Name: CRISPR/Cas9 Gene edición para hacer condicionales mutantes de humano parásito de la Malaria por p. falciparum (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprende a generar mutantes condicionales mediante CRISPR/Cas9 en Plasmodium falciparum, el parásito de la malaria humana. Esta técnica permite estudiar funciones proteicas mediante regulación controlada de genes.

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Agradecemos Muthugapatti Kandasamy en el centro de microscopia Biomédica de Universidad de Georgia (UGA) para asistencia técnica y Juan Jose Lopez-Rubio por compartir la plásmidos pUF1 Cas9 y pL6. Este trabajo fue apoyado por premios de la Fundación de arcos D.W.C. y H.M.K., otorga fondos de inicio UGA a V.M., subvenciones de la Fundación marcha de Dimes (Premio de investigación de albahaca o ' Connor arrancador erudito) a V.M. y nos institutos nacionales de salud (R00AI099156 y R01AI130139) a V.M. y (T32AI060546) a H.M.K.

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Los autores no tienen nada que revelar.

La implementación de CRISPR/Cas9 en p. falciparum tiene tanto aumentó la eficacia de y redujeron la cantidad de tiempo necesario para modificar el genoma del parásito, en comparación con los métodos anteriores de manipulación genética. Este protocolo integral esboza los pasos necesarios para la generación de mutantes condicionales utilizando CRISPR/Cas9 en p. falciparum. Mientras que el método está orientado específicamente para la generación de mutantes deMLG HA -, esta estrategia puede adapta...

La malaria es una enfermedad devastadora causada por parásitos protozoarios del género Plasmodium. P. falciparum, el parásito del paludismo humano mortal más, hace aproximadamente 445.000 muertes por año, sobre todo en niños menores de cinco1. Plasmodium parásitos tienen un ciclo de vida complicado con un vector mosquito y un hospedador vertebrado. En primer lugar los seres humanos se infectan cuando un mosquito infectado toma una comida de sangre. Luego, el parásito invade el hígado donde crece, se desarrolla y se divide por aproximadamente una semana. Después de este proceso, los parásitos se liberan en el torrente sanguíneo, donde se someten a la replicación asexual en células de sangre rojas (RBCs). Crecimiento de los parásitos en los glóbulos rojos son directamente responsables de los síntomas clínicos asociados con la malaria2.
Hasta hace poco, producción de transgénicos por p. falciparum fue un proceso laborioso, que implica varias rondas de selección de la droga que tomó muchos meses y tenían una tasa alta de fracaso. Este procedimiento desperdiciador de tiempo relieson la generación de DNA al azar rompe en la región de interés y la capacidad endógena del parásito para reparar su genoma aunque reparación homóloga3,4,5,6 . Recientemente, agrupadas regularmente otro palindrómico Repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) edición del genoma ha sido exitosamente utilizada en p. falciparum7,8. La introducción de esta nueva tecnología en la investigación de la malaria ha sido fundamental para el avance de la comprensión de la biología de estos parásitos Plasmodium mortales. CRISPR/Cas9 permite la focalización específica de genes a través de guía RNAs (gRNAs) que son homólogos a los genes de interés. El gRNA/Cas9 complejo reconoce el gen por el gRNA y Cas9 introduce entonces una rotura de doble cadena, obligando a la iniciación de los mecanismos de reparación en el organismo9,10. Porque p. falciparum carece de la maquinaria para reparar roturas de DNA por unirse a final no homóloga, que utiliza mecanismos de recombinación homóloga e integra plantillas de ADN homólogas transfected para reparar el Cas9 gRNA-inducido rotura de doble cadena11,12.
Aquí, presentamos un protocolo para la generación de mutantes condicionales precipitación en p. falciparum usando CRISPR/Cas9 edición del genoma. El protocolo muestra el uso de la ribozima MLG a niveles de proteína condicional precipitación de PfHsp70x (PF3D7_0831700), un acompañante exportadas por p. falciparum en host gr13,14. La ribozima MLG es activado por el tratamiento con glucosamina (que se convierte en la glucosamina-6-fosfato en las células) para hender su mRNA asociados, llevando a una reducción de la proteína14. Este protocolo puede ser fácilmente adaptado para utilizar otras herramientas de precipitación condicionales, como dominios de desestabilización o RNA aptámeros4,5,15. Nuestros detalles del protocolo la generación de un plásmido de reparación que consta de un ribozima de etiqueta y glmS de hemaglutinina (HA) secuencia flanqueada por secuencias de codificación son homólogas a las PfHsp70x marco abierto de lectura (ORF) y 3'-UTR. También se describe la generación de un segundo plásmido de expresión de la unidad de la gRNA. Estos dos plásmidos, junto con un tercero que conduce la expresión de Cas9, transfected en glóbulos rojos y sirve para modificar el genoma de p. falciparum parásitos. Por último, se describe una reacción en cadena de polimerasa (polimerización en cadena)-basado en la técnica para verificar la integración de la etiqueta y glmS ribozyme. Este protocolo es altamente adaptable para la modificación o completo octavos de final de cualquier genes de p. falciparum , mejorar nuestra capacidad de generar nuevos conocimientos sobre la biología del parásito de la malaria.

<table><tbody><tr><td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2086</td><td>Compramos los que están envueltos individualmente</td></tr><tr><td>Acetato de Sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889-250g</td><td></td></tr><tr><td>DSM1</td><td>Gift de Akhil Vaidya lab</td><td>Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34</td><td></td></tr><tr><td>TPP Cultivo de Tejidos 6 Placas</td><td>MIDSCI</td><td>TP92006</td><td></td></tr><tr><td>TPP 100 mm Placas de Cultivo de Tejidos (Placa de 12 mL)</td><td>MIDSCI</td><td>TP93100</td><td></td></tr><tr><td>TPP Cultivo de Tejidos 96 Placas</td><td>MIDSCI</td><td>TP92096</td><td></td></tr><tr><td>TPP Cultivo de Tejidos 24 Placas</td><td>MIDSCI</td><td>TP92024</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>#B7002S</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1</td><td>New England Biolabs</td><td>#B7202S</td><td></td></tr><tr><td>BtgZI</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0703L</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0157L</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>#R3104S</td><td></td></tr><tr><td>Afe1</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0652S</td><td></td></tr><tr><td>Nhe1-HF</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td>#R3131L</tr><tr><td>T4 ADN polimerasa</td><td>New England Biolabs</td><td>#M0203S</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Unidad de filtro de tapa de botella Steritop</td><td>Millipore</td><td>SCGPU10RE</td><td>Puede usar cualquier tamaño que se adapte a sus necesidades</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378-100G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500g</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-500g</td><td></td></tr><tr><td>pMK-U6</td><td>Generado por el Muralidharan Lab</td><td>n/a</td> pHA-glmS generado por el Muralidharan Lab n/a <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pUF1-Cas9</td><td>Regalo del Laboratorio Jose-Juan López-Rubio</td><td>Ghorbal et al. Nature Biotech 2014</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280-100G</td><td></td></tr><tr><td>Hipoxantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9636-25g</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>timidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895-1G</td><td></td></tr><tr><td>PL6-eGFP BSD</td><td>generado por el laboratorio de Muralidharan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puf1-cas9 eGFP gRNA</td><td>generado por el laboratorio Muralidharan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel y limpieza de PCR</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.250</td><td></td></tr><tr><td>Albumax I</td><td>Life Technologies</td><td>N/A</td><td>Querrá probar algunos lotes para averiguar cuáles serán los parásitos en el mejor</td></tr><tr><td>Blood Cells Humans</td> Red <td>Technologies Interstate Blood Bank, Inc</td><td>Envíe un correo electrónico o llámelos directamente para realizar un pedido</td><td>Por lo general, usamos la</td></tr><tr><td>línea de parásitos O + blood 3D7</td><td>Disponible a pedido</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de lisogén (LB)</td><td>Fisher</td><td>BP1426-2</td><td>Puede hacer el suyo propio, no es necesario usar exactamente este</td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Fisher</td><td>BP1760-25</td><td>Hacemos un caldo de 1000X a 100 mg / ml en agua y almacenamos en el -20C</td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Clonetech</td><td>R050A</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EF1alpha</td><td>Dr. Daniel Goldberg's Lab</td><td>Washington University en St. Louis</td><td>Puede usar su control de carga preferido para Western blots. Este es justo el que usamos en nuestro laboratorio</td></tr><tr><td>Rat Anti-HA Clon 3F10, monoclonal</td><td>Made by Roche, vendido por Sigma</td><td>11867423001</td><td>Puedes usar tu anticuerpo anti-HA preferido</td></tr><tr><td>Tubos de 0,6 mL Fisher</td><td></td><td>AB0350</td><td></td></tr><tr><td>Fisher HealthCare* PROTOCOLO* Hema 3* Sistema de tinción manual (fijador + solución I y II)</td><td>Fisher</td><td>22-122-911</td><td>También puede usar el tinte</td></tr> <tr><td>de giemsaPortaobjetos de microscopio esmerilado premium de Fisherfines - Tamaño: 3 x 1 pulg.</td><td>Pescador</td><td>12-544-3</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr/cas9 gene edición para hacer condicionales mutantes de humano parásito de la malaria por p. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

La malaria es una causa significativa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Esta enfermedad, que afecta sobre todo a los que viven en regiones tropicales y subtropicales, es causada por infección con los parásitos Plasmodium . El desarrollo de medicamentos más eficaces para combatir la malaria puede acelerarse mediante la mejora de nuestra comprensión de la biología de este parásito complejo. Manipulación genética de estos parásitos es clave para entender su biología; sin embargo, el genoma de p. falciparum ha sido históricamente difícil de manipular. Recientemente, CRISPR/Cas9 edición del genoma ha sido utilizada en parásitos de la malaria, permitiendo para la proteína más fácil etiquetado, generación de caídas de proteína condicional y canceladura de los genes. La edición del genoma CRISPR/Cas9 ha demostrado para ser una poderosa herramienta para avanzar en el campo de la investigación de la malaria. Aquí, describimos un método CRISPR/Cas9 para generar MLG-base de mutantes condicionales precipitación en p. falciparum. Este método es altamente adaptable a otros tipos de manipulaciones genéticas, incluyendo proteína etiquetado y golpes de gracia del gene.

Figura 1muestra un esquema de lo plásmidos utilizados en este método, así como un ejemplo de una mutación de escudo. Como un ejemplo de cómo identificar parásitos mutantes después de transfección, resultados de PCRs para comprobar la integración de la construcción HA -MLG se muestran en la figura 2. Una imagen representativa de una clonación de la placa se muestra en la figura 3 para demostr...

Se describe un método para la generación de MLG-base condicionales mutantes precipitación usando CRISPR/Cas9 edición del genoma del falciparum del Plasmodium .

CRISPR/Cas9 Gene edición para hacer condicionales mutantes de humano parásito de la Malaria por p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología del parásito de la malaria humana, P.Falciparum, ayudando a descubrir la función proteica a través de la eliminación condicional. La principal ventaja de esta técnica es que permite una generación relativamente fácil de mutantes condicionales en comparación con los métodos anteriores. Para comenzar, ve a Chop Chop y selecciona Fasta Target'Under Target, pega los 200 pares base del extremo principal del marco de lectura abierto de un gen y 200 pares base desde el inicio de los tres UTR primos del gen.En In'select P.Falciparum'and seleccione CRISPR/Cas9'en Using'Next, haga clic en Buscar sitios de destino'Seleccione una secuencia de GRNA de las opciones presentadas, dando preferencia al ARNN más eficiente que está más cerca del sitio de modificación y que tiene el menor número de sitios fuera de destino. Compra la secuencia de GRNA y su complemento inverso como oligos purificados de electroforesis de gel de poliacrilamida. La secuencia de GRNA utilizada para apuntar a PfH-sp70x se puede encontrar en el protocolo de texto.Agregue 40 microgramos cada uno de ADN pMK-U6, pUF1-Cas9 y pHA-glmS en un tubo estéril de centríf

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Los detalles se presentan sobre cómo mapeo QTL con un mapa genético basado en la secuencia del genoma completo se puede utilizar para identificar un gen de resistencia a los medicamentos en Toxoplasma gondii y cómo esto se puede verificar con el sistema CRISPR / Cas9 que edita eficientemente un objetivo genómico, en este caso el Gen de resistencia a fármacos.

QTL Mapping y CRISPR / Cas9 Edición para identificar un gen de resistencia a fármacos en<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Aquí, describimos un protocolo para introducir un knockout genético en el amastigote extracelular de Trypanosoma cruzi, utilizando el sistema CRISPR/Cas9. El fenotipo de crecimiento puede ser seguido ya sea por el recuento celular de la cultura axenic amastigote o por la proliferación de amastigotes intracelulares después de la invasión de la célula huésped.

Introducción de un Knockout Gene Directamente en la etapa de Amastigote de Trypanosoma cruzi usando el sistema CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 se utiliza cada vez más para caracterizar la función génica en organismos no modelo. Este protocolo describe cómo generar líneas eliminatorias de Culex pipiens,desde la preparación de mezclas de inyección, hasta la obtención e inyección de embriones de mosquitos, así como la forma de criar, cruzar y detectar mosquitos inyectados y su progenie para detectar mutaciones deseadas.

Preparación e inyección de embriones de mosquitos Culex para generar mutaciones nulas utilizando CRISPR/Cas9

Este protocolo detalla los pasos de crispr/cas9 mutagénesis dirigida en moscas de arena: recolección de embriones, inyección, cría de insectos e identificación, así como selección de mutaciones de interés.

Mosca de arena (Phlebotomus papatasi) Microinjeción embrionaria para CRISPR/Cas9 Mutagenesis

El objetivo de este protocolo es permitir la edición CRISPR/Cas9 sin fisuras del genoma de C. elegans utilizando complejos de ribonucleoproteína ensamblados y el marcador co-CRISPR dpy-10 para el cribado. Este protocolo se puede utilizar para realizar una variedad de modificaciones genéticas en C. elegans, incluidas inserciones, deleciones, reemplazos de genes y sustituciones de codones.

CRISPR/Cas9 Edición del gen C. elegans rbm-3.2 utilizando el marcador de detección co-CRISPR dpy-10 y complejos de ribonucleoproteína ensamblados.

El protocolo describe cómo lograr modificaciones dirigidas al sitio en el genoma de los mosquitos de la malaria Anopheles utilizando el sistema φC31 . Las modificaciones descritas incluyen tanto la integración como el intercambio de casetes transgénicos en el genoma de las líneas de acoplamiento que llevan attP.

Integración mediada por φC31 dirigida por sitios e intercambio de casetes en anopheles vectores de malaria

Este artículo detalla un protocolo para la identificación rápida de indels inducidos por CRISPR/Cas9 y la selección de líneas mutantes en el mosquito Aedes aegypti utilizando análisis de fusión de alta resolución.

Detección indel tras mutagénesis CRISPR/Cas9 mediante análisis de fusión de alta resolución en el mosquito Aedes aegypti

Este protocolo describe cómo realizar una edición eficiente de la base de adenina sin limitación de PAM para construir un modelo preciso de la enfermedad del pez cebra utilizando zSpRY-ABE8e.

Edición de base eficiente sin PAM para el modelado de peces cebra de enfermedades genéticas humanas con zSpRY-ABE8e

La genética química implica la sustitución de un residuo guardián por un aminoácido que contiene una cadena lateral diferente en el locus objetivo. Aquí, hemos generado un parásito mutante que contiene un alelo hipomórfico de cdpk1 e identificado las vías compensatorias adoptadas por el parásito en el fondo mutante.

Comprender el desarrollo de vías compensatorias en un parásito mutante de la malaria que alberga un alelo hipomórfico de quinasas similares a las plantas

En este trabajo describimos un protocolo detallado para la edición del genoma mediante microinyección embrionaria en el mosquito A. aegypti utilizando la tecnología CRISPR-Cas9.

Edición del genoma del mosquito Aedes aegypti de la fiebre amarilla mediante CRISPR-Cas9

Aprende a generar mutantes condicionales mediante CRISPR/Cas9 en Plasmodium falciparum, el parásito de la malaria humana. Esta técnica permite estudiar funciones proteicas mediante regulación controlada de genes.

CRISPR/Cas9 Gene edición para hacer condicionales mutantes de humano parásito de la Malaria por p. falciparum

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