Name: Análisis de la marcha de deficiencias motoras dependientes de la edad en ratones con neurodegeneración (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Aprende análisis cinemático de la marcha para estudiar alteraciones motoras en modelos murinos de neurodegeneración. Este método permite detectar cambios sutiles en la coordinación y evaluar la progresión de enfermedades como el Parkinson.

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Agradecemos a cuidadores de animales en el Animalario de la ENI para ayuda con la crianza y el Dr. Nuno Raimundo útiles comentarios sobre el manuscrito. I.M. es apoyado por las becas de la Fundación de investigación alemana (DFG) a través del centro de investigación colaborativa SFB-889 (proyecto A8) y SFB-1190 (proyecto P02) y el premio al investigador joven Emmy Noether (1702/1). C.M.R. es apoyado por la beca de la escuela de postgrado de Göttingen para Neurociencias y Biofísica Molecular Biosciences (GGNB).

Todos los experimentos con animales divulgados aquí se llevan a cabo según las directrices europeas para el bienestar animal (2010/63/UE) con la aprobación por la Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES), número de registro 14 / 1701.
1. diseño del estudio
<ol><li>Como trabajo del comportamiento de los animales requiere una planificación cuidadosa, considerar los siguientes parámetros de diseño del experimento.<ol>
<li>Número de animales necesarios por grupo.<ol>
<li>Utilizar un software estadístico (por ejemplo, pase, EDA o GPower) para calcular el tamaño de grupo requerido. Nota: El tamaño del grupo depende de la variación entre los animales y la severidad del fenotipo. Para el análisis cinemático de la marcha, el número de ratones es generalmente 10-20 por grupo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sexo de los animales experimentales.<ol>
<li>Considerar el efecto de los niveles de estrógeno en el experimento, dependiendo de la cepa animal. Nota: Muchos estudios de comportamiento se centran en los machos para evitar la influencia de los niveles de estrógeno en el experimento. Estas influencias son más o menos fuertes dependiendo de la cepa de animales de fondo.</li>
			<li>Si se utilizan ambos sexos, prueba de la influencia del sexo y evaluar los dos sexos independientemente cuando sea necesario.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Edad de los animales experimentales.<ol>
<li>Uso de animales adultos (2 meses de edad, o más) si sólo se necesita un solo punto.</li>
			<li>Seleccionar varios puntos del tiempo cuando el cambio en la conducta motora con edad avanzada es a estudiar. El punto más temprano posible es 1 mes, después de ratones son destetados de sus madres. Los animales de prueba en intervalos regulares, por ejemplo, cada 1, 2 o 3 meses.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solicitar la autorización de las autoridades locales para realizar las pruebas de comportamiento de los animales.</li>
	<li>Hacer planes para la adquisición de animales de laboratorio.<ol>
<li>Hacer un plan de cría o en contacto con un distribuidor animal de manera oportuna para suficientes animales experimentales están disponibles en el día cuando comenzar los experimentos.</li>
		<li>Permite que los animales habituarse durante una semana si se guardan en un nueva sala de ajuste durante los experimentos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. video grabación
Nota: Para ilustrar el uso de análisis de la cinemática de la marcha, aquí un sistema de imagen disponible en el mercado con su acompañamiento de la proyección de imagen y software de análisis (véase Tabla de materiales) se utilizan.
<ol><li>Iniciar el ordenador y el software del imager.</li>
	<li>Determinar el estado de salud y el bienestar de cada animal observando en su jaula casera, y pesa en una balanza.</li>
	<li>Cuando sea necesario, aplicar suavemente el dedo rojo pintura a las patas del animal con un cepillo. Permita que la pintura seque ~, 5 minutos en una jaula limpia de repuesto. Nota: Evite pintura abdomen del animal, como la pintura se usa para realzar el contraste entre las patas y el cuerpo. Es útil contar con pintura de dedos negra útil para correcciones. Este paso es necesario para los animales con la piel marrón, o en caso las patas han sido tatuadas para la identificación. Si elegido para pintar las patas de un animal, todos los animales en el mismo grupo y grupo de control necesitan ser pintado así.</li>
	<li>Ajustar la velocidad de la cinta en el panel derecho superior del aparato; Si se aplica más de una velocidad, comience con la velocidad más baja primero.</li>
	<li>Coloque el animal en la cámara de prueba (evitar la cola o las patas de sujeción cuando cierre la cámara). Cubrir la cámara con un paño oscuro y permitir que cada animal ajustar para 1-2 min.</li>
	<li>Encender la luz en la cámara de prueba girando el conmutador luz de caminadora a la posición "on". Gire el interruptor giratorio de caminadora a "forward" para iniciar la caminadora, luego haga clic en el botón "record" en el software del imager. Nota: La cinta en marcha, es importante observar funcionamiento animal con cuidado y constantemente: detener la cinta inmediatamente si el animal no puede mantenerse al día con la velocidad de la caminadora, o muestra síntomas secundarios no relacionados con locomoción (por ejemplo, epilépticos). Condiciones de prueba deba ser reajustado.</li>
	<li>Cuando el animal está estable (no rápidos escapes a los lados, adelante o detrás), grabación de al menos 5 s antes de parar la cinta. Detener la grabación haciendo clic en "stop" en el software del imager y gire el interruptor giratorio de la cinta de correr hacia la posición "off". Nota: Para evitar funcionamiento inestable de animales puede ser útil para hacerles correr por varios segundos, o para que puedan correr en la otra dirección (girando el interruptor giratorio de rueda de ardilla para "invertir" en lugar de "forward").</li>
	<li>Haga clic en el botón "procesar" en el software del imager para abrir un menú en el que pueden establecer el inicio y el punto final de la sección de videos (para análisis). Para ello, utilice el control deslizante en la parte inferior de la pantalla para navegar por el vídeo.</li>
	<li>Para seleccionar el momento actual como el punto inicial o final, haga clic en "de Nº de fotograma" y "a", respectivamente. Asegúrese de que la sección contiene por lo menos 7 pasos/pata (14 pasos en total) de los animales, funcionamiento estable a velocidad constante.</li>
	<li>Introduzca la identificación de los animales, fecha de nacimiento, peso y sexo. Guardar los datos en una ubicación deseada en la computadora o servidor. Haga clic en "cámara" para volver a la interfaz de grabación.</li>
	<li>Si múltiples velocidades funcionamiento necesitan grabarse, repita los pasos 2.6 2.10 con la velocidad de funcionamiento deseada. Antes de grabar el siguiente video, asegúrese de que la pintura roja todavía está presente en la pata, de lo contrario repita el paso 2.3.</li>
	<li>Después de grabar, suelte el animal a su jaula casera. Después de retirar un animal, la banda caminadora Limpie bien con agua y jabón seguido de desinfectante para prepararse para el siguiente animal experimental.</li>
</ol>3. vídeo proceso
<ol><li>Inicie el software de análisis y haga clic en "carpeta del estudio select" para seleccionar la carpeta con los vídeos grabados.</li>
	<li>Seleccionar un video o varios videos que pueden ser procesados de forma consecutiva y haga clic en "ir".</li>
	<li>Utilice la función de "Repintar" para seleccionar el área donde se ejecuta el ratón; Esta sección debe contener sólo el mouse y el fondo blanco.</li>
	<li>Si previamente se utilizó la función "reverse" caminadora, elegir "comprobar si la nariz del sujeto es a la derecha >>>" para reflejar el video ya que el software está diseñado para analizar sólo animales que corren a la izquierda. Haga clic en "Aceptar" para continuar.</li>
	<li>Utilice la función de "refresh" para ver la máscara por omisión y paw print que detecta el software. Nota: El video original aparece a la izquierda, y una imagen en blanco y negro de las impresiones de la propuesta de la pata está a la derecha.</li>
	<li>Introduzca valores en los cuadros "largo" y "ancho" para cambiar la máscara que excluye el área rojo alrededor del hocico del animal para análisis; como el color es similar a las patas, no enmascarar esa área podría resultar en el software accidentalmente clasificar la zona del hocico como una pata.</li>
	<li>Ajustar los deslizadores "filtro ruido" y "filtro de piel y manchas oscuras" para optimizar la impresión de blanco y negro de la pata. Ajuste el deslizador de "filtro de ruido" a ~ 800-950 para animales negros y a ~ 700-800 para el marrón o blanco dependiendo del color de piel exacto del animal. Seleccione "ok" cuando los valores son satisfactorios. Nota: El regulador «filtro de piel y manchas oscuras» depende en cómo "roja" la pata. Patas pintadas, el valor es generalmente alrededor 100-120 y para los patas no pintado el mejor valor es alrededor de 50-100. Estos ajustes dependen de las sombras de color de la piel y las patas y que deba ser optimizado para cada animal. La impresión blanco y negro de la pata debe tener claras las representaciones de las patas con como poco ruido de fondo como sea posible.</li>
	<li>Seleccione uno o varios videos que pasaron el primer ajuste (marcado con "@" antes del nombre de video) y seleccione la función "ir" para iniciar el análisis de estos videos. Nota: El análisis toma 2-5 minutos por video. Es posible ejecutar el análisis de varios videos durante la noche ya que este paso no requiere ninguna entrada del experimentador.</li>
	<li>Seleccione un vídeo analizado (marcado con "@@@") y haga clic en "ir". Tenga en cuenta que ahora se aprecia la zona de la pata (en cm2) en contacto con la correa con el tiempo (dinámica de marcha) para cada pata separada. Para comparar el video original y la calculada pata imprimir un área seleccionada, utilice la función "play video".</li>
	<li>Utilice las siguientes herramientas (tres) para corregir pequeños errores cometidos por el software.<ol>
<li>Utilice la opción "correcta" para eliminar una señal equivocada, por ejemplo, cuando el software graba una señal aunque la pata correspondiente no esté en contacto con la correa. Haga clic una vez para acercar a la zona correspondiente y marca el borde izquierdo del objeto para quitar con el segundo click y el borde derecho con el tercer clic.</li>
		<li>Utilice la opción "connect" para combinar dos señales, por ejemplo, cuando no hay señal se registra por unos marcos a pesar de que la pata esté en contacto con la correa. Haga clic una vez para zoom en el área correspondiente y haga doble clic en medio de los dos objetos a combinar.</li>
		<li>Utilice la opción "eliminar" para quitar los puntos de tiempo a partir del análisis completo. Utilice esta opción sólo si el error no se resuelve con la "correcta" o la función "conectar", por ejemplo, cuando una señal de la pata del miembro anterior izquierdo por accidente se registra por la pata izquierda de extremidades. Haga clic una vez para acercar a la zona correspondiente y marca el borde izquierdo de la zona para quitar con el segundo click y el borde derecho con el tercer clic. Nota: Las herramientas pueden ser utilizadas para corregir pequeños errores; fallas sistemáticas (por ejemplo, si la señal de una pata era extremadamente débil) no pueden ser corregidos: el video debe excluirse del análisis y repetir la grabación del animal respectivo, cuando sea posible. Nota que la opción "play video" ya no está disponible después de la "correcta", "conectar" o "borrar" opción se ha utilizado y haga clic en el botón "deshacer" se restablecerán las 3 herramientas de edición.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seleccione "siguiente del miembro" para proceder a través de las 4 extremidades; Cuando se hace clic en "siguiente miembro" después de la última pata, el software completa el análisis y muestra los resultados de este animal en 4 pantallas.</li>
</ol>4. Análisis de la marcha
<ol><li>Cuando se analizan todos los videos de un experimento, seleccionar todos los vídeos y haga clic en "volver a organizar los resultados de" exportar resultados (lista de parámetros en los archivos de hoja de cálculo).</li>
	<li>Abra el archivo con la terminación "reorganized_stride_info" y agregar información que no está incluido en esta hoja de cálculo: Grupo de información (por ejemplo, genotipo, tratamiento), la edad y las medidas de ancho y longitud de animales que se guardan en otro archivo de hoja de cálculo con la terminación "SFI_TFI_PFI_reorganized_stride_info".</li>
	<li>Normalizar los parámetros de marcha animal anchura o longitud cuando sea necesario, por ejemplo, SL SW y animales animal ancho.</li>
	<li>Ordenar los resultados por grupo, la edad y velocidad de marcha: analizar todas estas condiciones independientemente. Nota: Diferentes edades o velocidades de corrientes no se pueden combinar dentro de un mismo grupo.</li>
	<li>Calcular los valores promedio (media), desviación estándar y error estándar de la media para cada parámetro para todas las condiciones experimentales.</li>
	<li>Realizar análisis estadístico según el diseño experimental, por ejemplo, usar una cola de 2 t-test para comparar un tipo salvaje (WT) animal mutante/tratados / control o ANOVA para comparar varios grupos independientes.</li>
	<li>Mira a todos parámetros medidos: es útil trazar cada parámetro para visualizar mejor los resultados. Si hay diferencias estadísticas en un determinado parámetro, comprobar si otros parámetros dependientes cambian correspondientemente. Nota: por ejemplo, si la SL se redujo significativamente en un cierto grupo de prueba, esto también causará una mayor frecuencia de zancada (ya que la velocidad es la misma) y puede resultar en un aumento SW (para mantener la estabilidad de la postura).</li>
	<li>Seleccionar los parámetros que son más relevantes para un modelo, y son comparables a las observaciones en la enfermedad humana. Para una presentación, crear vídeos representativos de cada grupo y complementar por gráficos que muestran la lectura de los parámetros relevantes, ya que cambios en la marcha sutiles a menudo no son evidentes de los videos.</li>
</ol>5. solución de problemas
Nota: Algunos animales, especialmente modelos de ratón con un fenotipo de ansiedad, pueden tener dificultades para realizar incluso una tarea simple como correr en una cinta rodante. Los siguientes son pasos que pueden tomar los niveles de ansiedad y animar a correr.
<ol><li>Habituación y ejecución positiva.<ol>
<li>En 2-3 días antes de la primera prueba, coloque el ratón en la cámara de prueba, cubierta con un paño oscuro y dejar la luz apagada. Que el ratón se ajustan al nuevo entorno de ~ 5 min agregar chow o mantequilla de chocolate y nueces (por ejemplo, Nutella) a la cámara de prueba para que puede formar una asociación positiva.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aplicación negativa por límite de soplos/trasera de aire.<ol>
<li>Ratones no como soplos de aire o un movimiento detrás de ellos y se ejecutarán de la perturbación. Para motivar el funcionamiento, uso de soplos de aire suave y rítmico movimiento de la barra flexible que forma el límite posterior de la cámara de prueba, al ratón a correr hacia la parte delantera de la cámara de prueba.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Comienzo lento.<ol>
<li>Al probar velocidades de marcha rápidas, iniciar la caminadora a una velocidad inferior y luego poco a poco aumentar la velocidad de la caminadora hacia la condición deseada de la prueba.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Minimizar la libre circulación.<ol>
<li>La longitud de la cámara de prueba está limitada por dos barras ajustables en la parte delantera y trasera. Si un animal de prueba mantiene al día con la velocidad pero no funciona constantemente, limitar la longitud de la cámara para dar lugar a un funcionamiento más constante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Si las medidas antes mencionadas no son exitosas, grabar corriendo el día siguiente. Si el animal todavía se niega a correr después de la prueba en tres días, anote esto como el hallazgo y excluir a los animales de pruebas. Nota: Los resultados de los análisis de la marcha dependen en buena calidad grabación de vídeo. No hay ninguna razón para excluir videos durante el análisis si los videos han sido grabados con cuidado. Si la calidad del video no es suficiente, llegará a ser evidente durante paso 3.6 cuando se establecen los parámetros para la creación de la impresión digital de la pata. Si cualquier otra parte del cuerpo excepto las patas y el hocico aparece rojo (p. ej., debido a la falta de piel alrededor de los genitales o rociadas de pintura de dedos en el abdomen), la calidad disminuye considerablemente. Los ajustes en el paso 3.6 permiten corregir sólo pequeños problemas y si esto no puede traer el video a una señal/ruido aceptable, el video tiene que ser excluidos del análisis, y grabación debe repetirse. Por lo tanto, se recomienda analizar vídeos poco después de las grabaciones se llevan a cabo.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

Estudiar la coordinación motora es un enfoque útil en la caracterización de modelos de enfermedades neurodegenerativas, especialmente para enfermedades como el PD que coordinación motora es severamente afectado. Con la ayuda de un análisis funcional del análisis cinemático de la marcha, podemos identificar cambios sutiles en el andar de los animales en el inicio de problemas de locomoción, o en modelos de neurodegeneración débil y por lo tanto relativamente modesto fenotipo. Dada la amplia gama de fenotipos en varios mod...

Enfermedades neurodegenerativas imponen una carga significativa en los pacientes, las familias y la sociedad y se convertirá en motivo de preocupación aún mayor conforme aumenta la esperanza de vida, y la población mundial sigue a la edad. Uno de los síntomas más comunes de las enfermedades neurodegenerativas son problemas de equilibrio y movilidad. Así, la caracterización del comportamiento motor en envejecimiento mamífero (p. ej., roedores) modelos o modelos que muestran fenotipos neurodegenerativas, es una herramienta valiosa para demostrar la importancia de en vivo del modelo animal específico, o terapéutico tratamientos que tienen como objetivo mejorar los síntomas de la enfermedad. Casi cada enfoque para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, en definitiva, requiere pruebas en un modelo animal antes de la iniciación de un ensayo clínico en seres humanos. Por lo tanto, es fundamental contar con pruebas de comportamiento fiable y reproducible que pueden utilizarse para cuantificar sistemáticamente enfermedades relevantes fenotipos a lo largo de la progresión de la edad, con el fin de asegurar que un fármaco candidato que demostró el potencial en un modelo en vitro , puede efectivamente mejorar el fenotipo de un animal vivo.
Un aspecto de la evaluación de la conducta motora en roedores es análisis cinemático de la marcha, que se puede realizar por VPI (también llamado plano ventral videografía)1,2. Este método establecido capitaliza el registro continuo de la parte inferior de los roedores caminando sobre una cinta transparente y motorizado correa1,2,3,4. Análisis del vídeo datos crea "impresiones de la pata digital" de los cuatro miembros que dinámicamente y confiablemente recapitulan patrón de caminar de roedor, originalmente descrito por Kale et al. 2 y Amende et al. 3.
El principio de análisis basado en la proyección de imagen del paso es medir el área de la pata en contacto con la correa de la cinta de correr con el tiempo, para cada pata individual. Cada postura está representada por un aumento en el área de la pata (en la fase de frenado) y una disminución en el área de la pata (en la fase de propulsión). Esto es seguido por la fase en que se detecte ninguna señal. Swing y postura junto forman un paso. Además de parámetros de la dinámica de marcha, parámetros de postura pueden extraerse también de los vídeos grabados. Parámetros de ejemplares y su definición se enumeran en la tabla 1 incluyen postura anchura (SW; la distancia combinada de las patas delanteras o traseras al eje de la cola de hocico), paso largo (SL; la distancia media entre dos pasos de la misma pata) y colocación de la pata ángulo (el ángulo de la pata al eje de la cola de hocico). Los datos de dinámica de la postura y marcha permiten establecer conclusiones de dibujos sobre equilibrio animal (por parámetros de postura y su variabilidad sobre varios pasos) y coordinación (por parámetros de dinámica de marcha). Otros parámetros, tales como coeficiente de ataxia (la variabilidad del SL calculada por [(max. SL−min. SL) significa SL /]), extremidades comparten posición tiempo (que ambos miembros posteriores están en contacto con la correa), o arrastrar la pata (área total de la pata de la correa de posición completo a despegue de la pata) también puede ser extraído y se han divulgado para cambiar en varios neurodegenerative di Sease modelos5,6,7,8 (ver tabla 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Parámetro</td>
			<td>Unidad</td>
			<td>Definición</td>
		</tr>
<tr>
<td>tiempo de oscilación</td>
			<td>MS</td>
			<td>duración de tiempo que la pata no está en contacto con la correa</td>
		</tr>
<tr>
<td>tiempo de postura</td>
			<td>MS</td>
			<td>duración de tiempo que la pata esté en contacto con la correa</td>
		</tr>
<tr>
<td>freno de %</td>
			<td>% de tiempo de postura</td>
			<td>porcentaje del tiempo de postura de las patas son en la fase de freno</td>
		</tr>
<tr>
<td>propulsar a %</td>
			<td>% de tiempo de postura</td>
			<td>porcentaje del tiempo de postura de las patas son en la fase de propulsión</td>
		</tr>
<tr>
<td>anchura de la postura</td>
			<td>cm</td>
			<td>distancia combinada de las patas delanteras o traseras al eje de la cola de hocico</td>
		</tr>
<tr>
<td>longitud de zancada</td>
			<td>cm</td>
			<td>distancia media entre dos pasos de la misma pata</td>
		</tr>
<tr>
<td>frecuencia de zancada</td>
			<td>avances/s</td>
			<td>número de pasos completos por segundo</td>
		</tr>
<tr>
<td>ángulo de colocación de la pata</td>
			<td>DEG</td>
			<td>ángulo de la pata en relación con el eje de cola del hocico del animal</td>
		</tr>
<tr>
<td>coeficiente de ataxia</td>
			<td>a.u.</td>
			<td>Variabilidad SL calculado por [(max SL-min SL) Media SL]</td>
		</tr>
<tr>
<td>% posición compartida</td>
			<td>% de postura</td>
			<td>tiempo de postura de extremidades compartido; momento en que ambos miembros posteriores están en contacto con la correa al mismo tiempo</td>
		</tr>
<tr>
<td>pata de arrastre</td>
			<td>mm2
</td>
			<td>área total de la pata de la correa de posición completo a despegue de la pata</td>
		</tr>
<tr>
<td>carga de la extremidad</td>
			<td>cm2
</td>
			<td>MÁXIMO dA/dT; máxima tasa de cambio de zona de la pata en la fase de ruptura</td>
		</tr>
<tr>
<td>variabilidad del ángulo de paso</td>
			<td>DEG</td>
			<td>desviación del ángulo entre las traseras de las patas como una función del SL y SW</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1. Definición de parámetros clave de paso que puede probar mediante la proyección de imagen de plano ventral.
Evaluar el comportamiento motor de los modelos de roedores para enfermedades neurodegenerativas puede ser difícil dependiendo de la severidad del fenotipo de un modelo específico a una determinada edad. Varias enfermedades, principalmente paladio, mostrar comportamiento motor fuerte (locomoción) los déficits, tanto en pacientes como en modelos animales. Uno de los cuatro síntomas fundamentales en la EP es la bradicinesia, que progresa con la edad y se manifiesta en deficiencias severas de la marcha ya en etapas tempranas de PD9. Estudios del modelo PD agudo, roedores tratados con 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP), han utilizado VPI gait análisis10,11,12. Sin embargo, dada la naturaleza aguda de este modelo, estos estudios no abordan la relacionada con la edad la progresión del déficit motor. Varios estudios recientes han llevado a cabo análisis de la marcha en ratones envejecidos con cambios neurodegenerativos, por ejemplo13,14,15, haciendo hincapié en la importancia de entender la progresión de la enfermedad con edad avanzada .
Además de déficit motor, modelos animales de enfermedades neurodegenerativas a menudo tienen dificultades para centrarse en las tareas de examen y mostrar las debilitaciones cognoscitivas prominentes, en particular con edad avanzada. Tal un fenotipo puede influir en el resultado de las pruebas de comportamiento motor. Es decir, una de las pruebas más utilizadas para examinar el déficit motor, el ensayo rotarod16, depende de la cognición, la atención y tensión17,18. Mientras que la voluntad de caminar en una caminadora motorizada también depende de estos factores, la lectura grabada está en marcha, que es una característica más estandarizada y mucho menos influenciada por cognición alterada. Efectos del estrés y atención pueden ser visibles en parámetros específicos, como el tiempo de oscilación/postura para el estrés y SL para atención19,20, pero no en capacidad de funcionamiento general.
El enfoque de análisis cinemático de la marcha además ofrece la ventaja de tener opciones para ajustar el desafío para los modelos de roedores. La caminadora con ángulo ajustable y velocidad permite a poca velocidad de 0.1 - 99,9 cm/s, para que los roedores con graves impedimentos a pie todavía pueden ser capaces de correr a una velocidad lenta (~ 10 cm/s). Animales con problemas no pueden medirse en correr más rápido velocidades (30 - 40 cm/s). La observación de los animales probados son capaces de correr a cierta velocidad si o no proporciona un resultado por sí mismo. Además, el roedor puede ser impugnado además correr hacia arriba en una pendiente, o por una caída, inclinando la cinta a un ángulo deseado con la ayuda de un goniómetro, o colocando un trineo cargado para extremidades traseras de ratón o rata.
Además de numerosos estudios de proteínas individuales que están mutados en los pacientes, existe una conciencia cada vez más recientes de los vínculos entre la defectuosa endocitosis proceso y neurodegeneración13,21,22, 23,24,25,26,27,28. Modelos con niveles reducidos de endophilin-A del ratón (en lo sucesivo endophilin), un jugador clave en ambos endocitosis mediada por clatrina13,21,,29,30,31 , 32 , 33 , se encontraron 45 y endocytosis clathrin-independiente34, para mostrar la neurodegeneración y el deterioro depende de la edad en actividad locomotor13,21. Tres genes que codifican la familia de proteínas endophilin: endophilin 1, endophilin 2 y endophilin 3. En particular, el fenotipo resultante del agotamiento de endophilin proteínas varía grandemente dependiendo del número de desaparecidos endophilin genes13,21. Mientras triple knock-out (KO) de todos los genes endophilin es mortal sólo unas horas después de nacer y los ratones sin tanto endophilin 1 y 2 no crecen y mueren dentro de 3 semanas después del nacimiento, KO solo para cualquiera de los tres endophilins no muestra ningún fenotipo obvio probado condiciones21. Otros genotipos mutantes endophilin muestran reducida vida útil y desarrollan deficiencias motoras con el aumento de edad13. Por ejemplo, endophilin 1KO-2HT-3KO ratones pantalla poca alteraciones y problemas de coordinación motora (como prueba rotarod y el análisis de la cinemática de la marcha) ya a los 3 meses de edad, mientras que sus hermanos de camada, endophilin 1KO-2WT-3KO animales, mostrar un significativo reducción en coordinación motora sólo a los 15 meses de edad13. Debido a la gran diversidad de fenotipos en estos modelos, es necesario identificar y aplicar una prueba que permite integrar una variedad de desafíos correspondiente al motor del animal y capacidades de cognición, así como la edad. Aquí detallamos los procedimientos experimentales que capitalizan el análisis cinemático de la marcha para evaluar la aparición y progresión de las deficiencias motoras en un modelo de ratón que muestra cambios neurodegenerativos (es decir, mutantes de endophilin). Esto incluye la medición de parámetros de marcha en distintas edades y diferentes niveles de gravedad de discapacidades de la locomoción.

<table><tbody><tr><td>DigiGait</td><td>Mouse Specifics, Inc., Framingham, Massachusetts, EE. UU</td><td></td>. El <td>software de análisis y generador de imágenes DigiGait se incluye con el hardware</td></tr><tr><td>La manta no transparente o la tela</td><td></td><td></td> oscura <td>cubren la cámara de prueba para reducir la sensación de equilibrio entre la exposición y el estrés del animal</td></tr><tr><td></td><td>, por ejemplo, la balanza Satorius</td><td></td><td>con una precisión de 0,1 g y una carga máxima de al menos 100 g</td></tr><tr><td>rojo pintura de dedos</td><td>, por ejemplo, Kreul o Staedtler</td><td></td><td>para aumentar el contraste entre las patas y el animal. s body</td></tr><tr><td>pincel</td><td></td><td></td> pequeño pincel <td>suave para aplicar pintura de dedos en las patas del animal</td></tr><tr><td>detergente</td><td></td><td></td> diluido <td>para</td></tr> limpieza <tr><td>desinfectante, por ejemplo, Meliseptol o etanol al 70%,</td> por <td>ejemplo, B.Braun</td><td></td><td>para desinfección</td></tr></tbody></table>

análisis de la marcha de deficiencias motoras dependientes de la edad en ratones con neurodegeneración

Gait Analysis of Age-dependent Motor Impairments in Mice with Neurodegeneration

Pruebas de comportamiento motor se utilizan comúnmente para determinar la relevancia funcional de un modelo de roedor y probar recién desarrollado tratamientos en estos animales. Específicamente, el análisis de la marcha permiten recuperación enfermedad fenotipos relevantes que se observan en pacientes humanos, especialmente en las enfermedades neurodegenerativas que afectan a motor habilidades tales como la enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Alzheimer (EA), amiotrófica esclerosis lateral (ELA) entre otros. En los primeros estudios en esta línea, la medición de parámetros de marcha era laborioso y dependía de factores que eran difíciles de controlar (por ejemplo, velocidad, corriente funcionamiento continuo). El desarrollo de sistemas de representación (VPI) en plano ventral hecho factible para realizar el análisis de la marcha a gran escala, haciendo este método una herramienta útil para la evaluación de la conducta motora en roedores. Aquí, presentamos un protocolo detallado de cómo utilizar el análisis de la cinemática de la marcha para examinar la progresión depende de la edad del déficit motor en modelos de ratón de la neurodegeneración; líneas de ratón con disminución de los niveles de endophilin, que daños neurodegenerativos aumenta progresivamente con la edad, se utilizan como ejemplo.

Para ilustrar el uso de análisis de la cinemática de la marcha, hemos realizado análisis de la marcha en ratones C57BL/6J WT con avance de edad, así como varias líneas mutantes de endophilin, mediante instrumentación disponible en el mercado y el software (consulte la tabla de Materiales). En esta configuración, una cámara de alta velocidad en una cinta transparente registra el funcionamiento de un ratón (figura 1A). El software reconoce ento...

En este estudio, se demuestra el uso del análisis cinemático de la marcha en plano ventral de imágenes para monitorear los cambios sutiles en la coordinación motora, así como la progresión de la neurodegeneración con edad en modelos de ratón (por ejemplo, endophilin mutante avanzada base líneas de ratón).

Análisis de la marcha de deficiencias motoras dependientes de la edad en ratones con neurodegeneración

Motor behavior tests are commonly used to determine the functional relevance of a rodent model and to test newly developed treatments in these animals. ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación sobre el envejecimiento y la neurodegeneración, como el inicio y la progresión de las anomalías motoras y de la marcha con la edad y, en particular, en modelos de ratón de enfermedades neurodegenerativas. El resultado de este estado se puede traducir en una comprensión mucho mejor de las deficiencias motoras en pacientes con enfermedades neurodegenerativas, por ejemplo, la enfermedad de Parkinson o las ataxias. La principal ventaja de utilizar el análisis de la marcha basado en vídeo es que permite estudiar tanto las deficiencias motoras sutiles como las graves en modelos de neurodegeneración en ratones.Comience por determinar el estado de salud de cada animal examinándolo de cerca y pesándolo en una balanza. Aplica suavemente pintura roja para los dedos en las patas del animal con un pincel. Coloca al animal en una jaula limpia y de repuesto mientras se seca la pintura.A continuación, configure la velocidad de la cinta de correr en el panel superior derecho del aparato. Luego, coloque al animal en la cámara de prueba y cúbralo con un paño oscuro para permitir que cada animal se adapte durante uno o dos minutos. Encienda la luz en la cámara de prueba girando el interruptor giratorio de la luz de la cinta de correr a la posición de encendido.Abre un poco la tapa para que puedas observar al animal durante la tarea. Ponga en marcha la cinta de correr durante aproximadamente medio segundo para advertir al animal que la tarea está a punto de comenzar. Gire el interruptor giratorio de la caminadora hacia adelante para iniciar la caminadora.A continuación, haga clic en el botón Grabar del software del generador de imágenes. Una vez que el animal corra de manera estable, registre durante al menos cinco segundos antes de detener la cinta de correr. Detenga la grabación haciendo clic en Detener en el software del generador de imágenes y vuelva a girar el interruptor giratorio de la cinta de correr a la posición de apagado.A continuación, haga clic en el botón Editar en el software del generador de imágenes para abrir un menú en el que se puede establecer el punto de inicio y final de la sección de video. Navegue por el video usando el control deslizante en la parte inferior de la pantalla. Para seleccionar el punto de tiempo actual como punto de inicio o finalización, haga clic en Desde número de fotograma y Hasta, respectivamente.Asegúrese de que la sección contenga al menos siete pasos por pata o catorce pasos en total del animal corriendo de manera estable a una velocidad constante. Finalmente, ingrese la identificación del animal, la fecha de nacimiento, el peso y el sexo. Guarde los datos en la ubicación deseada en la computadora o servidor.El principio del análisis de la marcha basado en vídeo es medir el área de la pata en contacto con la superficie a lo largo del tiempo para cada pata individual. Muchos parámetros de la dinámica de la marcha y la postura se pueden extraer de los videos grabados, por ejemplo, el tiempo de balanceo, el tiempo y la anchura de la postura, la longitud de la zancada y la frecuencia. Otras características de la marcha, como el coeficiente de ataxia o la variabilidad del ángulo de paso, pueden calcularse a partir de las mediciones primarias.Comience el análisis de video iniciando el software de análisis y haciendo clic en Seleccionar carpeta de estudio para seleccionar la carpeta con los videos grabados. Seleccione un video y haga clic en Ir.Utilice la función de redibujar para seleccionar el área donde se está ejecutando el mouse. Tenga en cuenta que esta sección solo debe contener el mouse y el fondo blanco.A continuación, introduzca valores en los cuadros de longitud y anchura para cambiar la máscara que excluye el área roja alrededor del hocico del animal para su análisis. Ajusta los controles deslizantes, filtra el ruido y filtra el pelaje y las manchas oscuras para optimizar la huella de la pata en blanco y negro. Establezca el control deslizante de ruido del filtro en 800 a 950 para animales negros y en 700 a 800 para animales marrones o blancos, según el color exacto del pelaje del animal, y seleccione Aceptar.A continuación, seleccione un vídeo que haya pasado el primer ajuste y seleccione la función Ir para iniciar el análisis del vídeo. A continuación, seleccione un video analizado y haga clic en Ir.Tenga en cuenta que ahora se puede ver el área de la huella de la pata en contacto con el cinturón a lo largo del tiempo para cada pata separada. Para comparar el vídeo original y la huella de pata calculada para el área seleccionada, seleccione la función Reproducir vídeo.Para corregir pequeños errores, utilice la opción Corregir, Conectar o Eliminar. Utilice la opción Correct para eliminar una señal incorrecta. Haga clic una vez para ampliar el área relevante y marque el borde izquierdo del objeto que desea eliminar con un segundo clic y el borde derecho con el tercer clic.Utilice la opción Conectar para combinar dos señales. Haga clic una vez para acercar el área relevante y haga doble clic en el centro de los dos objetos para combinar. Utilice la opción Eliminar para eliminar completamente los puntos de tiempo del análisis.Haga clic una vez para acercar el área correspondiente y marque el borde izquierdo del área que desea eliminar con el segundo clic y el borde derecho con el tercer clic. A continuación, seleccione Siguiente extremidad para continuar a través de las cuatro extremidades. Tenga en cuenta que, después de hacer clic en Siguiente extremidad después de la última pata, el software completa el análisis y muestra los resultados del animal en cuatro pantallas.Por último, una vez analizados todos los vídeos de un experimento, seleccione todos los vídeos y haga clic en Reorganizar resultados para exportar los resultados. Se calculan alrededor de 50 parámetros de marcha y se enumeran en el archivo exportado. Ordene el resultado por grupo, edad y velocidad de carrera, y analice todas estas condiciones de forma independiente.En el análisis de la marcha en ratones de tipo salvaje con edad avanzada, los resultados indicaron que la postura con el ancho normalizado del animal no cambia con la edad avanzada. Sin embargo, el doble soporte de las extremidades traseras y la carga de las extremidades aumentan con la edad en los animales de tipo salvaje. Además, mientras que todos los animales probados pueden correr a 30 metros por segundo en un mes, los mutantes endofilinos desarrollan déficits de carrera a medida que envejecen.Además, el ritmo de la marcha se ve alterado en los mutantes endofilinos. Por ejemplo, el tiempo de propulsión disminuye en los mutantes endofilinos a medida que los ratones envejecen. Al intentar el procedimiento, es importante recordar que el paso más crítico es la grabación del video original.Todos los análisis posteriores dependen de videos de buena calidad. El análisis de la marcha es un método útil para categorizar la marcha y el comportamiento motor en modelos murinos de neurodegeneración. Sin embargo, algunos aspectos de la conducta motora, por ejemplo, la fuerza muscular, no se evalúan adecuadamente con este método.Pero, por lo tanto, un comando que complementa el análisis de la marcha basado en video con una batería de otras pruebas de comportamiento motor, como la fuerza de agarre y la marcha con haz. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar el análisis de la marcha en modelos de ratón que desarrollan deterioro motor con el envejecimiento.

gait-analysis-age-dependent-motor-impairments-mice-with

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Los déficits en la coordinación motora fina puede ser evaluada con la prueba de barra de equilibrio. Desempeño en la viga se cuantifica mediante la velocidad a la que se recorre la viga y el número de veces que el ratón se desliza sobre la viga.

Evaluación del equilibrio del motor y la coordinación en ratones utilizando la barra de equilibrio

En este video, describimos el procedimiento de prueba de pisada y el análisis relacionado para evaluar la marcha y la coordinación motora en ratones.

Evaluación de la marcha mediante el análisis de la huella: un método para probar la coordinación motora en ratones

Análisis de la cinemática de la marcha en el plano sagital obtiene información muy precisa acerca de cómo se ejecuta el movimiento. Se describe la aplicación de estas técnicas para identificar los déficits de marcha para los ratones sometidos a desmielinización autoinmune mediada. Estos métodos pueden usarse para caracterizar los déficits de paso para otros modelos de ratón con locomoción deteriorada.

Análisis cinemático de la marcha de plano sagital en ratones C57BL/6 sometidos a MOG35-55 inducida por encefalomielitis Autoinmune Experimental

La evaluación precisa de la respuesta al dolor en un modelo animal neuropático es fundamental investigar la patofisiología del dolor enfermedades y desarrollar nuevos analgésicos. Presentamos un método sensible y objetivo para determinar la función sensorial del roedor hind de la pata por un sistema de análisis automatizado de la marcha.

Análisis de la marcha automática en ratones con lesión de la constricción crónica

El análisis de huellas es una alternativa de bajo costo a los programas de análisis de marcha digitalizados para investigadores que cuantifican las anomalías del movimiento en ratones. Debido a su velocidad, simplicidad y potencial longitudinal, es ideal para la fenotipado conductual de modelos de ratón.

Análisis de la gait de bajo costo para el fenotipado conductual de modelos de ratón de enfermedad neuromuscular

El análisis automatizado de la marcha es una herramienta factible para evaluar la recuperación funcional en modelos de roedores de lesión del nervio periférico y lesión por contusión de la médula espinal. Si bien sólo se requiere una configuración para evaluar la función locomotora en varios modelos experimentales, el ajuste meticuloso de software duro y suave y el entrenamiento de los animales es muy importante.

Análisis automatizado de gaita para evaluar la recuperación funcional en roedores con daño de contusión de nervio periférico o médula espinal

Aquí describimos el sistema RatWalker, construido mediante el rediseño del aparato MouseWalker para adaptarse al aumento de tamaño y peso de las ratas. Este sistema utiliza reflexión interna total frustrada (FTIR), captura de video de alta velocidad y software de análisis de acceso abierto para rastrear y cuantificar los parámetros de la marcha.

Aplicación del sistema RatWalker para el análisis de la marcha en un modelo genético de ratas de la enfermedad de Parkinson

Este manuscrito presenta un conjunto de pruebas conductuales altamente reproducibles para validar un modelo de ratón con síndrome de Angelman.

Caracterización conductual de un modelo de ratón con síndrome de Angelman

Se proporciona una tubería experimental para describir cuantitativamente el patrón locomotor de ratones que caminan libremente utilizando la caja de herramientas MouseWalker (MW), que va desde grabaciones de video iniciales y seguimiento hasta análisis posteriores a la cuantificación. Se emplea un modelo de lesión por contusión de la médula espinal en ratones para demostrar la utilidad del sistema MW.

Uso del MouseWalker para cuantificar la disfunción locomotora en un modelo de ratón de lesión de la médula espinal

El estudio actual describe una prueba de comportamiento motor fino para examinar los déficits motores en modelos de roedores, incluida la rata TgF344-AD, utilizando el aprendizaje automático.

Una tarea de motricidad fina para estudiar la cinemática articular en un modelo preclínico de enfermedad neurodegenerativa

Aprende análisis cinemático de la marcha para estudiar alteraciones motoras en modelos murinos de neurodegeneración. Este método permite detectar cambios sutiles en la coordinación y evaluar la progresión de enfermedades como el Parkinson.

Análisis de la marcha de deficiencias motoras dependientes de la edad en ratones con neurodegeneración

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