Name: Retinales crio-secciones, montajes de todo y vasculatura aislado hipotónica preparados para la visualización de Immunohistochemical del pericitos microvasculares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Aprende tres técnicas de preparación tisular para visualizar pericitos microvasculares en retina de rata: criosecciones, montajes completos e aislamiento hipotónico de la red vascular. Estos métodos permiten estudiar proliferación y migración celular en oftalmología.

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La investigación fue financiada por la Fundación Lundbeck, Dinamarca.

El protocolo fue optimizado y demostrado en ratas albinas machos adultos. En todos los procedimientos experimentales, los animales fueron tratados según las disposiciones de la declaración de ARVO para el uso de animales en oftálmica y la investigación de la visión. Los animales fueron sacrificados por el dióxido de carbono y la dislocación cervical posterior.
1. rata tejido retiniano preparados
<ol><li>
Cryo-sección
	<ol>
<li>Hacer posterior y anterior de ~0.5 rajas de cm de en el párpado de rata con un bisturí.<ol>
<li>Opcional: Con un quemador de diatermia, marque el ojo en el ángulo interno para orientar los ojos de una manera uniforme durante la incrustación y permitir criostato vertical Seccionando a través del nervio óptico.</li>
		</ol>
</li>
		<li>El ojo del gancho agarrador con el fórceps e incline cuidadosamente a un lado para exponer el tejido circundante. Enuclear el ojo haciendo cortes con las tijeras de disección en el tejido conjuntivo y muscular. PRECAUCIÓN: No tire el ojo demasiado ya que una presión excesiva sobre el nervio óptico puede causar desprendimiento de retina.</li>
		<li>Poner los ojos brevemente en formaldehído al 4% en tampón fosfato salino (PBS) se estabilice antes de hacer un agujero inicial en el limbus córneo aplicando ligera presión con la punta de un bisturí.</li>
		<li>Bajo el microscopio, corte a lo largo del limbo corneal con tijeras de disección para retirar la córnea y retirar la lente con el fórceps antes de sumergirse en formaldehído al 4% en PBS durante 2 – 4 h.</li>
		<li>Enjuague secuencialmente en tampón de fosfato de Sörensen con 10% de sacarosa y 25% de sacarosa.</li>
		<li>Incrustar en medio de Yazulla con 3% gelatina de porcino piel y 30% albúmina de clara de huevo de pollo. Nota: El protocolo puede ser una pausa aquí con almacenamiento de tejido a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montaje en conjunto
	<ol>
<li>Hacer posterior y anterior de ~0.5 cm cortes en el párpado de rata con un bisturí.</li>
		<li>El ojo del gancho agarrador con el fórceps e incline cuidadosamente a un lado para exponer el tejido circundante. Enuclear el ojo haciendo cortes con las tijeras de disección en el tejido conjuntivo y muscular. PRECAUCIÓN: No tire el ojo demasiado ya que una presión excesiva sobre el nervio óptico puede causar desprendimiento de retina.</li>
		<li>Poner los ojos brevemente en formaldehído al 4% en PBS a estabilizar antes de hacer un agujero inicial en el limbus córneo aplicando ligera presión con la punta de un bisturí.</li>
		<li>Bajo el microscopio, corte a lo largo del limbo corneal con tijeras de disección para retirar la córnea y retirar la lente con el fórceps.</li>
		<li>Separar la retina del epitelio pigmentario de la retina hacia el nervio óptico con el fórceps con pequeña abertura movimientos para evitar desgarro importante.</li>
		<li>Libre de la retina en el nervio óptico con tijera de disección y hacer cuatro cortes de pocos milímetros de longitud de la periferia retiniana hacia la cabeza del nervio óptico.</li>
		<li>Difundir la retina en un portaobjetos de vidrio y permite secar durante 5 – 10 min.</li>
		<li>Fijar en formaldehído al 4% para 20-30 min por goteo de formaldehído en la retina. PRECAUCIÓN: No aplicar directamente sobre la retina como puede separar de la Copa.</li>
		<li>Lavar con PBS. Para obtener resultados óptimos, inmuno-tinción directamente después del enjuague.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aislamiento hipotónica
	<ol>
<li>Hacer posterior y anterior de ~0.5 cm cortes en el párpado de rata con un bisturí.</li>
		<li>El ojo del gancho agarrador con el fórceps e incline cuidadosamente a un lado para exponer el tejido circundante. Enuclear el ojo haciendo cortes con las tijeras de disección en el tejido conjuntivo y muscular. PRECAUCIÓN: No tire el ojo demasiado ya que una presión excesiva sobre el nervio óptico puede causar desprendimiento de retina.</li>
		<li>Hacer un agujero inicial en el limbus córneo aplicando ligera presión con la punta de un bisturí.</li>
		<li>Bajo el microscopio, corte a lo largo del limbo corneal con tijeras de disección para retirar la córnea y retirar la lente con el fórceps.</li>
		<li>Separar la retina del epitelio pigmentario de la retina hacia la cabeza del nervio óptico con el fórceps con pequeña abertura movimientos para evitar desgarro importante.</li>
		<li>Sin la retina en el nervio óptico con tijeras de disección, colocar la retina en 1 mL de agua desionizada en un plato 24-well y agita a 200 rpm con una órbita de vibraciones 1,5 mm por 1 h a temperatura ambiente. Nota: En adelante, la retina aparece que menos definida en los bordes.</li>
		<li>Añadir 200 U DNasa 1 para disociar los restos de células sometidas a lisis de la vasculatura retiniana y agite por otros 30 minutos a temperatura ambiente. Nota: Desechos podrían empezar a formarse en los pozos.</li>
		<li>Enjuague mínimo 3 veces en agua desionizada durante 5 min con agitación a 150 – 300 rpm para eliminar los restos de células neuronales. La retina debe ser más transparente con cada enjuague indicativo de la eliminación de los desechos celular neuronal.<ol>
<li>Para ver en la placa de 24 pocillos a ver claramente la vasculatura retiniana aislada diáfana, usar un fondo oscuro.</li>
			<li>(Opcional): Si la vasculatura no aparece libre de capas neuronales (semi transparentes) en este punto ya sea añadir más pasos de enjuague, aumentar la velocidad de agitación o utilice una pipeta para aspirar el líquido sobre la vasculatura. PRECAUCIÓN: Cualquiera de los pasos opcionales pueden dañar la vasculatura.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Arreglo 10 minutos en 1 mL de paraformaldehído al 4% en PBS a temperatura ambiente y enjuagar 3 veces en PBS. Nota: El protocolo puede pausarse aquí con almacenamiento de tejidos a 4 º C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. inmunohistoquímica
<ol><li>
Tinción de cryo-secciones
	<ol>
<li>Corte 10 μm cryo-secciones de la retina embebido en gelatina como seccionamiento vertical a través del nervio óptico y coloque el cryo-secciones en un portaobjetos de vidrio y dejar secar (mínimo 1 h).</li>
		<li>Sumerja el portaobjetos de cristal en PBS con 0.25% Tritón X-100 (PBS-T) durante 15 minutos.</li>
		<li>Goteo 1: PDGFRβ 100 y 1: 500 NG2 anticuerpos primarios diluidos en PBS-T + 1% de BSA en la sección de crio e incubar en cámaras de incubación a 4 ° C durante la noche.</li>
		<li>Sumerja el portaobjetos de cristal 2 veces en PBS-T durante 15 min y 1: 100 Alexa Fluor 594-ligado y 1: 100 Anti-conejos FITC-ligado secundarios anticuerpos anti-ratón diluidos en PBS-T con el 3% de BSA en el cryo-secciones del goteo.</li>
		<li>Incube el portaobjetos de cristal 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
		<li>Enjuagar el portaobjetos de cristal en PBS-T 2 x 15 min. Nota: Opcional: para dobles y triples de tinción inmunofluorescente, tinción secuencial puede realizarse repitiendo el procedimiento de 2.1.3 y 2.1.6 dos y tres veces, respectivamente.</li>
		<li>Monte las secciones manchadas de crio con antidecoloración montaje medio DAPI que contiene y un cubreobjetos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
La coloración de conjunto montaje
	<ol>
<li>Gotee el montaje conjunto con PBS-T e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.</li>
		<li>Retirar y goteo 1: PDGFRβ 100 y 1: 500 NG2 anticuerpos primarios diluidos en PBS-T + 1% de BSA e incubar en cámara húmeda a 4 ° C durante la noche.</li>
		<li>Retirar y goteo en PBS-T para enjuagar el portaobjetos de vidrio de 2 x 15 min.</li>
		<li>Retirar y gotear en el 1: 100 anti-conejo Cy2 - y 1: 100 anti-ratón Cy3-ligado anticuerpo secundario diluido en PBS-T con el 3% de BSA para incubar 1 h en cámara húmeda a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
		<li>Retirar y goteo en PBS-T a la aclaración de 2 x 15 min en la oscuridad. Nota: Opcional: para dobles y triples de tinción inmunofluorescente, tinción secuencial puede realizarse repitiendo el procedimiento de 2.2.2 a 2.2.5 dos y tres veces, respectivamente.</li>
		<li>Monte el soporte de toda manchado con antidecoloración montaje medio DAPI que contiene y un cubreobjetos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tinción de vasculatura aislado hipotónica
	<ol>
<li>Bloquear la vasculatura aislada hipotónica 1 h con agitación a 100 rpm y temperatura con 500 μL/pocillo de suero de burro 10% diluido en PBS.</li>
		<li>Incubar durante una noche a temperatura ambiente y agite a 100 rpm con 600 μL/pocillo de 1 PDGFRβ: 100 y 1: 500 NG2 anticuerpos primarios diluidos en suero de burro de 10% en PBS.</li>
		<li>Enjuague la retina red 3 x en PBS durante 5 minutos e incubar en 1: 100 Alexa Fluor 594-ligado y 1: 100 Anti-conejos FITC-ligado secundarios anticuerpos anti-ratón diluidos en suero de burro de 10% en PBS agitación a 100 rpm y a temperatura ambiente durante 1 h en la oscuridad.</li>
		<li>Lavar en PBS-T por 5 min e incubar en DAPI en PBS-T de 0,2 ng/mL durante 15 min seguido por enjuagues 3 veces, 5 minutos en PBS-T en la oscuridad.</li>
		<li>Cortar la punta de una pipeta Pasteur plástica, humedézcalo con PBS-T y usarlo para transferir la red retina a un portaobjeto de cámara 4-bien. Nota: El paso de la humectación es importante evitar la vasculatura retiniana que se pega en el interior de la pipeta de Pasteur.</li>
		<li>Despliegue de la vasculatura retiniana. Evite tocar la vasculatura retiniana con pinzas ya que esto puede causar la vasculatura a enredarse. Nota: Despliegue puede hacerse inclinando el portaobjetos de la cámara hacia adelante y hacia atrás o aspirar las gotas de líquido sobre la vasculatura retiniana.</li>
		<li>Retire el medio de los pozos. La tensión superficial del líquido se aplane la vasculatura en la parte inferior de la diapositiva.</li>
		<li>Asegurar el correcto despliegue bajo el microscopio antes de retirar el plástico de los pozos de la diapositiva de la cámara.</li>
		<li>Monte la vasculatura manchada con medio de montaje antidecoloración y un cubreobjetos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Presentamos tres técnicas retiniana que pueden ser aplicadas en el estudio del pericitos retinianos microvasculares. A continuación, ofrecemos una comparación entre cada uno de los métodos y resaltar los pasos críticos en los protocolos.
Con el seccionamiento de cryo, la retina se corta en secciones sagitales y por lo tanto, es posible obtener numerosas muestras de la misma retina. Las secciones números resultantes de este método lo hacen una opción ideal para la especificidad de anticuerpos y...

Pericitos retinianos son el foco de muchos laboratorios de investigación como estas células desempeñan un papel importante en la integridad de la vasculatura. Condiciones patológicas tales como la retinopatía diabética1, isquemia2y glaucoma3 tienen características vasculares que implican la función del pericitos. Pericitos se encuentran en los plexos capilares retinianos internos. Ramas de la arteria central de la retina que suministra la retina interna en dos capas de plexos capilares. El lecho vascular interno se encuentra entre la célula del ganglio y las capas nucleares internas. La capa más profunda es más densa y compleja y se localiza entre las capas nucleares interna y externa4,5. Además, algunas partes de la retina contienen también una tercera cadena denominada los capilares parapapillary radial. Estos son largos, tubos capilares rectos que se encuentran entre las fibras nerviosas y raramente los anastomose con uno con el otro o los otros dos plexos6. Dentro de la pared capilar, pericitos están incrustadas en la membrana del sótano y la línea del lado abluminal de células endoteliales vasculares.
Hasta la fecha, no existe ningún marcador biológico único de estos pericitos que puede distinguir de otras células vasculares. Β del receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRβ) y el antígeno del nervio/glial 2 (NG2) son marcadores utilizados que presentan en pericitos pero también otras células vasculares. Identificación del pericitos se complica aún más por la existencia de pericyte subconjuntos que varían en morfología y proteína expresión7. Actualmente, la mejor identificación se basa en una combinación de marcadores de proteínas y la característica de la pericyte en la pared vascular. Aquí demostramos tres técnicas de preparación de tejidos diferentes para la coloración immunohistochemical PDGFRβ/NG2 del pericitos microvasculares retina de rata, es decir, cryo-secciones, todo-montajes y aislamiento hipotónica de la red vascular.
Con secciones de cryo, la retina y la esclerótica se cortan a través del nervio óptico. Esto permite la visualización de todas las estructuras de capas de neuronas. Las diez distintas capas de la retina son evidentes como intercambio de estructuras nucleares y axonal/dendríticas que pueden visualizarse con tinciones como hematoxilina/eosina o fluorescente nuclear 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8. Las necesidades metabólicas difieren entre las capas9 y ofrece un método para determinar el grueso o total ausencia de una capa específica (por ejemplo, la pérdida de células ganglionares de la retina es una de las características de la isquemia retiniana10, 11). La vasculatura es evidente como transversal atraviesa la retina, lo que es posible estudiar por separado los plexos capilares dentro de las respectivas capas retinianas12,13.
Más tradicionalmente, se realizan las investigaciones de la red de la vasculatura retiniana en retina de monturas de todo. Con esta preparación de tejido, la retina se corta y aplanada como una estructura en forma de flor. El método es una técnica de preparación de tejido relativamente rápido que se puede destacar la vasculatura retiniana de arquitectura general y por lo tanto se aplica a menudo en la investigación de neovascularización de la retina murina. Visualización exitosa de la microvascularización en retinas todo montado también se divulga en el ratón neonatal en desarrollo y14,de retina de rata15,de17,de16,18, 19. estos estudios revelan una actividad pericytic más definida con áreas libre de capilares más grandes en el adulto frente a los los neonatal retina14.
Otra forma de visualizar es la microvasculatura retiniana después aislamiento hipotónica. Esta técnica de preparación de tejido resulta en vasos sanguíneos retinianos y capilares liberados de las células neuronales. Este tipo de proyección de imagen de dos dimensiones de la red vascular retiniana aislada es generalmente realizada después de la digestión de tripsina retina20 y utilizado para evaluar las anormalidades vasculares de la retinopatía diabética como pericyte pérdida capilar degeneración20,21,22. El método de aislamiento hipotónica ofrece las investigaciones de gen vascular retiniana y proteínas reguladoras respuestas como lo ha hecho con la RT-PCR y western blot23,24,25. Aquí proporcionamos un protocolo para el flotador libre de la coloración de immunohistochemical de la vasculatura retiniana aislada hipotónica como alternativa a la digestión de la tripsina para examinar del pericitos microvasculares.

<table><tbody><tr><td>Geletina de piel porcina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2625-500G</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina de clara de huevo de gallina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5253-500G</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa (ADNasa) I de páncreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-15KU</td><td>Disuelto en 0,15 M NaCl</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Suero de burro normal</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121, lote 129348</td><td></td></tr><tr><td>Conejo anti-PDGFR&beta;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-432</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Ratón anti-NG2</td><td>Abcam</td><td>ab50009</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Conejo IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-585-152</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Fluoresceína (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-151</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-225-152</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-165-150</td><td>1:100</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>Disuelto en DMSO</td></tr><tr><td>Medio de montaje anti-decoloración</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje anti-decoloración con DAPI</td><td>Vector Laboratorios</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II portaobjetos de 4 pocillos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>154526</td><td></td></tr></tbody></table>

retinales crio-secciones, montajes de todo y vasculatura aislado hipotónica preparados para la visualización de immunohistochemical del pericitos microvasculares

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Pericitos retinianos juegan un papel importante en muchas enfermedades del ojo. Immunohistochemical que manchaba técnicas de vasos retinianos y microvascular pericitos son fundamentales para la investigación oftalmológica. Es vital elegir un método apropiado de visualización del pericitos microvasculares. Describimos pericyte microvascular retiniana immunohistochemical que manchaba en cryo-secciones, todo-montajes e hipotónica vasculatura aislado usando los anticuerpos para el antígeno del nervio/glial 2 (NG2) y β del receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRβ). Esto nos permite destacar ventajas y deficiencias de cada una de las preparaciones de tres tejido para la visualización del pericitos microvasculares retinianas. Cryo-secciones proporcionan visualización de transsectional de todas las capas retinianas pero contienen sólo unos ocasionales cortes transversales de la microvascularización. Montaje en conjunto proporciona una visión general de la vasculatura retiniana completa y visualización de la microcirculación puede ser problemática. Hipotónica aislamiento proporciona un método para visualizar la vasculatura retiniana toda por la eliminación de las células neuronales, pero esto hace que el tejido muy frágil.

Los protocolos exitosos proporcionan tres diferentes preparaciones de retinales para la visualización de pericitos microvasculares. Cada uno de estos métodos utiliza la PDGFRβ y NG2 immunoreactivity co-localización y la posición única del pericitos alrededor del foridentification del endotelio capilar.
Con secciones de crio, las capas neuronales pueden ser identificadas por la densidad fluorescente de núcleos etiquetados de DAPI...

Demostrar técnicas de preparación de tres tejidos diferentes para la visualización de immunohistochemical del pericitos microvasculares retina de rata, es decir, cryo-secciones, todo-montajes e hipotónica aislamiento de la red vascular.

Retinales crio-secciones, montajes de todo y vasculatura aislado hipotónica preparados para la visualización de Immunohistochemical del pericitos microvasculares

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la oftalmología, como la proliferación de pericitos o la migración. La principal ventaja de este procedimiento es que proporcionan una variedad de opciones de visualización. Demostrando los procedimientos estarán Karin Dreisig y Frank W.Blixt, dos post-doctorados en nuestro laboratorio.Para enuligar el ojo, primero usa un bisturí para hacer las hendiduras posterior y anterior de aproximadamente 0,5 centímetros en el párpado de la rata. Agarre el ojo con fórceps e incline cuidadosamente hacia un lado para exponer el tejido circundante. Enuclete el ojo haciendo cortes con tijeras de disección en el tejido conectivo y muscular.Coloque brevemente el ojo en un 4%formaldehído y solución salina tamponada con fosfato durante uno o dos minutos. Enjuague brevemente en tampón de sodio antes de hacer un agujero en el limbo corneal aplicando una ligera presión con la punta de un bisturí. Corte a lo largo del limbo corneal con tijeras de disección para eliminar la córnea y la lente con fórceps.Sumerja el tejido restante con retina en 4%formaldehído en PBS durante dos a cuatro horas. Cryo-proteger el tejido sumergiendo en el t

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este artículo se describe un método para el etiquetado de la piel embrionaria y los vasos sanguíneos del timo.

Un método para etiquetar los Vasos sanguíneos en embriones de ratones

Fuente: Vacca, O., et al. Uso del virus asociado a adenovirus como herramienta para estudiar las barreras retinianas en enfermedades. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra el procedimiento paso a paso para preparar criosecciones de retina de ratón con el fin de visualizar la permeabilidad del virus asociado a adenovirus a través de barreras retinianas alteradas.

Preparación de criosecciones retinianas de ratón para evaluar la permeabilidad retiniana al virus adenoasociado

La retina murino neonatal proporciona un modelo bien caracterizado fisiológica de la angiogénesis, que permite que las investigaciones de las funciones de los diferentes genes o fármacos que modulan la angiogénesis en...

Todo el montaje de la tinción de inmunofluorescencia del Neonatal ratón Retina de investigar Angiogénesis<em&gt; En vivo</em

El protocolo descrito aquí es para la evaluación estructural de una preparación de retina de montaje completo. Esto incluye descripciones de la disección de tejidos, el montaje en un inserto de membrana de politetrafluoroetileno (PTFE) hidrofilizado, la carga en bolo con marcadores fluorescentes y una comparación de la fijación con carbodiimida y paraformaldehído para el análisis inmunohistoquímico de componentes celulares y sinápticos.

Protocolo optimizado para Retina Preparación Wholemount de la Imagen y la inmunohistoquímica

Este informe describe métodos completos para preparar secciones de retina de ratón congeladas para inmunohistoquímica (IHC).  Los métodos descritos incluyen disección de la copa ocular posterior, fijación de paraformaldehído, incrustación en la temperatura de corte óptima (OCT) orientación de medios y tejidos, seccionamiento e inmunomancha.

Preparación de criosecciones retinianas de ratón para inmunohistoquímica

Este artículo describe un ensayo de tinción de lectina bien establecido y reproducible para las preparaciones retinianas de montaje completo y los protocolos necesarios para la medición cuantitativa de los parámetros vasculares frecuentemente alterados en las retinopatías proliferativas y no proliferativas.

Cuantificación de parámetros vasculares en retinas de monte entero de ratones con retinopatías no proliferativas y proliferativas

Este protocolo describe un método fiable para obtener criosecciones de alta calidad de ojos de conejo enteros. En él se detallan los procedimientos de disección, fijación, inclusión y seccionamiento de ojos de conejo, que pueden adaptarse fácilmente para su uso en cualquier estudio que utilice inmunohistoquímica en ojos más grandes.

Obtención de criosecciones de alta calidad de ojo de conejo entero 

Los pericitos de la vasculatura de la retina se examinaron mediante tinción inmunofluorescente con receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas β después de la inyección retroorbitaria de lectina fluorescente de tomate. La retina marcada se trató posteriormente con el método de limpieza de tejidos y se montó completa para visualizar las vistas tridimensionales de los pericitos que rodean la vasculatura de la retina bajo un microscopio confocal.

Visualización 3D de pericitos vasculares retinianos en ratones mediante inmunotinción 

Se describe un protocolo para preparar criosecciones de retina en ratones y realizar inmunotinción en fotorreceptores. Este artículo permite a los investigadores producir de forma consistente secciones congeladas de retina de ratón con una morfología bien conservada y resultados de inmunotinción de alta calidad.

Criosección e inmunotinción de retina de ratón

El presente método permite criostato reproducible la sección de los pequeños trozos de tejido, difícil de manejar, tales como las biopsias y las rodajas de cerebro. Utilizamos una etapa de aluminio de congelación sencillo para facilitar la manipulación de los tejidos y un criostato de rutina estándar para producir secciones 5-10 micrones de serie a partir de 400 rebanadas de cerebro micras de espesor.

El corte delgado de los preparativos de círculo para inmunohistoquímica

Aprende tres técnicas de preparación tisular para visualizar pericitos microvasculares en retina de rata: criosecciones, montajes completos e aislamiento hipotónico de la red vascular. Estos métodos permiten estudiar proliferación y migración celular en oftalmología.

Retinales crio-secciones, montajes de todo y vasculatura aislado hipotónica preparados para la visualización de Immunohistochemical del pericitos microvasculares (Video) | JoVE Journal

Retinales crio-secciones, montajes de todo y vasculatura aislado hipotónica preparados para la visualización de Immunohistochemical del pericitos microvasculares

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