Evaluar el papel de la función mitocondrial en la fatiga relacionada con el cáncer

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la disfunción mitocondrial asociada con la fatiga en pacientes con cáncer. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la atención oncológica de apoyo, como si la disfunción mitocondrial se relaciona con la fatiga en pacientes con cáncer después de recibir radioterapia. La principal ventaja de esta técnica es que es menos invasiva y se puede utilizar fácilmente en la clínica para identificar a los pacientes con riesgo de toxicidades por la terapia contra el cáncer.

Esta técnica no solo avanza en nuestra comprensión del papel de la disfunción mitocondrial en la fatiga relacionada con el cáncer, sino que también puede mejorar la evaluación y optimizar su tratamiento. Aunque este método puede proporcionar información sobre los mecanismos subyacentes de la fatiga relacionada con el cáncer, también se puede aplicar a otras enfermedades fatigosas, como las afecciones metabólicas y uroinflamatorias. En general, puede ser un desafío para las personas nuevas en este método inyectar inhibidores respiratorios en cada puerto del cartucho del sensor correctamente sin una demostración visual previa.

El Sr. Quang Nguyen, un becario de posgrado de nuestro laboratorio, demostrará este procedimiento. Para hidratar el cartucho del sensor, primero retírelo del paquete. A continuación, añada 200 microlitros de solución calibrante a cada pocillo de la placa utilitaria.

Llene también cada foso con 400 microlitros de solución calibrante. A continuación, regrese la placa del sensor a la placa de servicios públicos y comience a hidratar el cartucho en una incubadora sin dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante la noche. Mida el nivel de fatiga en función de la evaluación funcional de 13 ítems de la terapia de enfermedades crónicas.

Fatiga al inicio del estudio, en el punto medio, al finalizar la RHE y un año después de la RHE. En primer lugar, prepare el medio de ensayo para la medición de la función mitocondrial. Después de preparar el medio, caliéntalo a 37 grados centígrados y ajusta el pH a 7,4.

Es importante asegurarse de que los medios de ensayo estén preparados el día del experimento y se calienten a 37 grados antes de ajustar el pH a 7,4. A continuación, siembre los PBMC en cada pozo para lograr una confluencia del 80 al 90 por ciento. Luego gire el plato a 200 veces g durante 2 minutos para que las células se adhieran al fondo de los pocillos.

Después del centrifugado, retire los medios de cada pocillo y enjuague los pocillos una vez con medios de ensayo. Agregue 180 microlitros de medio de ensayo en cada pocillo, incluidos los pocillos de fondo. Luego incube la placa a 37 grados Celsius en una incubadora sin dióxido de carbono durante 45 a 60 minutos.

Para reconstituir los fármacos, añada 252 microlitros de medio de ensayo al fármaco para generar una solución madre de 50 micromolares de oligomicina. Agregue 288 microlitros de medio de ensayo al medicamento para generar una solución madre de 50 micromolares de FCCP. Finalmente, agregue 216 microlitros de medio de ensayo para generar una solución madre de 25 micromolares de antimicina a/rotenona.

Después de reconstituir los tres medicamentos, vórte, la suspensión del medicamento durante un minuto y luego diluya las soluciones de trabajo. A continuación, pipetee 20 microlitros de oligomicina de 10 micromolares en el puerto A hasta una concentración final de un micromolar en cada pocillo. A continuación, pipetee 22 microlitros de FCCP de 10 micromolares en el puerto B hasta una concentración final de un micromolar en cada pocillo.

Por último, pipetear 25 microlitros de 5 micromolares de antimicina a/rotenona en el puerto C hasta una concentración final de 0,5 micromolares en cada pocillo. A continuación, seleccione la prueba de esfuerzo Mito en el instrumento de flujo extracelular. A continuación, inserte el cartucho del sensor siguiendo las indicaciones del instrumento.

El instrumental realizará automáticamente la calibración del sensor. Una vez finalizada la calibración, inserte la placa de celda para que el instrumento termine el resto del ensayo. Para preparar la solución del ensayo de proliferación celular, agregue 5,76 microlitros de tinción de ácido nucleico y 28,8 microlitros de supresor de fondo a 1,405 mililitros de solución salina tamponada con fosfato.

Una vez finalizada la prueba de esfuerzo de Mito, agregue 180 microlitros de solución de trabajo 2x directamente en el medio de cada pocillo. A continuación, incubar las células con la solución del ensayo de proliferación celular a 37 grados centígrados durante 45 a 60 minutos. Cuantifique el número de células vivas en un lector de placas a 508 nanómetros de excitación y 527 nanómetros de emisión, seguido de la normalización de los datos de OCR.

Al realizar la titulación de FCCP, un micromolar es la concentración óptima del fármaco que se utiliza para evaluar la función mitocondrial de PBMC. La investigación de la respiración mitocondrial y las PBMC recién aisladas muestra que el OCR comienza a disminuir a las tres horas y continúa hasta las ocho horas. Sin embargo, la respiración máxima provocada por la inyección de FCCP tampoco supera el nivel basal de OCR.

Aquí se muestra la normalización de la función mitocondrial donde las células se aíslan de dos individuos sanos. De hecho, el OCR normalizado a células vivas representadas por el colorante de unión al ADN de fluorescencia verde es similar en ambos individuos sanos. De hecho, no se observan diferencias significativas en el OCR basal entre un sujeto sano y uno fatigado.

Sin embargo, el sujeto fatigado muestra una disminución del consumo máximo de oxígeno y de la capacidad respiratoria ociosa en comparación con el control. No se encuentran diferencias en el consumo de oxígeno no mitocondrial y relacionado con ATP o en la eficiencia del acoplamiento entre los sujetos sanos y los fatigados. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en cuatro horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que primero debe determinar la densidad celular óptima y las concentraciones de FCCP. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el aislamiento de diferentes poblaciones celulares, con el fin de guiar futuras investigaciones mecanicistas centradas en tipos celulares específicos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de los cuidados de apoyo exploraran el papel de la disfunción mitocondrial en pacientes con cáncer fatigados.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo medir la función mitocondrial y muestras clínicas que también se pueden usar para identificar de manera proactiva a los pacientes en riesgo de desarrollar toxicidades relacionadas con el tratamiento del cáncer, incluida la fatiga. No olvide que trabajar con inhibidores respiratorios como la oligomicina y la rotenona puede ser extremadamente peligroso. Siempre se deben tomar precauciones, como el uso de equipo de protección personal, al realizar este procedimiento.