapsulación de una matriz de diferentes orgánica, materiales orgánicos o inorgánicos. Aunque independiente modificación posterior sintética de aditivo Bioinspirados y encapsulante concentración todavía tiene que alcanzar, estos métodos representan un paso prometedor hacia procesos químicos ambientalmente benignos.

El uso de sílice como soporte estructural para los catalizadores industriales está bien establecido, que permite la actividad de catalizador mejorado, estabilidad y capacidad de procesamiento,1 por lo tanto, potencialmente reduciendo los costos de operación. Estos beneficios se ven agravados en el caso de inmovilización de la enzima, como almacenamiento de información dentro de un sistema de poros de la sílice puede conferir beneficios significativos en la duración de la enzima sobre su contraparte libre. Por consiguiente, mucho esfuerzo se ha expendido en encontrar el mejor método para unir las enzimas a las especies de sílice, con múltiples comentarios comparando las investigaciones utilizando diferentes métodos de inmovilización sobre soportes sólidos silíceos. 2 , 3 , 4
Las enzimas se unen generalmente mediante fisisorción o enlace covalente, además de encapsulado dentro de un material poroso. 5 sin embargo, hay inconvenientes significativos relacionados con cada método: fisisorción se basa en interacciones de superficie transitorias entre la sílice y biomoléculas, que muy fácilmente pueden ser debilitado por las condiciones de reacción que conduce a la inaceptable lixiviación de la enzima. El accesorio covalente mucho más fuerte generalmente resulta en menor actividad debido a la reducida libertad conformacional de la especie activa. Encapsulación puede resultar en la reducción de la actividad debido a la inaccesibilidad de la enzima o limitaciones difusionales. 6
Desarrollos recientes en el campo de más suave (a menudo denominado ' Bioinspirados') síntesis de sílice han establecido la encapsulación en situ de biomoléculas y otras especies activas en la síntesis material. 7 , 8 , 9 este método niega muchos de los inconvenientes de la inmovilización convencional - a diferencia de los enfoques de quimisorción la libertad conformacional de la biomolécula es mantenida por el uso de más débiles interacciones no covalente pero como las formas de la cavidad de poro alrededor de biomoléculas, todavía se evita la lixiviación. De hecho, encapsulación se ha demostrado que funciona para una variedad de biomoléculas y células incluso toda,10 y a través de la encapsulación en efectos de sílice Bioinspirados como desactivación debido proceso áspero pueden evitarse condiciones. 7 , 11
El método descrito en el presente documento pretende preparar una sílice porosa con características controlables, bajo condiciones ambiente, mediante el uso de un aditivo orgánico bioinspirados. El método puede modificarse fácilmente para incluir encapsulamiento de moléculas inorgánicas o Bioorgánica, una selección de la que se indicará. Además mostramos un método fácil para la modificación de los materiales sintetizados como para alcanzar propiedades deseadas a granel y purificación mediante la eliminación de la plantilla orgánica a través de elución ácida.
En comparación con la tradicional síntesis de sílice porosa con plantilla admite (p. ej.,sílice materiales enlazados a través de asambleas supramolecular surfactante MCM-41 como SBA-15)12 que este método es significativamente más rápido y más suave, lo que permite a la medida, en situ encapsulado sin la necesidad de numerosas medidas de inmovilización y purificación laboriosa. Además, el uso de elución ácida en vez de calcinación abre la posibilidad de funcionalización de superficies orgánica.
Este método es altamente aplicable a quienes trabajan en inmovilización de especies activas que han encontrado fisisorción o inmovilización covalente ser ineficaz. También es útil para ésos investigación proceso escala-para arriba como la síntesis Bioinspirados está en una posición para la industrialización con respecto a materiales convencionales con plantillas silicona. 13 , 14 que este método no se recomienda para aplicaciones que requieren una matriz ordenada de poros dentro del material por ejemplo,de fotónica, como la estructura material es desordenada a pesar de cualquier similitud en características a granel.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Síntesis de sílice</silicato ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>sodio pentahidratado</td><td>Fisher scientific</td><td>10070470</td><td></td></tr><tr><td>Hexamina de pentaetileno (PEHA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>292753</td><td></td></tr><tr><td>dietilentriamina (DETA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D93856</td><td></td></tr><tr><td>Trietilentetraamina tóxica (TETA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90460</td><td></td></tr><tr><td>Poli(etileneimina) (PEI)</td><td>Polysciences</td><td>6088</td><td>1.2K MW</td></tr><tr><td>Clorhidrato de poli(alilamina) (PAH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>283215</td><td>17.5k MW</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico (HCl)</td><td>1M Fisher Scientific</td><td>10487830</td><td></td></tr><tr><td><Ensayo > ácido silicomolíbdico fuerte</ Tetrahidrato ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>molibdato de amonio fuerte</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7302</td><td>Producto reemplazado por M1019</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico (HCl) 37.0%wt</td><td>Fluka Analytical</td><td>84436</td><td></td></tr><tr><td>Ácido oxálico anhidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75688</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de para-aminofenol</td><td>Fisher Scientific</td><td>10446880</td><td></td></tr><tr><td>Sodio sulfito</td><td>Fisher Scientific</td><td>10234400</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84727</td><td></td></tr><tr><td>Bradford ensayo</reactivo ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bradford</td><td>fuerte Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autotitrator Titrando 902</td><td>Metrohm</td><td>2.902.0010</td><td></td></tr><tr><td>801 placa agitadora magnética</td><td>Metrohm</td><td>2.801.0040</td><td>Para usar con más de</td></tr><tr><td>800 Dosino</td><td>Metrohm</td><td>2.800.0010</td><td>Para usar con lo anterior</td></tr><tr><td>Aquatrode Plus</td><td>Metrohm</td><td>6.0253.100</td><td>Para usar con la</td></tr><tr><td>centrífuga Sorvall ST16</td><td>Thermo Scientific</td><td>11814243</td><td>Code es para Fisher scientific</td></tr><tr><td>UV-Vis espectrofotómetro Genesys 10A</td><td>Thermo scientific</td><td>12104972</td><td>Code es para Fisher scientific</td></tr></tbody></table>

preparación de sílice funcional utilizando un método bioinspirados

Preparation of Functional Silica Using a Bioinspired Method

El objetivo de los protocolos descritos en este documento es sintetizar materiales de sílice Bioinspirados, realizar encapsulación de enzima en esto, y parcialmente o totalmente igual purifique por elución ácida. Mediante la combinación de silicato de sodio con un aditivo de Bioinspirados polifuncionales, sílice está formado rápidamente en las condiciones ambientales sobre la neutralización.
Se investigó el efecto de neutralización tasa y biomoléculas punto de adición en la producción de sílice, y eficacia de la inmovilización de biomoléculas se divulga para variar el punto de adición. En contraste con otros métodos de síntesis de sílice porosa, se muestra que las suaves condiciones necesarias para síntesis de sílice Bioinspirados son totalmente compatibles con la encapsulación de biomoléculas delicado. Además, condiciones suaves se utilizan en todos los pasos de síntesis y modificación, hacer Bioinspirados sílice un objetivo prometedor para la escala y la comercialización como un material desnudo y medio apoyo activo.
La síntesis se demuestra para ser muy sensible a las condiciones, es decir, la tasa de neutralización y pH de síntesis final, sin embargo ajustado control sobre estos parámetros se demuestra mediante el uso de métodos de titulación automática, hacia la alta reproducibilidad en vía de progresión de reacción y rendimiento.
Por lo tanto, sílice Bioinspirados es una opción excelente apoyo material activo, mostrando versatilidad hacia muchas aplicaciones actuales, que no se limita a ésos demostrados aquí y de la potencia en aplicaciones futuras.

Las técnicas descritas son capaces de forma consistente y reproducible precipitar sílice. Esto es más fácil de determinar por la rápida aparición de turbidez en el vaso de reacción, que al cese de la agitación se resolverá espontáneamente en un coágulo grueso de sílice precipitada (figura 2). El grado de reacción y por lo tanto, el rendimiento puede confirmarse mediante la medición de la masa de este coágulo después de la separación y es típicamente 58 ± 6.5% (figura 4, amarilla).
Más información sobre la progresión de reacción puede ser generada por adaptar el método espectroscópico de azul de molibdeno para detectar la cantidad de especies silicato de monómero sin reaccionar, así como aquellas especies que han reaccionado a formar polysilicates o 'oligómeros', pero no han logrado alcanzar tamaño suficiente para coagular (figura 4, rojo y azul respectivamente).
Estos datos de especiación de sílice específico están de particular interés cuando se comparan las eficiencias de titulación diferentes para la reacción de precipitación - es decir, cómo se alcanza el pH final de la reacción y la velocidad en que esto afecta a la polimerización de la sílice monomérico a un 'oligómero de ' y su posterior coagulación a sílice sólida. Modificando la cantidad de ácido añadido en etapa 2.4 ligeramente, bajo - o sobre - titration de la mezcla de reacción puede ser realizada (figura 5). Mediante la medición de la especiación de silicona para estos dos casos, se aprecia una clara diferencia en la terminación de la reacción (figura 4) a pesar de sólo pequeños cambios en el perfil de valoración de la reacción (figura 5).
Aunque ninguna diferencia existe entre el consumo de especies monoméricas para los casos de tres reacción (queda entre 29-33%), hay una clara diferencia en la cantidad de especies oligoméricas de la sílice que precipitan en cada caso. Se trata de acuerdo con la teoría tradicional en sílices sol-gel - en el caso de 'aterrizaje', el pH se lleva a cabo mayor, permitiendo que las partículas individuales se crecen y por lo tanto ayudar a la coagulación eficiente; en el caso de 'overshoot' la coagulación se induce mucho más rápido debido a la valoración rápida, por lo tanto, menos de las especies de sílice han crecido a un tamaño suficiente para coagular y siguen atrapadas en la fase coloidal. 16
Dada la importancia de la valoración sobre la formación de sílice, a priori conocimiento del volumen de la titulación adecuada es esencial. Aunque no extraíble de la estequiometría de la reacción debido al comportamiento complejo de protonación de la amina aditivos y cambio en la acidez superficial de sílice en la coagulación, altamente confiables relaciones empíricas entre los contenidos del sistema, las concentraciones y volúmenes de título son fácilmente generados (figura 1).
Una vez terminada la coagulación, superficies pueden ser fácilmente modificadas mediante elución ácida, como se ha divulgado recientemente por los autores en otros lugares. 13 esto permite ajuste de propiedades de los materiales tales como composición, porosidad y actividad química del aditivo (Figura 6a y b).
En este estudio, BSA fue utilizada como una enzima de encapsulante ejemplar, sin embargo, las técnicas descritas aquí pueden ser utilizadas para múltiples enzimas17,18. El procedimiento seguido para la detección de la proteína es el protocolo de ensayo de Bradford,19 con los sobrenadantes almacenados de cada ciclo de centrifugación. La cantidad de proteína en el sobrenadante se calcula utilizando una curva de calibración, creada a partir de cantidades conocidas de BSA disuelto en el sobrenadante de una muestra con cero contenido de proteína (muestra Control). La cantidad de proteínas encapsuladas en sílice se calculan por sustracción de la proteína detectada en sobrenadante de la cantidad inicial de proteína añadida. El único reactivo necesario para el análisis es el reactivo de Bradford (adquiridos o hechos según recetas estándar).
Hay tres tipos de formato de ensayo, dependiendo del volumen de la muestra, la cantidad esperada de proteína para ser detectado y el método de medición utilizado. En este documento, el formato seguido se especifica para un espectrofotómetro, requiere cubetas desechables de macro y de micro tamaño y puede detectar de 10 μg/mL a 1,4 mg/mL de proteína.
En la figura 7 se muestra la cantidad de proteína detectada después de cada lavado (paso 4.3) como un % de la cantidad de proteína inicial (que fue de 50 mg). Alrededor ~ 50% de BSA fue detectado en el sobrenadante después de la primera centrifugación, que se refiere a la eficacia de la inmovilización de ~ 50%. Pues había que no BSA detectado en los siguientes lavados, que BSA (o cualquier otra enzima) podría ser encapsulado firmemente durante la síntesis de sílice con ninguna lixiviación - esto es una ventaja importante de este método. Para confirmar la presencia de BSA en el sílice producido, se realizó análisis de transformada de Fourier infrarrojo espectroscopia (FTIR). La presencia de las bandas características de la amida I y II en la zona de 1.500/cm y 1650/cm (figura 8) en las muestras preparadas en presencia de BSA, pero no en el control de muestras (sin BSA) confirmaron la presencia de BSA en los sólidos.
Además del método de adición de enzima descrita anteriormente (BSA ha añadido durante la neutralización de la mezcla de reacción), hay otros posibles variaciones por ejemplo,BSA además durante la mezcla del silicato y las soluciones aditivas, antes de la neutralización o enzima añadida a la solución de silicato o aditivo antes de su mezcla y neutralización. Algunas de estas posibilidades fueron exploradas más y las eficiencias de inmovilización (masa de BSA inmovilizado como un porcentaje de enzima añadida al sistema de reacción calculado basado en el ensayo de Bradford) y la cantidad de BSA en la final de sílice fueron medidos ( concentración de BSA en sílice como porcentaje del peso total compuesto produce, ver figura 9). Estaba claro que cuando BSA fue agregada a los reactivos sin reaccionar (casos A C en la figura 9) no hubo diferencias considerables en la eficacia de la inmovilización o la cantidad de BSA en el compuesto resultante. Sin embargo, cuando BSA se agrega durante la formación de sílice (caso D en la figura 9), eficacia de la inmovilización y la cantidad de BSA en el producto final fueron significativamente más bajos. A pesar de estas diferencias, la cantidad promedio de sílice producido modificado (entre 85-90 mg). Estas observaciones pueden explicarse sobre la base de la ionización (o punto isoeléctrico) de BSA, silicato/sílice y el aditivo. Los diferentes métodos de adición permiten diversas interacciones entre las enzima y sílice precursores. Como el pH en el momento de la incorporación de los cambios enzimáticos, la ionización de cada especie determinan Interacciones intermoleculares, que a su vez controlará la eficacia de la inmovilización.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Cubeta No</td>
			<td>Concentración de BSA (mg/mL)</td>
			<td>Reactivo de Bradford (mL)</td>
			<td>Muestra (mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td>0 (control)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>0.1</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>0.25</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>0.5</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>0.75</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>1</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Muestra desconocida (X)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: configuración de ensayo Macro Bradford y componente calculado volúmenes. Válido para determinación gama 0.1-1.4mg/mL (volúmenes 1 repetición)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Cubeta No</td>
			<td>Concentración de BSA (ug/mL)</td>
			<td>Reactivo de Bradford (mL)</td>
			<td>Muestra (mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td>0 (control)</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>7.5</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>Muestra desconocida (X)</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: configuración del análisis de Bradford de la Micro y componente calculado volúmenes. Válido para la determinación de la gama 1 a 10 μg/mL (volúmenes 1 repetición)
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig1.jpg"> Figura 1 : Requiere volumen de título contra concentración de sílice para sistemas de reacción mediante DETA o PEHA como aditivo. Sílice fue sintetizada en concentraciones variables manteniendo una [N]: relación de [Si] de 1, para dos diferentes aditivos químicos. Barras de error son una desviación estándar alrededor de la media. 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig2.jpg"> Figura 2 : Fotografías de coágulo de silicona en el recipiente de la reacción (a) durante y (b) después de agitación, mostrando en la turbidez de la solución y colocar que son indicativos de una reacción óptima.  
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig3.jpg"> Figura 3 : Curva de calibración del modelo para análisis de macro Bradford. Sobrenadante de síntesis de sílice Bioinspirados en ausencia de BSA se mezcla con una cantidad conocida de la proteína, después de lo cual se realizaron análisis de Bradford como se describe en el paso 9.1.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig4.jpg"> Figura 4 : Estados de polimerización final de las especies de sílice para las condiciones de reacción diferentes. Sílice es sintetizada usando condiciones óptimas (línea de base), así como con el excesivo o debajo-valoración, después de que la concentración relativa de sílice es cuantificada para polysilicate monomérica o dimérico Silicatos (rojo), 'oligómeros' (azul) y de la coagulación inestable sílice (amarillo).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig5.jpg"> Figura 5 : Progresión de pH a través del sistema de reacción en función del volumen de la titulación inicial. Ácido se dosifica inmediatamente después de aprox. 38s de la mezcla, haciendo que el pH rápidamente bajar 8. Después, más cantidades de ácido son automáticamente una dosificación tal que el pH fue de 7,0 ± 0,05 300s después de la adición inicial. En el caso de exceso de valoración, esto no era posible, como la dosis inicial fue suficiente para dejar caer el pH debajo de 7, alcanzando pH 6.65 300s. Volumen inicial de HCl añadido de 'aterrizaje', 'línea de base,' y el 'overshoot' fue 6.90 7.05 y 7,20 mL respectivamente.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig6.jpg"> Figura 6 : Cambios representativos sobre la acidificación del material de silicio coagulado. (a) cambio de la concentración de aditivo con respecto al pH y (b) cambio de porosidad de sílice con respecto al pH. Reproducido de Manning et al. 13 bajo licencia Creative Commons. 
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig7.jpg"> Figura 7 : Concentración de BSA en sobrenadantes de síntesis Bioinspirados silicona. Se realizaron ensayos de Bradford en sobrenadantes de reacción después de la centrifugación, de la cual el resto de la cantidad relativa (por lo tanto ocluida de la sílice sintetizada) se determinó.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig8.jpg"> Figura 8 : Análisis FTIR en sílice Bioinspirados con y sin encapsulación de especies activas. Spectra demostrada: Negro línea: línea de silicona gris Bioinspirados: BSA pura, línea azul: Bioinspirados sílice cargada con BSA. Las líneas punteadas verticales indican bandas amida característico. 
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig9.jpg"> Figura 9 : Eficacia de la inmovilización y la cantidad de BSA en el compuesto de sílice producción usando PEHA. BSA fue agregada (A) en la solución PEHA antes de mezclar con silicato, (B) en la solución de silicato antes de mezclar con PEHA, (C) después de la mezcla inicial de soluciones PEHA y silicato y (D) después de mezclar PEHA y silicato soluciones y neutralización. Eficiencia se mide como % de BSA encapsulado de la mezcla de reacción como una proporción de BSA total agregado, mientras que BSA en sílice significa concentración % de BSA en compuesto de sílica final en masa. Barras de error son una desviación estándar alrededor de la media.

Aquí, presentamos un protocolo para sintetizar materiales de sílice Bioinspirados e inmovilizar enzimas en esto. Sílice se sintetiza mediante la combinación de silicato de sodio y una amina 'aditiva', que neutralizan a una velocidad controlada. Función y propiedades del material pueden modificarse por inmovilización de enzimas en situ o sintético posterior elución ácida de aditivos encapsulados.

Preparación de sílice funcional utilizando un método Bioinspirados

The goal of the protocols described herein is to synthesize bioinspired silica materials, perform enzyme encapsulation therein, and partially or totally ...

Las principales ventajas de este método son que es rápido, fácil, respetuoso con el medio ambiente y permite la adaptación de los materiales. Este método puede proporcionar información sobre cómo se forma la sílice bioinspirada, las formas disponibles de incorporación de biomoléculas y el tratamiento posterior al material sintético. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la formación de sílice es rápida y es necesario agregar rápidamente una cantidad específica de ácido para obtener los resultados óptimos.La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos dimos cuenta de lo suave que era, de modo que las condiciones eran compatibles con las enzimas. Pensamos en utilizar este método para mejorar el rendimiento y la estabilidad de las enzimas. La demostración visual de este método es fundamental, ya que el paso de neutralización del ácido es el más importante para las propiedades finales del material.Primero, pesa 318,2 miligramos de silicato de sodio pentahidratado en un recipiente de plástico de 180 mililitros y disuelve en 20 mililitros de agua desionizada. En un segundo recipiente, pesa 58,1 miligramos de hexamina de pentaetileno o PEHA y disuelve en 20 mililitros de agua desionizada. Reste esta cantidad de agua del volumen de agua desionizada que se utilizará para la disolución del silicato de sodio pentahidratado.Para realizar la encapsulación in situ durante la síntesis, disuelva una masa predeterminada de proteína en cinco mililitros de agua desionizada y coloque la solución en el refrigerador para su disolución total. Compruebe de vez en cuando el progreso de la disolución, preferiblemente sin remover. Combine las soluciones de silicato de sodio pentahidratado y PEHA en uno de los recipientes y agregue suficiente agua desionizada para que el volumen de la solución final sea de 41,5 mililitros.Coloque la mezcla recién preparada en la parte superior de un plato para revolver y agregue una barra para revolver para proporcionar una mezcla consistente. A continuación, suspenda una sonda de pH en la solución de agitación y registre el pH inicial. Comience la síntesis añadiendo una cantidad predeterminada de ácido clorhídrico de un molar y observe la evolución inmediata de la turbidez.El primer paso crítico es la adición rápida de ácido para iniciar la formación de sílice. El pH debe bajarse a siete lo más rápido posible. Si se está llevando a cabo la encapsulación, agregue la solución encapsulante tan pronto como se complete la adición de ácido.Luego registre el pH después de cinco minutos para determinar la finalización de la reacción. Una vez finalizada la reacción, modifique la composición de la sílice producida añadiendo más ácido clorhídrico a la mezcla hasta alcanzar el pH deseado entre dos y siete y permita que la suspensión se estabilice durante aproximadamente un minuto. A continuación, decantar la suspensión de sílice bioinspirada en tubos de centrífuga de 50 mililitros y, a continuación, centrifugar la suspensión a 5.000 g durante 15 minutos.Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y guárdelo para su posterior análisis. Vuelva a llenar los tubos de centrífuga con agua desionizada y vuelva a suspender la sílice con un mezclador de vórtice. En el caso de la incorporación de biomoléculas, un paso crítico es dar lavado a los sobrenadantes de la sílice bioinspirada para su posterior análisis.Después de repetir los pasos de centrifugación y resuspensión dos veces, retire el sobrenadante y raspe la sílice en crisoles cerámicos. Seque la sílice en un horno durante la noche a 85 grados centígrados. En un vial de plástico de cinco mililitros, diluir 300 microlitros de reactivo de azul de molibdeno previamente preparado con tres mililitros de agua desionizada.A continuación, añade 10 microlitros de solución de ácido salicílico y agita para mezclar. Después de 15 minutos, agregue 1,6 mililitros de agente reductor de sulfato de para-aminofenol previamente preparado para reducir el complejo de silicomolibdato amarillo a su isómero azul. A continuación, mida la absorbancia de la muestra a 810 nanómetros en un espectrofotómetro UV-vis y calcule la concentración de silicio contra una curva de calibración.Con puntas de pipeta desechables, agregue una cantidad predeterminada de reactivo Bradford y muestra en cada cubeta asignada. Mezclar cada cubeta invirtiendo tres veces y dejar que se desarrolle durante 10 minutos. A continuación, mida la absorbancia a 595 nanómetros utilizando sobrenadante puro como blanco.Calcule la absorbancia original de cada cubeta restando la absorbancia de la muestra de control de cada medición. Ahora, cree una curva de calibración para cada conjunto de experimentos trazando la absorbancia medida frente a la concentración de BSA para evitar fluctuaciones aleatorias que puedan afectar la sensibilidad del ensayo. Por último, determine el contenido de proteínas de cada muestra durante la resuspensión para controlar la posible pérdida de proteínas.El rendimiento de la reacción de formación de sílice suele ser de 58 más o menos 6,5%El método espectroscópico de azul de molibdeno detectó la cantidad de especies de silicato monomérico sin reaccionar, así como aquellas especies que reaccionaron para formar polisilicatos u oligómeros pero que no han logrado alcanzar el tamaño suficiente para coagularse. Una vez que se completa la coagulación, las superficies del material se pueden modificar fácilmente mediante el uso de elución ácida que permite el ajuste fino de las propiedades del material, como la composición, la porosidad y la actividad química del aditivo. Se detectó alrededor del 50% de BSA en el sobrenadante después de la primera centrifugación, lo que se relaciona con una eficiencia de inmovilización del 50%.Como no se detectó BSA en los siguientes lavados, el BSA pudo encapsularse de forma segura durante la síntesis sin lixiviación. El espectro FTIR de la sílice mostró bandas amida características en las muestras con BSA, pero no en las muestras control. Cuando se añadió BSA a los reactivos sin reaccionar, no hubo diferencias considerables en la eficiencia de la inmovilización ni en la cantidad de BSA en el compuesto resultante.Cuando se agregó BSA durante la formación de sílice, la eficiencia de inmovilización y la cantidad de BSA en el producto fueron significativamente menores. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de cinco minutos si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar ser preciso con los pesos y volúmenes de los reactivos y agregar rápidamente el ácido en una dosis.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como FTIR, SCM, porosimetría y ensayos enzimáticos para responder preguntas adicionales sobre las propiedades y la morfología del material, así como sobre la actividad de las biomoléculas. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la formación de sílice bioinspirada exploraran un método rápido, fácil, controlable y respetuoso con el medio ambiente para sintetizar sílice con la capacidad de encapsulación in situ de biomoléculas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar sílice utilizando un método bioinspirado, encapsular biomoléculas in situ, medir la eficiencia de encapsulación y realizar la elución postsintética de los aditivos.No olvide que trabajar con aminas, ácidos, biomoléculas puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el EPP y la prevención de derrames al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

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Chemistry

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