Name: Lavado broncoalveolar exosomas en lesión pulmonar séptica inducida por lipopolisacárido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Aprende a aislar exosomas de lavado broncoalveolar en ratones con lesión pulmonar aguda inducida por LPS. Este método permite estudiar la comunicación intercelular y el papel de los exosomas en la inflamación pulmonar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores han declarado no hay conflicto de intereses.

El protocolo general requiere de 2 días, incluyendo el primer día de la inducción de la sepsis y el aislamiento del líquido del BAL de la animal y el segundo día para aislamiento de exosomas de ratón BALF. Todos los procedimientos han sido revisados y aprobado por el cuidado institucional de animales y uso centro médico VA de Atlanta.
1. modelo de lesión pulmonar aguda séptica ratón
<ol><li>Use 6-8 semanas - viejo tipo C57BL/6J ratones machos (20-22 g de peso) para el animal modelo y realizar todos los procedimientos utilizando instrumentos y técnicas asépticas. Autoclave de todos los instrumentos quirúrgicos como pinzas y tijeras por 20 min a 121 ° C.</li>
	<li>Distribuir aleatoriamente ratones en experimental y grupo control. Refrenar los ratones en una mesa quirúrgica. Tratamiento de ratones con Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS, 15 mg/kg) por vía intraperitoneal. Según el peso del cuerpo individual, diluir dosis de LPS correspondientes a 0,1 mL de PBS por el ratón, luego inyectar solución de LPS, utilizando una jeringa de 1 mL con aguja 27 G e inyectar un volumen equivalente de PBS a los animales control.</li>
	<li>Mantener los ratones en las instalaciones BSL2 animal, que consiste en jaulas limpias a temperatura adecuada.</li>
	<li>24 horas más tarde, eutanasia ratones con inhalación de CO2 .</li>
	<li>Seleccione el área quirúrgico en el centro del cuello del ratón. Hacer una pequeña incisión (5 mm aproximadamente) y separar suavemente los músculos para el acceso a la tráquea usando fórceps romos hasta que la tráquea quede expuesta.</li>
	<li>Retirar el líquido del BAL ratón con jeringa estéril de 10 mL con una aguja de 27 G. Primero, suavemente, inserte la aguja en la tráquea e inyectar lentamente 1 mL de PBS estéril en la tráquea, luego dibujar BALF en una jeringa desechable de 3 mL con una aguja de 27 G. Al finalizar el procedimiento, deseche las jeringas y agujas en el contenedor biológico.</li>
	<li>Tratar los instrumentos quirúrgicos con dióxido de cloro, como se describe anteriormente por Chauret et al. 27y luego esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos en autoclave durante 20 min a 121 ° C.</li>
</ol>2. exosomas aislamiento-serie Ultra-centrifugación y caracterización
<ol><li>Recoger el líquido del BAL ratón en tubos cónicos de 15 mL. Para cosechar las células alveolares, centrifugar las muestras durante 10 minutos a 1.000 g, a 4 ° C.</li>
	<li>Transferir el sobrenadante a nuevos tubos cónicos de 15 mL y centrifugar las muestras durante 30 min a 4.000 x g a 4 ° C para eliminar restos celulares.</li>
	<li>Recoger el sobrenadante en tubos de ultracentrífuga y centrifugar las muestras durante 60 min a 10.000 x g a 4 ° C para eliminar las partículas más grandes de celulares.</li>
	<li>Transferir el sobrenadante a nuevos tubos cónicos y filtrar las muestras con jeringa-filtro de 0,2 μm para eliminar el remanente de las partículas más grandes.</li>
	<li>Recoger las muestras en tubos de ultracentrífuga y equilibrar los tubos. Centrifugar las muestras durante 2 h a 140.000 x g a 4° C para que sedimenten los exosomas. Nota: El tamaño de exosomas varía de 20-200 nm. filtro de 0.2 μm se utiliza para quitar las partículas más grandes que son más de 200 nanómetro de tamaño.</li>
	<li>Descartar el sobrenadante cuidadosamente. Disolver el precipitado con 100 μl PBS o solución de lisis y muestras de exosomas transferencia a tubos de 1,5 mL y guardar a-80 ° C hasta su uso. Nota: Microscopio electrónico de transmisión se recomienda verificar exosomas aislado.</li>
	<li>Siga la muestra TEM estándar protocolo28de procesamiento. Analizar muestras de exosomas utilizando microscopía electrónica de transmisión y tomar imágenes, escala bar 200 nm.</li>
</ol>3. preparación de miRNA y escénicas miRNA-q-RT-PCR
Nota: miRNA-q-RT-PCR se recomienda analizar el nivel de expresión de miRNAs.
<ol><li>Seguir protocolo de aislamiento estándar miRNAs y asegúrese de que utilizar una cantidad igual de RNAs purificados en la transcripción reversa del solo-filamento de24.</li>
	<li>Siga el protocolo estándar de PCR en tiempo real para detectar nivel de microARN exosomal en líquido del BAL. Uso de iniciadores específicos de PCR en tiempo real contra miR-155, miR-146a y SnRNA U6. Reacción de PCR con el aparato PCR cuantitativo y normalizar los valores de expresión para control interno U6 snRNA. Nota: Cada grupo está formado por triplicado muestras24.</li>
</ol>4. exosomas etiquetado y purificación
<ol><li>Suspender exosomas sedimento con solución de suspensión de 100 μL en un tubo de polipropileno de 1.5 mL, luego agregar 0,4 μL de colorante de exosomas en el otro tubo con 100 μl de la solución de la suspensión.</li>
	<li>Rápidamente añadir exosomas en la solución a la solución de colorante y mezclar bien mediante pipeteo. Mantener las muestras durante 5 minutos a temperatura ambiente, proteger de la luz.</li>
	<li>Poner una columna de spin de exosomas en un tubo de 1,5 mL con elución. Transferir la mezcla de la solución para el centro de la columna de spin de exosomas.</li>
	<li>Girar la columna por 2 min a 800 x g a temperatura ambiente.</li>
	<li>Deseche el columna y almacenar las muestras eluídas a-20 ° C hasta su uso.</li>
</ol>5. validación de exosomas de células receptores
<ol><li>1 x 104 12 MLE /cell en una diapositiva 8-pozo cámara y células en cultivo a 37 ° C, 5% CO2de la semilla.</li>
	<li>Añadir 10 μl marcado con fluorescente exosomas a las células. Incubar durante 1 h a 37 ° C.</li>
	<li>Quitar los medios de cultivo y lavar las células con PBS, luego fijar las células con paraformaldehído al 1% durante 10 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Monte la corredera en medio del Monte con DAPI.</li>
	<li>Analizar las muestras a través de un microscopio de fluorescencia y tomar imágenes, 40 aumentos.</li>
</ol>6. verificación de la interacción entre células receptores y exosomas
<ol><li>Semilla 2 x 105 MLE12/pozo de una placa de cultivo de 12 pozos conteniendo medio de cultivo apropiado y células en cultivo a 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Añadir 20 μg exosomas del líquido ratón BAL MLE12 células y configurar repeticiones por grupo experimental.</li>
	<li>24 horas más tarde, lavar las células con PBS y añadir 600 μl de tampón de lisis en pozo. Homogeneizar la placa y recoger muestras de lisis en tubos de 1,5 mL con la pipeta.</li>
	<li>Seguir el protocolo de aislamiento de RNA total estándar y Protocolo de transcripción inversa de cDNA, completa la transcripción inversa single-strand cDNA del29.</li>
	<li>Siga el protocolo estándar de PCR en tiempo real para detectar el nivel de expresión de mRNA en células receptores29. Uso de iniciadores específicos de PCR en tiempo real contra el TNF-α, IL-6 y ZO-1. Reacciones de PCR con el aparato PCR cuantitativo y normalizar los valores de expresión para el control interno GAPDH. Nota: Cada grupo está formado por las muestras por triplicado.</li>
</ol>

<ol><li>Rubenfeld, G. D., Herridge, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+outcomes+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and outcomes of acute lung injury.</a> Chest. 131, 554-562 (2007).</li>
<li>Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+manipulated+mouse+models+of+lung+disease%3A+potential+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L485-L497 (2012).</li>
<li>Han, S., Mallampalli, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+respiratory+distress+syndrome%3A+from+mechanism+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">The acute respiratory distress syndrome: from mechanism to translation.</a> Journal of immunology. , Baltimore, Md. 855-860 (1950).</li>
<li>Aeffner, F., Bolon, B., Davis, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Models+of+Acute+Respiratory+Distress+Syndrome%3A+A+Review+of+Analytical+Approaches%2C+Pathologic+Features%2C+and+Common+Measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+pathology%22%5BJournal%5D)">Mouse Models of Acute Respiratory Distress Syndrome: A Review of Analytical Approaches, Pathologic Features, and Common Measurements.</a> Toxicologic pathology. 43, 1074-1092 (2015).</li>
<li>Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of acute lung injury.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L379-L399 (2008).</li>
<li>Terrasini, N., Lionetti, V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28328650">Exosomes in Critical Illness.</a> Critical care medicine. , (2017).</li>
<li>Fujita, Y., Kadota, T., Araya, J., Ochiya, T., Kuwano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles%3A+New+Players+in+Lung+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles: New Players in Lung Immunity.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. , (2017).</li>
<li>Kubo, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28684288">Extracellular Vesicles in Lung Disease.</a> Chest. 153, 210-216 (2018).</li>
<li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis%2C+function+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nature reviews. Genetics. 11, 597-610 (2010).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li>
<li>Fanini, F., Fabbri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CANCER-DERIVED+EXOSOMIC+microRNAs+SHAPE+THE+IMMUNE+SYSTEM+WITHIN+THE+TUMOR+MICROENVIRONMENT%3A+STATE+OF+THE+ART%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">CANCER-DERIVED EXOSOMIC microRNAs SHAPE THE IMMUNE SYSTEM WITHIN THE TUMOR MICROENVIRONMENT: STATE OF THE ART.</a> Seminars in cell & developmental biology. , (2016).</li>
<li>Agarwal, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental%2C+Systems%2C+and+Computational+Approaches+to+Understanding+the+MicroRNA-Mediated+Reparative+Potential+of+Cardiac+Progenitor+Cell-Derived+Exosomes+From+Pediatric+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Experimental, Systems, and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients.</a> Circulation research. 120, 701-712 (2017).</li>
<li>Prattichizzo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+microRNAs+and+endothelial+hyperglycaemic+memory%3A+a+therapeutic+opportunity%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2C+obesity+%26+metabolism%22%5BJournal%5D)">Extracellular microRNAs and endothelial hyperglycaemic memory: a therapeutic opportunity?</a> Diabetes, obesity & metabolism. 18, 855-867 (2016).</li>
<li>Huang-Doran, I., Zhang, C. Y., Vidal-Puig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles%3A+Novel+Mediators+of+Cell+Communication+In+Metabolic+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+endocrinology+and+metabolism%3A+TEM%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles: Novel Mediators of Cell Communication In Metabolic Disease.</a> Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 28, 3-18 (2017).</li>
<li>Khalyfa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Plasma+Extracellular+Microvesicle+MicroRNA+Cargo+and+Endothelial+Dysfunction+in+Children+with+Obstructive+Sleep+Apnea%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+and+critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Circulating Plasma Extracellular Microvesicle MicroRNA Cargo and Endothelial Dysfunction in Children with Obstructive Sleep Apnea.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 194, 1116-1126 (2016).</li>
<li>Thomou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+circulating+miRNAs+regulate+gene+expression+in+other+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived circulating miRNAs regulate gene expression in other tissues.</a> Nature. 542, 450-455 (2017).</li>
<li>Gregson, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Exosomal+RNA+Profiles+in+Bronchoalveolar+Lavage+from+Lung+Transplants+with+Acute+Rejection%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+and+critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Altered Exosomal RNA Profiles in Bronchoalveolar Lavage from Lung Transplants with Acute Rejection.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 192, 1490-1503 (2015).</li>
<li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nature cell biology. 9, 654-659 (2007).</li>
<li>Doxaki, C., Kampranis, S. C., Eliopoulos, A. G., Spilianakis, C., Tsatsanis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+Regulation+of+miR-155+and+miR-146a+Genes+during+Induction+of+Endotoxin+Tolerance+in+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Coordinated Regulation of miR-155 and miR-146a Genes during Induction of Endotoxin Tolerance in Macrophages.</a> Journal of immunology. , Baltimore, Md. 5750-5761 (2015).</li>
<li>Schulte, L. N., Westermann, A. J., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+activation+and+functional+specialization+of+miR-146+and+miR-155+in+innate+immune+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Differential activation and functional specialization of miR-146 and miR-155 in innate immune sensing.</a> Nucleic acids research. 41, 542-553 (2013).</li>
<li>Alexander, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-delivered+microRNAs+modulate+the+inflammatory+response+to+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Exosome-delivered microRNAs modulate the inflammatory response to endotoxin.</a> Nature communications. 6, 7321(2015).</li>
<li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-1+is+induced+in+tumor+associated+macrophages+by+cyclo-oxygenase+pathway+in+human+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">TREM-1 is induced in tumor associated macrophages by cyclo-oxygenase pathway in human non-small cell lung cancer.</a> PloS one. 9, e94241(2014).</li>
<li>Xu, R., Richards, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+In+Vitro+Co-Culture+Model+in+Anti-Cancer+Drug+Development+Cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+chemistry+%26+high+throughput+screening%22%5BJournal%5D)">Development of In Vitro Co-Culture Model in Anti-Cancer Drug Development Cascade.</a> Combinatorial chemistry & high throughput screening. 20, 451-457 (2017).</li>
<li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-1-accentuated+lung+injury+via+miR-155+is+inhibited+by+LP17+nanomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">TREM-1-accentuated lung injury via miR-155 is inhibited by LP17 nanomedicine.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L426-L438 (2016).</li>
<li>Sadikot, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dose+dexamethasone+accentuates+nuclear+factor-kappa+b+activation+in+endotoxin-treated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+and+critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">High-dose dexamethasone accentuates nuclear factor-kappa b activation in endotoxin-treated mice.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 164, 873-878 (2001).</li>
<li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+mediated+epigenetic+modulation+inhibits+TREM-1+expression+in+response+to+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Curcumin mediated epigenetic modulation inhibits TREM-1 expression in response to lipopolysaccharide.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 2032-2043 (2012).</li>
<li>Chauret, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorine+dioxide+inactivation+of+Cryptosporidium+parvum+oocysts+and+bacterial+spore+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Chlorine dioxide inactivation of Cryptosporidium parvum oocysts and bacterial spore indicators.</a> Applied and environmental microbiology. 67, 2993-3001 (2001).</li>
<li>Cizmar, P., Yuana, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+Characterization+of+Extracellular+Vesicles+by+Transmission+and+Cryo-Transmission+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Detection and Characterization of Extracellular Vesicles by Transmission and Cryo-Transmission Electron Microscopy.</a> Methods in molecular biology. , Clifton, N.J. 221-232 (2017).</li>
<li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-related+proteins+prolong+macrophage+survival+through+induction+of+Triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-1%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">HIV-related proteins prolong macrophage survival through induction of Triggering receptor expressed on myeloid cells-1.</a> Scientific reports. 7, 42028(2017).</li>
<li>Jackson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Mitochondrial+Transfer+in+Direct+Co-cultures+of+Human+Monocyte-derived+Macrophages+%28MDM%29+and+Mesenchymal+Stem+Cells+%28MSC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Mitochondrial Transfer in Direct Co-cultures of Human Monocyte-derived Macrophages (MDM) and Mesenchymal Stem Cells (MSC).</a> Bio-protocol. 7, (2017).</li>
<li>Fujita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles%3A+New+Players+in+Lung+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles: New Players in Lung Immunity.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. 17, 474-484 (2017).</li>
<li>Gunasekaran, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-Derived+Exosomes+With+Lung+Self-Antigens+in+Human+Lung+Allograft+Rejection%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+transplantation+%3A+official+journal+of+the+American+Society+of+Transplantation+and+the+American+Society+of+Transplant+Surgeons%22%5BJournal%5D)">Donor-Derived Exosomes With Lung Self-Antigens in Human Lung Allograft Rejection.</a> American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 17, 474-484 (2017).</li>
<li>Kalra, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+evaluation+of+plasma+exosome+isolation+techniques+and+assessment+of+the+stability+of+exosomes+in+normal+human+blood+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics evaluation of plasma exosome isolation techniques and assessment of the stability of exosomes in normal human blood plasma.</a> Proteomics. 13, 3354-3364 (2013).</li>
<li>Baranyai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Exosomes+from+Blood+Plasma%3A+Qualitative+and+Quantitative+Comparison+of+Ultracentrifugation+and+Size+Exclusion+Chromatography+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods.</a> PloS one. 10, e0145686(2015).</li>
<li>Nordin, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafiltration+with+size-exclusion+liquid+chromatography+for+high+yield+isolation+of+extracellular+vesicles+preserving+intact+biophysical+and+functional+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%3A+nanotechnology%2C+biology%2C+and+medicine%22%5BJournal%5D)">Ultrafiltration with size-exclusion liquid chromatography for high yield isolation of extracellular vesicles preserving intact biophysical and functional properties.</a> Nanomedicine : nanotechnology, biology, and medicine. 11, 879-883 (2015).</li>
</ol>

Este trabajo fue apoyado por VA mérito revisión 2I01BX001786-06A1 financiación a RS.

Modelos murinos de enfermedades se utilizan comúnmente para evaluar la función fisiológica de genes específicos y reducir el costo de experimentación2. La lesión pulmonar aguda séptica descrita aquí imita la respuesta inflamatoria en los seres humanos con SDRA. Este modelo es pertinente para investigar la patogenesia molecular, desarrollo de biomarcadores y para probar terapias de nuevo potencial5.
Sistemas de co-cultivo son relevantes para los e...

LPA y el SDRA es las formas mortales de la insuficiencia respiratoria con hipoxemia severa causada por edema pulmonar no cardiogénico que afecta aproximadamente de 1 millón personas anualmente1. La etiología del SDRA incluye una lesión directa a los pulmones de las infecciones o aspiración y una variedad de insultos indirectos. En la última década ha habido una mayor comprensión de la patogenia molecular del SDRA, sin embargo, tratamientos específicos específicos para ARDS todavía ser desarrollado2,3.
Se han desarrollado varios modelos animales de lesión pulmonar aguda que proporcionan un puente para la traducción de terapias experimentales para los estudios en humanos4,5. Modelos comúnmente usados incluyen la instalación local de ácido oleico, bacterias, LPS y bleomicina. Otros métodos incluyen isquemia-reperfusión, punción cecal ligadura, lesión de estiramiento inducido por la ventilación mecánica, hiperoxia o la administración sistémica de bacterias y LPS5. Estos modelos proporcionan un sistema biológico útil para probar las hipótesis clínicas y para el desarrollo de terapias potenciales. Para simular el SDRA humano, modelos animales deben reproducir la inflamación y la lesión aguda a las células epiteliales y endoteliales con defectos en la función de barrera en los pulmones.
Exosomas son vesículas de membrana con 20 y 200 nm de diámetro, cuyo contenido molecular contiene proteínas, ADN, ARN y lípidos, y facilitan la comunicación inter celular en el microambiente del tejido mediante transferencia de composición molecular. Exosomas son secretadas por varios tipos de células, como células endoteliales, células epiteliales, las células musculares lisas y células del tumor y existen en el líquido de cuerpo humano. Estudios indican que los exosomas regulan entre las células inmunes y células del estroma durante enfermedades inflamatorias infecciosas y estériles, y su liberación anormal parece ser regulada por diversos estímulos naturales y experimentales durante fisiológico y procesos patológicos6. Dicha red de comunicación puede jugar un papel importante en la patogenesia de enfermedades pulmonares y puede afectar la progresión fisiopatológica7,8. 18-22 como nucleotide RNAs no codificantes, los miRNAs existen en tejidos y líquidos corporales, plasma, sueros y modulan la expresión del mRNA a poste-de translación nivel9,10.
Envasados miRNAs en exosomas influyen en la diferenciación y función de múltiples tipos de células, y niveles excesivos están asociados con una variedad de enfermedades, incluyendo cáncer, enfermedades pulmonares, obesidad, diabetes y enfermedad cardiovascular11, 12,13,14,15,16. Entrada en las células del receptoras y realizar trayectos de miRNAs de exosomal facilitar la comunicación intercelular modificando la hemostasia del microambiente17,18. Lesión pulmonar aguda es un procesos complejos, que involucran a múltiples tipos de células con extensas comunicaciones intercelulares a través de exosomas8. miR-155 y miR-146a comparten el mecanismo de regulación transcripcional común y contribuyan a la respuesta inflamatoria y la tolerancia inmunológica19,20. Estudios recientes indican que ambos modulan la respuesta inflamatoria mediante exosomal miRNAs realizar la transición entre las células inmunes21. Sin embargo, todavía no están claros los mecanismos moleculares subyacentes a efectos moduladores de miRNAs exosomal alveolar respuesta a endotoxinas, sin lugar a dudas el potencial relevancia clínica y traslacional implicación mérito más investigación.
Modelos de cocultivo se están empleando para definir la interacción de los tipos de células específicas en el entorno complejo, como inflamación y cáncer22,23. Estas plataformas proporcionan una estrategia alternativa para interrogar entre tipos celulares especialmente para las células inmunes y estructurales.
Intra-traqueal, administración aerosolizada, intraperitoneal o sistémica de LPS son ampliamente utilizados para inducir lesiones de pulmón experimental24,25,26y han demostrado para inducir la permeabilidad endotelial y epitelial defectos. Aquí utilizamos LPS intraperitoneales para inducir un modelo séptico de lesión pulmonar aguda en ratones. Dentro de las 24 h de la administración intraperitoneal de LPS, defectos de la permeabilidad son inducidos en los pulmones con el reclutamiento de células inflamatorias. Además, demostramos que los exosomas de BAL contienen miRNA-155 y miR-146a, y exosomas de líquido del BAL inducen la expresión de citoquinas proinflamatorias en células epiteliales receptores, incluyendo IL-6 y TNF-α. Estos datos son los primeros en Mostrar exosomal miRNAs son secretadas en BAL en este modelo de lesión pulmonar aguda séptica.

<table><tbody><tr><td>lipopolisacárido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Escherichia coli 055:B5</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH7.2(1X)</td><td>Life technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>kit de aislamiento de miARN mirVana</td><td>Thermo Fisher</td><td>449774</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>mmu-miR-155 (002571) imprimación</td><td>Thermo Fisher 4427975</td><td></td><td></td></tr><tr><td>has-miR-146a (000468) cebador Thermo</td><td>Fisher</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>U6snRNA cebador</td><td>Thermo Fisher</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha;( Mm00443258_m1 ) imprimación</td><td>Thermo Fisher</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 (Mm00446190_m1&nbsp; &nbsp; )imprimación</td><td>Thermo Fisher</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 (Mm00493699_m1&nbsp; )imprimación</td><td>Thermo Fisher</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>medio esencial mínimo (MEM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11095-072</td><td></td></tr><tr><td>Solución de trysin-EDTA (0,05%)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>exosomas se marcaron con PKH67 a PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit&nbsp;</td>Columnas de centrifugación de exosomas <td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>(MW3000)</td><td>Ultracentrífuga Thermo Fisher</td><td>4484449</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Optima L-100XP&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>L-100XP</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga ultratransparentes</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems 7500 Sistema de PCR rápido en tiempo real</td><td>Microscopios</td> electrónicos de transmisión Thermo Fisher <td></td><td></td></tr><tr><td>(TEM)</td><td>JEOL Ltd</td><td>120 kV TEM</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Olympus BX41</td><td>Olympus</td><td>BX41</td><td></td></tr></tbody></table>

lavado broncoalveolar exosomas en lesión pulmonar séptica inducida por lipopolisacárido

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

Lesión pulmonar aguda (ALI) y síndrome de dificultad respiratoria agudo (ARDS) representan un grupo heterogéneo de enfermedades pulmonares que sigue teniendo una alta morbilidad y mortalidad. La patogenia molecular de ALI está mejor definido; sin embargo, debido a la compleja naturaleza de la enfermedad terapias moleculares han desarrollado. Aquí utilizamos un modelo del ratón inducida por lipopolisacárido (LPS) de la lesión pulmonar aguda séptica para delinear el papel de los exosomas en la respuesta inflamatoria. Usando este modelo, hemos podido demostrar que ratones expuestos a LPS intraperitoneales secretan exosomas en el líquido del lavado (BAL) Bronco-alveolar de los pulmones que se empaquetan con miRNA y citoquinas que regulan la respuesta inflamatoria. Además utiliza un sistema de modelo de co-cultivo, mostramos que exosomas liberados de los macrófagos alteran la expresión de proteínas de Unión estrecha en células epiteliales bronquiales. Estos resultados sugieren que 1) diafonía entre células inmunes y estructurales innatas a través de la exosomal realizar trayectos contribuyen a la respuesta inflamatoria y alteración de la barrera estructural y 2) dirigidos a estos miRNAs puede proporcionar una nueva plataforma para tratar ALI y SDRA.

Para inducir lesión pulmonar séptico, los ratones fueron tratados con LPS intraperitoneales (15 mg/kg). Dentro de las 24 h de la administración de LPS, neutrophilic afluencia fue visto en los pulmones, como se muestra en la figura 1A. Líquido del BAL de ratón fue dibujado, seguido por el aislamiento y purificación de exosomas. Morfología de exosomas BALF fue confirmado por microscopia electrónica de transmisión (figura 1B).
<...

Ratones expuestos a LPS intraperitoneales secretan exosomas en el líquido del lavado (BAL) Bronco-alveolar que se empaquetan con miRNAs. Utiliza un sistema de cocultivo, demostramos que los exosomas liberados en el líquido del BAL interrumpen la expresión de proteínas de Unión estrecha en células epiteliales bronquiales y aumentan la expresión de citoquinas pro-inflamatorias que acentúan la lesión pulmonar.

Lavado broncoalveolar exosomas en lesión pulmonar séptica inducida por lipopolisacárido

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

El objetivo general de este experimento es delinear el papel de los exosomas en las respuestas inflamatorias en un modelo de ratón con lesión pulmonar séptica aguda inducida por LPS. Por lo tanto, este método puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con la diafonía celular en la lesión pulmonar aguda y el síndrome de dificultad respiratoria aguda. Especialmente la comunicación intercelular dentro del entorno alveolar-micro a través del transporte de exosomas.La principal ventaja de esta técnica es que permite el aislamiento y caracterización de exosomas de lavado broncoalveolar altamente purificados derivados de ratones sépticos tratados con endotoxinas con lesión pulmonar aguda. Demostrando el procedimiento están el Dr. Zhihong Yuan y la Dra. Chetna Bedi. Para comenzar, cargue una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 27 con 0,1 mililitros de LPS y PBS por ratón y sujete manualmente el primer ratón macho C57 negro 6J de seis a ocho semanas de edad.Administre el LPS por vía intraperitoneal y devuelva al animal a su jaula. 24 horas después, haga una incisión de cinco milímetros en el centro del cuello del primer animal y use pinzas romas para separar suavemente los músculos y exponer la tráquea. A continuación, inserte suavemente una aguja de calibre 27 conectada a una jeringa estéril de 10 mililitros en la tráquea e inyecte un mililitro de PBS estéril.Luego, reemplace inmediatamente la jeringa de 10 mililitros por una jeringa de tres mililitros equipada con una nueva aguja de calibre 27. Aspire el líquido de lavado broncoalveolar o BOLF y agregue el BOLF a un tubo cónico de 15 mililitros debidamente marcado sobre hielo. Para aislar los exosomas, centrifugar las muestras de BOLF y transferir los sobrenadantes a nuevos tubos de 15 mililitros.Vuelva a centrifugar las muestras y transfiera los sobrenadantes a tubos ultracentrífugos para eliminar las partículas celulares más grandes. Transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos cónicos y cargue las muestras en filtros de jeringa de 0,2 micras para eliminar las partículas más grandes restantes. Añada las muestras filtradas a los nuevos tubos de ultracentrífuga para granular los exosomas.Deseche con cuidado los sobrenadantes y vuelva a suspender los gránulos en 100 microlitros de PBS por tubo. A continuación, transfiera las muestras de exosomas a tubos individuales de 1,5 mililitros para su almacenamiento a menos 80 grados Celsius. Para purificar los exosomas, agregue 0,4 microlitros del colorante de exosomas apropiado a un tubo que contenga 100 microlitros de solución de suspensión por muestra y agregue rápidamente una muestra de exosoma descongelada a cada tubo de tinte.Mezclar bien los exosomas con el colorante e incubar las muestras a temperatura ambiente durante cinco minutos, protegidas de la luz. Al final de la incubación, coloque una columna de espín de exosomas por muestra en un tubo de ilusión de 1,5 mililitros y transfiera las soluciones de exosomas al centro de cada columna de espín. A continuación, centrifugar las muestras, desechar las columnas y almacenar las muestras aludidas a menos 20 grados centígrados.Para medir la absorción de exosomas por parte de las células receptoras, primero siembra una vez 10 al cuarto pulmón de ratón epitelial 12 células en 0,5 mililitros de medio en cada pocillo de un portaobjetos de cámara de ocho pocillos para un cultivo de 16 horas a 37 grados Celsius en dióxido de carbono al 5%. Después de descongelar, agregue 10 microlitros de los exosomas marcados con fluorescencia purificada a cada pocillo y devuelva los cultivos celulares a la incubadora durante una hora. Al final de la incubación, lavar las células con PBS y fijar cada cocultivo con paraformaldehído al 1% durante 10 minutos a temperatura ambiente.Retire el medio y luego monte el portaobjetos con medio complementado con DAPI y obtenga imágenes de las muestras mediante microscopía de fluorescencia con un aumento de 40 veces. Para verificar la interacción del exosoma con las células receptoras, siembre dos veces 10 al quinto pulmón de ratón con 12 células en dos mililitros de medio por pocillo en una placa de cultivo de 12 pocillos que contenía el medio de cultivo apropiado para una incubación de dos horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al final de la incubación, agregue 20 microgramos de exosomas a tres pocillos de células epiteliales por grupo experimental y devuelva las células a la incubadora.Después de 24 horas, retire el medio, lave las células con PBS y agregue 600 microlitros de tampón de lisis a cada pocillo agitando suavemente. A continuación, transfiera todo el contenido de cada pocillo a tubos individuales de 1,5 mililitros y analice las muestras de acuerdo con los protocolos estándar de PCR en tiempo real. Dentro de las 24 horas posteriores a la administración de LPS, se observa una afluencia neutrofílica en los pulmones de los animales tratados con LPS.Después de su aislamiento y purificación, como se acaba de demostrar, la presencia de exosomas en el BOLF de animales con lesión pulmonar séptica puede confirmarse mediante microscopía electrónica de transmisión. La expresión de micro ARN proinflamatorio seleccionado aumenta significativamente en los exosomas del líquido broncoalveolar de los animales tratados con LPS en comparación con los ratones tratados con PBS controlados. Los exosomas tratados con LPS son absorbidos por las células epiteliales bronquiolas de ratón, como lo demuestra la colocalización de exosomas marcados con colorante fluorescente con células marcadas con DAPI después de una hora de cocultivo.La expresión de mediadores proinflamatorios aumenta significativamente en las células epiteliales cocultivadas con exosomas de animales tratados con LPS en comparación con el cocultivo con exosomas de ratones control tratados con PBS. Además, las células tratadas con exosomas de ratones tratados con LPS demuestran una expresión significativamente atenuada de zonula occludens en comparación con los controles, lo que indica una integridad celular menos intacta después del cocultivo de exosomas tratado con LPS. La inyección intraperitoneal de LPS, la extracción del lavado broncoalveolar y la delegación de exosomas del lavado broncoalveolar, todos los pasos, se pueden completar en un período de tiempo relativamente corto.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el cocultivo de exosomas y células epiteliales, para responder a preguntas adicionales sobre la comunicación cruzada entre las células innatas y estructurales en el microambiente alveolar pulmonar. La comunicación cruzada entre las células inmunitarias innatas y estructurales a través del transporte de exosomas contribuye a la respuesta inflamatoria y a la ruptura de la barrera estructural, lo que sugiere que la focalización de microARN exosomal puede proporcionar una plataforma normal para el tratamiento de la lesión pulmonar aguda y el síndrome de dificultad respiratoria aguda. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir una lesión pulmonar séptica en ratones, aislar el líquido de lavado broncoalveolar de ratones, aislar los exosomas del líquido de lavado y usar un modelo de cocultivo para interrogar la diafonía intracelular.No olvide que trabajar con LPS puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como usar el equipo de protección personal adecuado, al realizar este procedimiento.

bronchoalveolar-lavage-exosomes-lipopolysaccharide-induced-septic

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Source: Yuan, Z., et al. Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates an in vivo mouse model for inducing and analyzing acute lung injury (ALI) using intraperitoneal administration of bacterial lipopolysaccharide. The inflammatory cascade triggered by alveolar macrophages and neutrophils leads to epithelial and endothelial barrier disruption, allowing fluid and immune cells to accumulate in the alveoli. Alveolar...

Lipopolysaccharide-Induced Acute Lung Injury in Mice for Exosome and Immune Analysis

La respuesta inmune del huésped a la infección por patógenos es un proceso estrechamente regulado. Utilizando un modelo de exposición de pulmón lipopolisacárido en los ratones, es posible llevar a cabo las evaluaciones de alta resolución de los complejos mecanismos asociados con la patogénesis de la enfermedad.

La utilización de la orofaringe Intratraqueal PAMP Administración y lavado broncoalveolar para evaluar el anfitrión respuesta inmune en ratones

Se describe un método para inducir la inflamación pulmonar neutrofílica por desafío para el lipopolisacárido de aerosol por nebulización, para modelar la lesión pulmonar aguda. Además, también se describen técnicas quirúrgicas básicas para la separación de pulmón, la intubación traqueal y lavado broncoalveolar.

Un método para generar pulmonar Neutrofilia Usando aerosol lipopolisacárido

Los lavados pulmonares repetidas en cerdos anestesiados inducen lesión pulmonar se asemeja a los principales aspectos del síndrome de dificultad respiratoria aguda humana (SDRA). Para ello, los pulmones se lavan repetidamente con 0,9% de solución salina a 37 ° C. El objetivo del protocolo es una mitigación reproducible de intercambio de gases y la hemodinámica para la investigación en el SDRA.

Lavado inducida por agotamiento de surfactante en los cerdos como modelo del síndrome de distrés respiratorio agudo (SDRA)

El estado de salud de los pulmones se refleja por el tipo y número de células inmunitarias que están presentes en los bronquiolos del pulmón. Se describe una técnica de lavado broncoalveolar que permite el aislamiento y estudio de las células no adherentes y factores solubles en el tracto respiratorio inferior de los ratones.

Lavado broncoalveolar de los pulmones murinos para analizar infiltración de células inflamatorias

Aquí, describimos a dos protocolos de aislamiento de vesículas extracelulares, ultrafiltración centrifugación y ultracentrifugación con centrifugación gradiente de densidad, para aislar las vesículas extracelulares de muestras de líquidos de lavado broncoalveolar murino. Las vesículas extracelulares derivadas del líquido de lavado broncoalveolar murino por ambos métodos se cuantifica y caracteriza.

Aislamiento de las vesículas extracelulares del líquido de lavado broncoalveolar murino utilizando una técnica de centrifugación ultrafiltración

Aquí se presenta un procedimiento paso a paso para inducir una lesión pulmonar aguda en ratones por instilación directa de lipopolisacáridos intratraqueales y para realizar análisis FACS de muestras de sangre, líquido de lavado broncoalveolar y tejido pulmonar. La mínima invasividad, el manejo simple, la buena reproducibilidad y la valoración de la gravedad de la enfermedad son ventajas de este enfoque.

Inducir lesión pulmonar aguda en ratones por instilación directa de lipopolisacárido intratraal

Los ratones expuestos al ozono combinado y a las endotoxinas bacterianas muestran una muerte celular muy extendida, incluida la de los neutrófilos. Observamos adaptaciones celulares tales como interrupción del lamellipodia citoesquelético, expresión celular creciente de la subunidad compleja del synthase del ATP de V β y angiostatin en lavado bronco-alveolar, supresión de la inmunorespuesta del pulmón y reclutamiento retrasado del neutrófilo.

Visualización De Las Adaptaciones Celulares Pulmonares Durante La Lesión Pulmonar Aguda Murina Inducida Por Ozono Combinado Y LPS

En este estudio, se ha demostrado que una técnica no invasiva de instillación endotraqueal desarrolla AL en ratas utilizando un laringoscopio básico para asegurar una entrega precisa de LPS a los pulmones. El LPS se administra mediante un tubo endotraqueal mediante un laringoscopio. La magnitud de la lesión pulmonar se evalúa en varios momentos.

Administración endotraqueal no invasiva de lipopolisacáridos para inducir daño pulmonar agudo en roedores

Este protocolo describe un método para la transfección eficiente siRNA en recién aisladas citotrofoblastos vellosos humanos usando formación de microporos y la identificación de complejos de ADN-proteína en estas células. Las células transfectadas pueden ser monitoreados por Western blot y análisis EMSA durante el tiempo de cultivo de 4 días.

Los análisis de siRNA transfección y EMSA en recién aisladas vellosos citotrofoblastos Humanos

Aprende a aislar exosomas de lavado broncoalveolar en ratones con lesión pulmonar aguda inducida por LPS. Este método permite estudiar la comunicación intercelular y el papel de los exosomas en la inflamación pulmonar.

Lavado broncoalveolar exosomas en lesión pulmonar séptica inducida por lipopolisacárido

Explorar más videos