Name: Fraccionamiento subcelular de especímenes gastrointestinales frescos y congelados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Aprende a fraccionar proteínas citoplasmáticas y nucleares de biopsias intestinales frescas o congeladas. Este protocolo permite analizar la localización de proteínas en muestras gastrointestinales humanas.

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Los autores reconocen la asistencia de Ander Lopez y Miren Telletxea para video grabación y edición. ACR es financiado por una beca de Ikerbasque y un proyecto de investigación de Asociación de Celiacos de Madrid (ACM). OCR es financiado por el proyecto ISCIII-PI16/00258 y cofinanciado por el Unión Europea FEDER/FSE "Una manera de hacer Europa". ES financiado por una subvención de proyecto de investigación 2015111068 del Departamento vasco de sanidad. IRG y AJM son apoyados por becas de beca predoctoral de la UPV/EHU y el Departamento vasco de educación, respectivamente.

Este estudio fue aprobado por el Consejo de ética de Hospital de Universitario de Cruces y los análisis se realizaron después de que se obtuvo consentimiento informado de todos los sujetos o a sus padres.
1. biopsia de la colección
Nota: Especímenes de la biopsia de duodeno distal de pacientes se obtienen durante la endoscopia de diagnóstico rutinaria gestión de biopsias que varían entre 2 y 10 mg de peso. Tejido hecho una biopsia es un tejido complejo compuesto por diversos tipos celulares incluyendo células epiteliales, inmunes y endoteliales. Gastroenterólogos clínicos realizan la endoscopia siguiente establecido guías de práctica clínicas.
<ol><li>Colocar la biopsia en un papel de filtro estéril justo después de la endoscopia.</li>
	<li>Utilice pinzas para transferir las biopsias en tubos de 1,5 mL, remójelos con PBS y colóquelo en un criotubo.</li>
	<li>Mantener los tubos en hielo hasta que llegan al laboratorio.<ol>
<li>Iniciar proceso de biopsias frescas inmediatamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De biopsias congeladas, flash congelación de la biopsia que contienen tubos y almacenar en nitrógeno líquido hasta su utilización. Nota: Es importante mantener la muestra congelada hasta que se añade el buffer suplementado frío 1.</li>
</ol>2. preparación de buffer
Nota: Antes de iniciar, complementar los buffers como sigue.
<ol><li>Añadir 1 mM TDT (concentración final) y proteasa y fosfatasa inhibidor de cóctel (1 x concentración final) en el búfer hipotónico hipertónico y 1 Tampón 2 (tabla 1).<ol>
<li>Preparar 1,5 mL de tampón 1 y 150 μL de tampón 2 por muestra. TDT previene la oxidación de las muestras.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar el tampón de lavado núcleos mediante la adición de detergente al 1% (nonil phenoxypolyethoxylethanol) a una concentración final de 0.1% en el búfer ya completado 1. Preparar 1 mL de tampón de lavado núcleos por muestra.</li>
</ol>3. biopsia de la homogeneización
<ol><li>
Biopsias frescas
	<ol>
<li>Coloque el mortero descartable en el mezclador motorizado. Garantizar que el mortero llegue a la parte inferior del tubo.</li>
		<li>Sacar la biopsia desde el criotubo y colóquelo en un tubo de 1,5 mL con una pipeta.</li>
		<li>Añadir 200 μL de buffer suplementado 1 al tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Homogeneizar la biopsia con la mano del mortero hasta que el tejido es totalmente trastornado y mantenerlo en hielo.</li>
		<li>Una vez que todas las biopsias son homogeneizadas continúe con el paso 4. Nota: Disponibles Pisones deben cambiarse entre las biopsias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Biopsias congeladas PRECAUCIÓN: Manipule nitrógeno líquido cuidadosamente; contacto del nitrógeno líquido con la piel o los ojos puede causar daños de congelación. Proteger las manos y los ojos siempre con nitrógeno líquido.<ol>
<li>Tomar algunos nitrógeno líquido en una caja para almacenar criotubos obtenido desde el tanque de nitrógeno.</li>
		<li>Encontrar la biopsia en el tanque de nitrógeno y el criotubo en la caja con el nitrógeno líquido. Repita este paso para todas las biopsias.</li>
		<li>Transferencia de la biopsia de la criotubo a un tubo de 1,5 mL. Nota: Las biopsias se unirá al tubo de congelados. Empuje la biopsia con una pipeta estéril para que se desprenda del tubo.</li>
		<li>Añadir 200 μL de buffer suplementado 1.</li>
		<li>Homogeneizar el tejido con la maja y el mortero hasta que el tejido se interrumpe totalmente, manteniendo la temperatura a 4 ° C a lo largo de todo el procedimiento. Nota: No deje que las biopsias descongelar antes de agregar el buffer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. citoplasma aislamiento
<ol><li>Incubar la biopsia homogeneizada en hielo durante 10 minutos.</li>
	<li>Añadir 10 μl de detergente al 1% (nonil phenoxypolyethoxylethanol) a cada muestra a una concentración final de 0.05%. Nota: Las células se hinchan y estallan por lisis osmótica como el detergente, se interrumpirán la membrana celular.</li>
	<li>Incubar en hielo durante 5 minutos.</li>
	<li>Mezclar brevemente y centrifugar a 400 x g a 4 ° c por 2 min.</li>
	<li>Después de Vortex, quite el sobrenadante y transferir a un tubo limpio de 1.5 mL nuevo; se trata de la fracción citoplasmática. Deseche los pellets.</li>
</ol>5. nuclear aislamiento
<ol><li>Resuspender el precipitado del paso anterior con 200 μL de tampón de lavado de núcleos.</li>
	<li>Centrifugar el tubo durante 2 min a 400 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y repetir el lavado dos veces más. Nota: El lavado eliminará contaminación citoplásmica en la fracción nuclear.</li>
	<li>Después del tercer lavado, Resuspender el precipitado en 100 μl de buffer 2.</li>
	<li>Agitar la muestra vigorosamente a 4 ° c durante 30 minutos o bien, incubar la muestra en hielo y agitar cada 5 min.</li>
	<li>Después de agitar, centrifugar la muestra 10 min a velocidad máxima (> 12.000 x g) y 4 ° C.</li>
	<li>Después de Vortex, transferir el sobrenadante a un nuevo 1.5 limpio. tubo mL. Se trata de la fracción nuclear.</li>
</ol>6. cuantificación de proteínas
Nota: Cuantificar las proteínas bicinchoninic ácido (BCA) proteína análisis kit. La concentración de proteínas en las fracciones que van entre 0.5 y 5 μg/μl, siendo menor en la fracción nuclear (ver tabla 2 para las concentraciones de la proteína resultantes de las biopsias de 2 mg).
<ol><li>Preparar una curva estándar con los siguientes albúmina de suero bovino (BSA) cantidad (μg)12: 0-0.5-1-2-3-4-5-6.</li>
	<li>Preparar los reactivos necesarios para utilizar 100 μl de la mezcla final de BCA por muestra.</li>
	<li>Pipetear 2 μl de cada fracción de proteína en un plato bien 96, añadir la mezcla BCA y siga las instrucciones del fabricante para la lectura.</li>
</ol>

<ol><li>Cox, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+subcellular+fractionation+and+protein+extraction+for+use+in+mass-spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).</li>
<li>Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+quantitative+and+dynamic+mapping+of+protein+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPreedy%2C+VR+%22Methods+in+disease+investigating+the+gastrointestinal+tract%22">Methods in disease investigating the gastrointestinal tract</a>. , Greenwich Medical Media. (1998).</li>
<li>Alex, P., Gucek, M., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+proteomics+in+the+study+of+inflammatory+bowel+diseases%3A+Current+status+and+future+directions+with+available+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+bowel+diseases%22%5BJournal%5D)">Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies.</a> Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).</li>
<li>Ericsson, C., Franzén, B., Nistér, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+tissue+biobanks.+Tissue+handling%2C+cryopreservation%2C+extraction%2C+and+use+for+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+oncologica+%28Stockholm%2C+Sweden%29%22%5BJournal%5D)">Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis.</a> Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).</li>
<li>Hoffmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+application+of+a+subcellular+fractionation+method+to+kidney+and+testis+for+the+determination+of+conjugated+linoleic+acid+in+selected+cell+organelles+of+healthy+and+cancerous+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).</li>
<li>Foster, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mammalian+Organelle+Map+by+Protein+Correlation+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling.</a> Cell. 125 (1), 187-199 (2006).</li>
<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li>
<li>Börner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+protein+extraction+from+human+pancreatic+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).</li>
<li>Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+disease%3A+protease+functions+in+intestinal+mucosal+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+clinical+practice.+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology.</a> Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).</li>
<li>Cutler, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCutler%2C+P+%22Protein+purification+protocols%22">Protein purification protocols</a>. , Humana Press. (2004).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bicinchoninic+Acid+%28BCA%29+Assay+for+Protein+Quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Protein+Protocols+Handbook%22%5BJournal%5D)">The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).</li>
<li>McLane, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+localization+of+T-bet+and+Eomes+in+CD8+T+cell+memory+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology+%28Baltimore%2C+Md.%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).</li>
<li>Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRM1+nuclear+export+protein+in+normal+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+biochemistry+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease.</a> International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo aquí descrito se utiliza para el fraccionamiento citoplasmático y nuclear de las biopsias intestinales. Las proteínas purificadas no son desnaturalizadas y puede ser utilizadas no sólo en el análisis de western blot como se muestra en la figura 2 y 3 y también en ensayos que requieren proteínas doblado nativo como inmunoprecipitación, análisis de cambio de movilidad electroforética (EMSA) o electroforesis en gel de poliacrilamida nativo (página).
<p class="j...

Las proteínas participan en casi todas las funciones biológicas dentro de una célula y cualquier variación en su estructura, la cantidad o la ubicación puede conducir a un escenario de patógeno. Métodos de fraccionamiento de muestras de tejido son un método útil para reducir la complejidad de la enfermedad relacionados con el análisis de la proteína. Algunos estudios utilizan información de localización de la proteína o enriquecen una proteína de un compartimento celular específico, por lo que un protocolo reproducible fraccionamiento de proteínas intactas es útil para responder a ciertas cuestiones biológicas. Determinación de la localización subcelular de las proteínas y vigilar su redistribución compartimentación o interacciones en basal y las condiciones de la enfermedad ayudará a identificar la enfermedad relacionada con las diferencias funcionales1,2. Así, este método pretende fraccionar reproducible las biopsias de tejido intestinal, frescas y congeladas, en compartimentos subcelulares citoplásmicas y nucleares.
Las muestras de biopsia intestinal habitualmente se obtienen durante la endoscopia procedimientos3 (figura 1) y pueden ser utilizadas eficazmente para la cuantificación de la proteína o los estudios de inmunoprecipitación. Puesto que las muestras de tejido del intestinal epitelios contiene proteínas que pueden estar directamente involucradas en la patogénesis de la enfermedad4, las muestras de biopsia intestinal son una fuente muy valiosa para la identificación exitosa de específicos de la enfermedad intestinal proteínas. Muestras de tejido congelado, paciente almacenados junto con la información clínica son recursos útiles para el análisis de la proteína, y una preparación simple y reproducible es una cuestión clave para proporcionar información de compartimentación celular utilizando cantidades limitantes de congelados tejido5.
Hay varios kits disponibles en el mercado para la separación de fracciones celulares, pero son más caras y generalmente más lento que el protocolo presentado aquí. Protocolos basados en varios pasos centrifugación degradado y gradientes continuos también se han utilizado previamente para el fraccionamiento de los diversos compartimentos celulares en diferentes tejidos6,7. Sin embargo, mantener la consistencia de gradientes continuos suele ser una tarea difícil. Similares protocolos basados en la secuencial lisis de las membranas se han descrito anteriormente pero generalmente necesitan más de dos tampones y las manos el tiempo es más largo8 .
Fraccionamiento de muestras de tejido, tener en cuenta ese tejido muestras presentes célula-célula y célula-matriz de interacciones que son no presentes en células cultivadas e importantes cuando proceder a la extracción de proteínas. El adecuado desglose entre células y matriz extracelular sin afectar la calidad de la proteína será un factor crítico en el tejido intestinal proteínas aislamiento9. En este protocolo, contactos célula-célula y célula matriz primero se rompen, liberando las células y permitiendo que el búfer llegar a las células individuales. Para evitar la proteína-compartimiento de mezcla antes del fraccionamiento, la ruptura de los contactos debe ocurrir sin alterar la integridad de las células o las membranas nucleares.
Por el enriquecimiento de distintas proteasas en la mucosa intestinal10, es importante para el control de la degradación de la proteína durante la extracción. Para minimizar la potencial degradación de las proteínas, múltiples inhibidores de proteasa deben incluirse en los buffers de extracción de proteína. Además, si extractos van a utilizarse para el análisis funcionales, es esencial para evitar la desnaturalización de las proteínas o la proteólisis, pues esto ocasionará una pérdida de proteína actividad11. Para ello, el protocolo se lleva a cabo a 4 ° C y fresco phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF) se añade a los buffers en una concentración final de 0,1 mM justo antes de usar además inhibir la proteólisis.
El primer paso en el fraccionamiento celular es interrupción de tejido y lisis celular. Como se mencionó anteriormente, el objetivo es separar las células y les abren con mínimo daño de rotura. Las muestras de tejido intestinal deben ser homogeneizadas y lisis de las células para lograr máxima rotura de la membrana celular. En este protocolo, utilizamos una batidora de mano motorizado para romper el tejido intestinal que se homogeneiza dentro de segundos por medio de la acción de Vortex de alta velocidad. Después de la homogeneización, se incuban las células del tejido en un tampón hipotónico que estallará la membrana de la célula pero mantendrá los núcleos intactos, seguido por la adición de un detergente no desnaturalizantes (nonil phenoxypolyethoxylethanol) y un vortex corto para separar los núcleos de la fracción citoplasmática. Después de la separación del citoplasma, la membrana celular de los núcleos es irrumpió en un buffer hipertónico con agitación.
El método presentado aquí es un método adecuado para el fraccionamiento subcelular de las biopsias intestinales frescos y congelados que se han obtenido durante procedimientos endoscópicos y oscilan entre los 2 y 10 mg de peso. El protocolo es fácil y reproducible y se podría realizar utilizando equipos de laboratorio básicos y reactivos en menos de una hora.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-1kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5588886-1kg</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich 10197777001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidores de la proteinasa y la fosfatasa</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32959</td><td></td></tr><tr><td>NP-40&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CA-630</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>Ensayo BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td>Kit de cuantificación de proteínas</td></tr><tr><td>Majas de plástico desechables</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359947-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador Dounce</td><td>VWR</td><td>431-0100</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415-R</td><td></td></tr><tr><td>Shacker</td><td>IKA</td><td>MS3 basic</td><td></td></tr></tbody></table>

fraccionamiento subcelular de especímenes gastrointestinales frescos y congelados

Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

El propósito de este protocolo es fraccionar tejido intestinal humano obtenido por endoscopia en compartimentos citoplásmicos y nucleares para el análisis de localización de proteínas específicas o complejos de proteína en Estados diferentes del tejido (es decir, saludable frente a la enfermedad). Este método es útil para el fraccionamiento de ambas muestras de tejido intestinal frescos y congelados; es fácilmente accesible para todos los laboratorios y no requiere mucho tiempo.

La figura 1 muestra una hematoxilina eosina de una sección de la biopsia intestinal con las vellosidades intactas y las estructuras de la cripta.
Resultados representativos de fraccionamiento citoplasmática y nuclear mediante este protocolo se muestran en las figuras 2 y 3. En el experimento se muestra en la figura 2, un fresco (Fh) y u...

Aquí, presentamos un protocolo para realizar un fraccionamiento celular simple para la separación subcelular de proteínas citoplásmicas y nucleares en biopsias intestinales humanas frescas y congeladas.

Fraccionamiento subcelular de especímenes gastrointestinales frescos y congelados

The purpose of this protocol is to fractionate human intestinal tissue obtained by endoscopy into nuclear and cytoplasmic compartments for the ...

El objetivo del siguiente protocolo es generar fracciones subcelulares a partir de muestras gastrointestinales congeladas o frescas. Las proteínas participan en casi todas las funciones biológicas dentro de una célula. En cualquier variación que se extraigan entre un lugar puede dar lugar a un escenario patogénico.Algunos estudios aprovecharán la evaluación de la localización de proteínas o necesitarán invadir una proteína de un compartimento celular específico. Por lo tanto, el fraccionamiento reproducible de proteínas intactas es importante a este respecto. Las muestras de biopsia intestinal se pueden obtener recientemente durante los procedimientos de endoscopia y se pueden utilizar eficazmente para la cuantificación de proteínas o estudios de inmunoprecipitación.Las muestras intestinales clínicas son un recurso importante para la identificación efectiva de proteínas específicas de tejidos y enfermedades. El nombre de este método es fraccionar el tejido intestinal humano obtenido por endoscopia en compartimentos nucleares y citoplasmáticos para el análisis de localización de una proteína específica o complejos proteicos. Este método sirve para el fraccionamiento de ambos.En primer lugar, se produce nuestra biosis intestinal congelada. Para el procedimiento de tejido congelado, congele las muestras inmediatamente después de la extracción y guárdelas en nitrógeno líquido hasta su uso. Es importante mantener la muestra congelada hasta que se añada el tampón de homogeneización en frío.Para muestras frescas, transfiera la biopsia a un microtubo de 1,5 ml y manténgala en hielo hasta que se inicie el procedimiento. Las muestras de tejido congelado generalmente se adhieren a la pared del tubo criogénico, el tejido se puede liberar con una punta de pipeta estéril antes de transferirlo a un microtubo cónico de 1,5 mL. Añadir 200 mL de tampón uno suplementado con DDT e inhibidores de la fosfatasa y la proteasa al microtubo que contiene la muestra.Homogeneizar la muestra con un recipiente hasta que el tejido esté completamente alterado y mantenerlo en hielo. Incubar la muestra en hielo durante 10 minutos. Agregue 10 ml de detergente al 1 por ciento a cada muestra hasta una concentración final de 0.05 por ciento para romper la membrana celular.Incubar en hielo durante cinco minutos. Vértice brevemente y centrifugue a 400 g a 4 grados durante dos minutos. Extraer el sobrenadante que contiene la fracción de proteína citoplasmática y transferirlo a un tubo limpio.No deseche el pellet. Vuelva a suspender el pellet en 200 mL de tampón dos suplementado con DDT e inhibidores de la fosfatasa y la proteasa. Centrifugar a 400 g durante 2 minutos.Deseche el sobrenadante y repita el procedimiento de lavado dos veces más. Después del tercer lavado, vuelva a suspender el pellet en 100 mL de tampón dos. Agitar enérgicamente a 4 grados durante 30 minutos.Centrifugar a 4 grados a máxima velocidad durante 10 minutos. Transfiera el sobrenadante que contiene la fracción de proteína nuclear a un tubo limpio. Las fracciones citoplasmáticas y nucleares ya están listas para su cuantificación y experimentos posteriores.La mucosa intestinal es rica en varias proteasas y, por lo tanto, la degradación de las proteínas debe controlarse durante la extracción para minimizar la degradación de las proteínas, se deben incluir múltiples inhibidores de la proteasa en los tampones de extracción de proteínas. Además, los extractos se utilizarán para ensayos adicionales. Es fundamental evitar la desnaturalización de proteínas o la proteólisis.Ya que esto provoca una pérdida de actividad proteica. Como consecuencia de los contactos célula-célula y célula-matriz que están presentes en los tejidos, se deben implementar algunas modificaciones en los protocolos de extracción de proteínas utilizados habitualmente con los cultivos celulares. La separación de las células de la matriz transcelular sin afectar la calidad de la proteína es un factor crítico para el aislamiento eficiente de las proteínas del tejido intestinal.A la izquierda, la tabla muestra las concentraciones de proteínas de cada una de las fracciones de las muestras de biopsia frescas y congeladas de 2 mL. Las concentraciones se muestran en microgramos por microlitro. En este experimento, una muestra fresca y congelada se fraccionaron simultáneamente siguiendo el protocolo.Y se realizó un Western blot utilizando 20 mg de cada muestra. Para comprobar la pureza de las fracciones, se utilizaron HSP90 y Tubulina como controles citoplasmáticos y HDAC1 y H3 como controles nucleares. Como se puede observar, HSP90 y Tubulina se localizan principalmente en el citoplasma y HDAC1 y H3 en el núcleo con una mezcla muy residual entre las dos fracciones.Para ver si el protocolo afecta a la muerte celular, también detectamos CASP3. Ambas muestras presentan una tinción mínima para CASP3, lo que confirma que el procedimiento no afecta a la vía de muerte celular incluso después de la congelación instantánea de las biopsias. Las muestras congeladas utilizadas en este experimento procedían de un individuo con una afección inflamatoria intestinal y, como era de esperar, pSTAT1 aparece en el citoplasma de esta muestra, lo que confirma que las modificaciones proteicas se mantienen después del fraccionamiento y, por lo tanto, se pueden utilizar para el análisis funcional posterior.La reproducibilidad de los resultados en biopsias congeladas se muestra en esta figura. Las fracciones están limpias con una mezcla mínima de proteínas en los compartimentos. Las biopsias frescas y congeladas se pueden utilizar por igual en estos protocolos, y las biopsias congeladas proporcionan resultados limpios y reproducibles, como se ve en las Figuras 1 y 2.El protocolo descrito aquí está diseñado para generar las posibles fracciones proteicas. Sin embargo, cierta variabilidad intrínseca dentro de la muestra, incluido el tamaño y el estado del tejido, puede provocar desviaciones en las cantidades de proteínas y las cantidades de distribución en las fracciones.

subcellular-fractionation-from-fresh-frozen-gastrointestinal

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En el fraccionamiento subcelular situ de células de mamíferos en cubreobjetos microscopio permite la visualización de la localización de la proteína.

En Fraccionamiento subcelular situ de células mamíferas adherentes y no adherentes-

Este video describe el protocolo para aislar núcleos individuales de tejido de glioma fresco congelado. Los núcleos individuales aislados se pueden utilizar como muestras para técnicas de secuenciación como la secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNA) y el ensayo de un solo núcleo para la secuenciación de cromatina accesible a la transposasa (snATAC) para obtener una visión más profunda de la heterogeneidad inter e intratumoral observada en el glioma de los tejidos nerviosos centrales.

Aislamiento de núcleos de tejidos frescos congelados de glioma: un método para obtener núcleos intactos a partir de muestras de tumores de glioma

Aquí describimos un método simple para el aislamiento de células de la superficie epitelial del colon murino espacialmente distintas de las células de la base de la cripta subyacente.

Método cryosectioning para microdisección de murino mucosa colónica

Aquí, se presenta un protocolo para aislar y establecer cultivos primarios de fibroblastos/miofibroblastos (MF) a partir de células gástricas, del intestino delgado y de colon congeladas productoras de tejido con un fenotipo MF. Estas células expresan CD90, α-SMA y vimentina. Los MF se pueden utilizar para una variedad de ensayos funcionales, incluida la actividad enzimática y la producción de citocinas.

Aislamiento de CD 90+ fibroblastos / miofibroblastos de congelados Humanos gastrointestinales Especímenes

El objetivo de este protocolo es obtener muestras de RNA de alta integridad de ganglios entéricos aislados del tejido intestinal humano no fijado, recién resecado usando el microdissection de la captura de láser (LCM). Este protocolo implica preparación de flash-congeladas muestras de tejido intestinal humano, cryosectioning, coloración etanólico y deshidratación, LCM y la extracción de RNA.

Optimización del Microdissection de la captura de láser para el aislamiento de los ganglios entéricos de tejido humano fresco congelado

Aquí, presentamos un protocolo para aislar la membrana plasmática, citoplasma y mitocondrias de las células U937 sin el uso de la centrifugación de alta velocidad. Esta técnica se puede utilizar para purificar fracciones subcelulares para la examinación subsecuente de la localización de la proteína mediante immunoblotting.

Fraccionamiento de la célula de las células U937 en ausencia de centrifugación de alta velocidad

Este protocolo describe varios procedimientos para preparar muestras de tejido congelado de alta calidad en el momento de la necropsia para su uso en el ensayo del cometa para evaluar el daño del ADN: 1) tejido picado, 2) células epiteliales raspadas del tracto gastrointestinal, y 3) tejido en cubos muestras, que requieren homogeneización utilizando un dispositivo de picado de tejido.

Uso de tejido congelado en el ensayo de cometas para la evaluación del daño causado por el ADN

La heterogeneidad intramoral es una característica inherente de los tumores, incluidos los gliomas. Desarrollamos un protocolo simple y eficiente que utiliza una combinación de tampones y centrifugación por gradiente para aislar núcleos individuales de tejidos de glioma frescos congelados para estudios de secuenciación de ARN de núcleo único y ATAC.

Aislamiento de núcleos de tumores cerebrales frescos congelados para RNA-seq de un solo núcleo y ATAC-seq

Este protocolo de fraccionamiento permitirá a los investigadores aislar proteínas citoplasmáticas, nucleares, mitocondriales y de membrana de células de mamíferos. Las dos últimas fracciones subcelulares se purifican aún más a través del gradiente de densidad isopícnica.

Fraccionamiento celular de células U937 por purificación de gradiente de densidad isopícnica

El protocolo proporciona un enfoque fiable y optimizado para el aislamiento de núcleos de muestras de tumores sólidos para la secuenciación multioma utilizando la plataforma 10x Genomics, que incluye recomendaciones para las condiciones de disociación de tejidos, la criopreservación de suspensiones unicelulares y la evaluación de núcleos aislados.

Aislamiento optimizado de núcleos a partir de muestras de tumores sólidos frescos y congelados para la secuenciación multioma

Describimos un modelo murino de íleo postoperatorio generado por manipulación intestinal. Se evaluó la función del tránsito gastrointestinal, los cambios patológicos y la activación de las células inmunitarias 24 h después de la cirugía.

Modelo murino de íleo postoperatorio

Aprende a fraccionar proteínas citoplasmáticas y nucleares de biopsias intestinales frescas o congeladas. Este protocolo permite analizar la localización de proteínas en muestras gastrointestinales humanas.

Fraccionamiento subcelular de especímenes gastrointestinales frescos y congelados

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