Name: Métodos para el estudio de la regeneración en Stentor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Aprende métodos para cultivar Stentor coeruleus e inducir su regeneración mediante fragmentación celular y tratamiento con sacarosa. Esta técnica permite estudiar la biología celular y la cicatrización de heridas a nivel de célula única.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de NIH R01 GM113602 (WFM) y la NSF 1144247 (AL). Reconocemos Mark Slabodnick y Natalie Kirkland para el desarrollo de las versiones iniciales de algunos de estos protocolos y debates informativos. Agradecemos a Karina Perlaza y Greyson Lewis para la lectura crítica del manuscrito.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Cultivo de Stentor presenta una serie de desafíos. En primer lugar, para realizar experimentos que requieren grandes cantidades de células, es necesario mantener un gran número de culturas de Stentor , como las culturas se vuelven insalubres cuando Stentor concentración excede 20 células/mL. En segundo lugar, los organismos que pueden contaminar cultivos Stentor a menudo dividen más rápido que Stentor y aplastar la cultura (un contaminante común es rotíferos). Por lo tanto, es necesario inspeccionar periódicamente la cultura bajo un microscopio y eliminar los contaminantes. En ocasiones, una nueva cultura debe iniciar a partir de un pequeño número de células manualmente rescatado de un cultivo contaminado. Esto aumenta el tiempo necesario para mantener cultivos sanos de Stentor . En tercer lugar, ampliar una sola celda en una cultura de 400 mL requiere al menos un mes porque el ciclo celular de Stentor es 3-5 días. En cuarto lugar, a diferencia de otros modelo ciliates, Stentor raramente en forma del quiste y se puede congelar.
Un aspecto importante del cultivo de Stentor es la selección de un organismo de alimento apropiado. Previamente fueron descritos varios métodos para el cultivo de Stentor . Uno de ellos sugiere para utilizar leche descremada para cultivar bacterias que se alimentan entonces Stentor. Esta técnica es eficaz en cultivo Stentor; sin embargo, la aplicación de técnicas genómicas requiere muestras puras para evitar confusión de Lee genómico de organismos de la comida indefinido. Utilizando el protocolo actual, Stentor pueden cultivarse en masa y porque su alimento, Chlamydomonas, se ha secuenciado, la presencia de contaminación genómica del organismo de alimentos puede ser detectada y controlada para. Por razones desconocidas, tártaro tenía que reponer sus stocks por regresar a donde él encontró Stentor antes. Con el protocolo actual, hemos podido mantener Stentor durante años.
Experimentos de regeneración con Stentor están generalmente sencillos, pero hay algunos detalles importantes a tener en cuenta. Con respecto a la sección 2, corte Stentor células a la mitad pueden ser dominadas en minutos. Dominar procedimientos de microcirugía más avanzados de Stentor puede requerir una semana de práctica. Mientras que realizar un tratamiento de sacarosa o urea (sección 3), si al principio de la proyección de imagen la mayoría de las células todavía tiene sus bandas membranellar, aumentar el tiempo de incubación de 10-30 s para cuando se realiza tratamiento de sacarosa a continuación. No aumentan el tiempo de tratamiento con sacarosa más allá de 3 minutos de incubación ya que resultará en la muerte celular.
Proyección de imagen de Stentor regeneración requiere métodos de imagen grandes células durante largos períodos de tiempo. El método de proyección de imagen detallado en la sección 4 puede ser utilizado con un microscopio vertical. Si en cambio se dispone de un microscopio invertido, las células pueden colocarse en un portaobjetos o cubreobjetos en pequeñas cámaras. Un método consiste en crear una cámara de vaselina y cubierta con otro cubreobjetos para evitar la evaporación. Alternativamente, se puede hacer una cámara de una célula individual haciendo un agujero con una perforadora de tamaño deseado en un 1 x 1 cm2 de espaciador de silicio (tabla de materiales), colocar el separador en un cubreobjetos, poner las células en la cámara de y que cubre la cámara con otro cubreobjetos. Cuando la proyección de imagen, si no en la orientación correcta para observar los rasgos característicos de cada etapa de la regeneración de Stentor , golpee la placa firmemente para hacer el contrato de la célula. Ver la célula extender para identificar la etapa de regeneración (extensión completa lleva unos 45 s). Si la celda está todavía en la orientación incorrecta, repita el tapping. Las imágenes que se muestra en la figura 1 y figura 6 fueron tomadas por un microscopio de estereo zoom; sin embargo, se pueden realizar todos los experimentos detallados con un 5 X estéreo microscopio de disección.
Otro desafío además de cultivo y proyección de imagen Stentor es el seguimiento de la regeneración, específicamente la cantidad de tiempo necesario para identificar las etapas. Si la regeneración celular es perfectamente orientado con la región del primordio oral claramente visible, la identificación de la etapa tarda unos segundos. A veces, sin embargo, la célula de Stentor es en una orientación de prevención de la asignación clara de la etapa de regeneración, teniendo así más tiempo para identificar. La importante cantidad de tiempo requerido para la etapa las células regeneración individuales podrían retrasar la cuantificación de todas las células regeneradoras, disminuyendo la precisión temporal de staging y requiriendo el observador esperar y volver a la imagen la celda después de que se ha trasladado a una nueva orientación. Por lo tanto, este experimento es tiempo y mano de obra. Por estas razones, sería altamente deseable para el desarrollo de métodos automatizados para detectar las células de Stentor y la asignación de las etapas de regeneración de datos de microscopia video. Estos también permitiría más experimentos reproducibles, aumenta el tamaño de la muestra, y la eliminación de los prejuicios humanos.
La aparición de métodos altamente sensibles de genómica y proteómica ha comenzado a poner los estudios de las células en alcance. Para tales análisis unicelular, el tamaño gigante de una célula de Stentor , es un tema de prueba conveniente para los experimentos de prueba de concepto. Para tales experimentos a ser posible, cultivo de Stentor es fundamental, y así los métodos descritos aquí deben desempeñar un papel en el desarrollo de las técnicas más avanzadas de unicelular.

Las células no son simples bolsas de enzimas, pero algo muy complejas máquinas cuyos componentes son cuidadosamente escala con el tamaño correcto y dispuestos en posiciones bien definidas. La morfogénesis de las células individuales representa un proceso clave en biología celular y del desarrollo, pero su mecanismo molecular es desconocido1,2. Mientras que algunas células cultivadas se asemejan a manchas, organismos unicelulares pueden han extremadamente complicado arquitecturas, ejemplificadas por los complejos patrones corticales en ciliados3,4.
Quizás el ejemplo más extremo de una célula altamente estructurado es Stentor coeruleus, un gigante heterotrichous ciliados distantemente relacionados con Tetrahymena y Paramecium. Stentor es 1 mm de largo y está cubierta con más de 100 bandas longitudinales de pigmento azul que se alternan con hileras de cilios organizados por paralelo pilas de cintas de microtúbulos que la longitud de toda la célula. La célula es trompeta en forma (figura 1), con una banda de membranellar y un aparato bucal (OA) en su extremo anterior y un holdfast que une la célula al sustrato en su extremo posterior. Además de la polaridad antero-posterior claro, la célula también muestra un patrón distintivo quiral, que espaciamiento entre hileras ciliares gradualmente aumenta en sentido horario. Esto se traduce en una discontinuidad donde la fila más estrecha se encuentra con la fila más amplia y en esta región de la superficie de la célula, conocido como el lugar geométrico del contraste de la raya, puede inducir la formación de la segunda serie de estructuras de extremo anterior cuando injertado en otro celular5, lo que es formalmente equivalente a organizador de Spemann. Por lo tanto, todos los procesos claves de la biología del desarrollo tienen sus análogos en Stentor: axiation, formación de patrones e inducción. En un embrión, estos procesos son conducidos por las diferencias de destino entre las diferentes células, pero en Stentor, debe ser conducidos por las diferencias de destino entre las diferentes regiones dentro de una sola célula. Lo que define las diferencias entre las regiones dentro de Stentor es un misterio.
Si cualquier parte de Stentor es cortado, la pieza que faltaba de la célula puede regenerar para producir una célula normal en cuestión de horas. Si una célula es cortar por la mitad, o incluso en piezas mucho más pequeñas, cada pieza se reorganiza en una célula de aspecto normal pero más pequeña y restaura la proporcionalidad adecuada entre partes de la célula6,7. Pequeñísimos fragmentos, 1/64th el tamaño de la célula original, son capaces de regenerarse en una celda pequeña pero normalmente proporcionada y luego crece al tamaño completo6. Stentor presenta así una oportunidad única para estudiar los mecanismos de organelo tamaño escalado y celular regulación del crecimiento mediante métodos quirúrgicos que se aplican generalmente a nivel de tejidos u organismos enteros.
Una de las propiedades de Stentor que le permite regenerarse de una amplia gama de intervenciones quirúrgicas es que contiene un macronucleus noduladas sola (figura 1) con unos 50.000 copias del genoma entero8. Como un fragmento de la célula contiene al menos un nodo macronuclear, tiene la capacidad de regenerar completamente. Otra propiedad subyace la capacidad de regeneración de Stentores su prodigiosa capacidad de cicatrización de heridas. Aunque muchos tipos de células son capaces de curar sus heridas9, Stentor es capaz de recuperarse de una extraordinaria gama de perturbaciones físicas. Un ejemplo de recuperación de Stentor de una perturbación drástica, junto con los métodos para la visualización de flujo citoplásmico en Stentor10 fueron divulgados previamente. Estos métodos permiten el estudio de cómo hería y subsecuente regeneración afectan el estado físico del citoplasma.
Stentorde gran tamaño, capacidad de regeneración extraordinaria y el hecho que se manifiesta en muchos de los fenómenos del desarrollo en embriones multicelulares (como los organizadores, axiation y patrones) atrajeron a muchos biólogos del desarrollo durante la vuelta del siglo pasado, incluyendo Caza Morgan de Thomas7. Durante los años 50 y años 60, enfoques microquirúrgicos demostraron una variedad sorprendente de procesos regenerativos y morfogenéticos en este solo-celled organismo11. Sin embargo, Stentor ha sido desarrollado como un sistema modelo de biología molecular sólo recientemente. Durante los últimos años, el genoma de Stentor fue secuenciado y ensamblado8, y el método para perturbar la expresión génica mediante la alimentación de RNAi fue desarrollado12.
Una de las razones que Stentor fue convertido en un organismo modelo para la biología molecular moderna sólo recientemente fue la dificultad de crecimiento grandes culturas debido a su largo ciclo celular (3 a 5 días). Sin embargo, los métodos genómicos y proteómicos modernos requieren menos material que utilizaron a, y el volumen de una sola célula de Stentor es suficiente para estos métodos, incluso sin recurrir a métodos ultrasensibles que se desarrollaron para el análisis de solo células que son mucho más pequeñas que Stentor. Sección 1 del protocolo detalla el procedimiento para el establecimiento de una cultura grande de una sola célula de Stentor . El mismo enfoque puede utilizarse para establecer una cultura grande de un fragmento de células obtenida por corte de una célula. Sección 1 también proporciona las directrices para mantener cultivos sanos de Stentor durante largos períodos de tiempo. Sección 2 del protocolo proporciona la metodología para inducir la regeneración de la célula por las células de corte manualmente con una aguja de vidrio. Artículo 3 del Protocolo se dedica a dos métodos de inducir la regeneración de estructuras celulares específicas (membranellar banda y oral aparato): tratamiento de las células con sacarosa o urea conduce al vertimiento de estas estructuras, seguidas por su regeneración. Artículo 4 del protocolo detalla un método para la proyección de imagen de células regeneradoras durante largos períodos de tiempo. Sección 4 termina con la descripción de las etapas de la regeneración y sugerencias sobre el análisis de la dinámica de la regeneración.

<table><tbody><tr><td>Stentor coeruleus cultivo vivo</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>131598</td><td></td></tr><tr><td>Chlamydomonas reinhardtii en agar</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>152040</td><td></td></tr><tr><td>Agua de manantial pasteurizada, botella de 1 cuarto de galón</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>132458</td><td></td></tr><tr><td>Metilcelulosa, 1500 cP</td><td>Millipore Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Placa de vidrio Pyrex</td><td>Fisher Scientific</td><td>13748B</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidrio de boca ancha con tapón de rosca, 60 mL</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>715740</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente de vidrio de 2 tazas con tapa de vidrio</td><td>Pyrex</td><td>1095600</td><td></td></tr><tr><td>Material de lámina de silicona CultureWell Grace</td><td>Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga Posi-Click de 1,7 ml</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Cubierta</td><td>de vidrio Fisher finest</td><td>12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>TAP Medios de crecimiento, optimizados para cultivos Chlamydomonas</td><td>ThermoFisher</td><td>A1379801</td><td></td></tr><tr><td>Espaciador de silicona, lámina de silicona CultureWell, 0,25 mm de grosor/13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Vaselina, vaselina, espectro blanco</td><td></td><td>P1037</td><td></td></tr><tr><td>Tubos capilares de vidrio de borosilicato. OD: 1,2 mm, ID: 0,9 mm, longitud: 10 cm.</td><td>Sutter Instrument</td><td>B120-90-10</td><td></td></tr><tr><td>Tirador de agujas P-87</td> Microscopio estereoscópico <td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiozoom V16, microscopio estereoscópico con zoom</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

métodos para el estudio de la regeneración en stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Las células deben ser capaces de regenerar sus partes para recuperarse de perturbaciones externas. El unicelular ciliado Stentor coeruleus es un organismo modelo excelente para el estudio de la cicatrización y regeneración de la célula siguiente. El genoma de Stentor se convirtió recientemente, junto con métodos de biología molecular moderna, como RNAi. Estas herramientas hacen posible estudiar sola célula regeneración a nivel molecular. La primera sección del protocolo cubre Stentor establecer los cultivos celulares de las células o fragmentos celulares, junto con las directrices generales para mantener culturas de Stentor . Cultivo de Stentor en grandes cantidades permite el uso de herramientas valiosas como bioquímica, secuenciación y espectrometría de masas. Las secciones subsiguientes del protocolo cubren distintos métodos para inducir regeneración en Stentor. Cortar manualmente las células con una aguja de vidrio permite estudiar la regeneración de partes grandes de la célula, mientras que el tratamiento de células con sacarosa o urea permite estudiar la regeneración de estructuras específicas, situada en el extremo anterior de la célula. Se proporciona un método para proyección de imagen las células regeneración individuales, junto con una rúbrica de escenificando y analizar la dinámica de la regeneración. Todo el proceso de regeneración se divide en tres etapas. Al visualizar la dinámica de la progresión de una población de células a través de las etapas, se demuestra la heterogeneidad en el momento de la regeneración.

Stentor culturas han establecido y mantenido de células individuales o fragmentos celulares utilizando la sección 1 del Protocolo de forma fiable. Un ejemplo representativo de una cultura saludable grande se muestra en el Video 1.
El curso del tiempo de la regeneración se midió en Stentor utilizando el método de tratamiento de sacarosa para iniciar la regeneración que se describe en el paso 3.1, combinado con la proyección de imagen y el método de análisis discutidos en la sección 4 (figura 7). Esta trama indica que hay una propagación de una hora de duración en el tiempo por la población de células para alcanzar cualquier etapa particular. Este tipo de análisis permite el estudio de la heterogeneidad temporal en el proceso de regeneración en una población de regenerar las células.
El siguiente es un resumen de la programación de regeneración que se ha observado hasta el momento después de decenas de tratamientos de sacarosa (figura 4 y figura 6). Fase 1 es cuando las células Stentor ven como gotas de lágrimas sin ninguna banda de membranellar (esta etapa comienza inmediatamente después de lavado de sacarosa). Esta etapa dura de 3-6 h. fase 2 es cuando una banda de membranellar aparece y crece (3-6 h después de tratamiento con sacarosa). Esta etapa dura de 3-4 h. 3 etapa es cuando un primordio oral aparece en la parte posterior de la banda de membranellar (6-8 h después de tratamiento con sacarosa), y ambas estructuras se mueven hacia el extremo anterior de la célula. Esta etapa dura 1-2 h. Cuando la banda de membranellar y el aparato bucal alcanza el extremo anterior de la célula, esto indica la terminación de la regeneración. La célula ha adoptado forma de trompeta-como característica de Stentor . Las células fueron totalmente regenerado 8-9 h después de tratamiento con sacarosa.
<img alt="Diagrama de paramecio con banda membrallada, aparato oral, vacuola de alimentos, macronúcleo marcado." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1. Instantánea de Stentor. La banda de membranellar y el aparato bucal se muestra en el extremo anterior de la célula. La holdfast está en el extremo posterior de la célula. Macronucleus Stentor es noduladas. Un bien alimentados Stentor tiene vacuolas de alimentos verdes que contienen en su mayoría Chlamydomonas. Barra de escala es 0,5 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Configuración del microscopio de disección; portaobjetos de vidrio con espécimen de Stentor para observación en investigación biológica." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2. Instalación de corte de Stentor . Corte de la célula se realiza manipulando manualmente una aguja de vidrio mientras mira a la célula con un microscopio estéreo disección disponible comercialmente. El propósito del pañuelo de papel es proporcionar el fondo blanco para ver las células mejor. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Secuencia de microscopía de células en división, etiquetada A-F, que muestra etapas en el proceso mitótico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3. Instantáneas de Video ilustrando cómo cortar un Stentor con una aguja de cristal de 3. (A) A Stentor inmediatamente antes de que la aguja llegue a él. (B) un Stentor aprieta suavemente entre un portaobjetos de vidrio y aguja. (C) A había contratado Stentor reaccionan a la fuerza de la aguja. (D) A Stentor a cortar presionando suavemente en la pila con el lado de la aguja. (E) A Stentor ahora cortada en dos pero no separados. (F) dos fragmentos de Stentor . Barra de escala es 0,25 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Diagrama del proceso de regeneración de Stentor con pasos de choque de sacarosa/urea, tubos de centrífuga, etapas celulares." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4. Visualización esquemática de la sección 3 y sección 4 del Protocolo de. Se trata de un protocolo ilustrado para la realización de sacarosa o urea tratamiento y observación de la regeneración de la célula. El tiempo indicado en el panel inferior se mide desde el inicio de la máquina 1. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Configuración de microscopio de disección, placa puntual de 9 pocillos, análisis de reacción de microgotas, estudio óptico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5. La configuración para la observación directa o proyección de imagen de la regeneración con un microscopio vertical. En cada gota de μl 4 cuelgan de cubreobjetos, hay una célula en regeneración. Agua en los pozos de la placa punto limita la evaporación de las gotitas. Esta configuración permite después de la regeneración de varias celdas en paralelo. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Análisis de la estructura celular de la planta; imágenes de microscopio A-E; enfatizar las variaciones de la morfología celular." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Figura 6. Instantáneas de Stentor en cada etapa de la banda de membranellar y la regeneración del aparato oral. (A) etapa 1 se caracteriza por una forma de lágrima como celular y la ausencia de la banda de membranellar. (B) fase 2 se caracteriza por la aparición de la banda membranellar, una estructura de cilios que late continuamente. Bandas de Membranellar están marcados con líneas blancas discontinuas en paneles B - D. (C y D) etapa 3 es caracterizada por la aparición del primordio oral (marcado con una flecha). Primordio oral parece una invaginación en el extremo posterior de la banda de membranellar. El primordio oral entonces se moverá hacia arriba hacia la parte anterior de la célula para convertirse en el aparato bucal. (E) la regeneración se completa cuando la célula ha adoptado la característica Stentor con forma de trompeta, y el aparato bucal (marcado con una flecha) se ha ensanchado en el extremo anterior de la célula. Barra de escala es 0,25 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig6large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Gráfico de barras de distribución de etapas celulares, tiempo posterior al choque de sacarosa, que muestra cuatro etapas durante 9 horas." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig7.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> Figura 7. Apilados que muestra diagrama de caja como proporciones de células en todas las etapas de la regeneración después de tratamiento con sacarosa cambia con el paso del tiempo. La trama muestra heterogeneidad en el tiempo de las etapas de la regeneración dentro de una población de células regeneradoras. "Fin de reg." indica la finalización de la regeneración. El número de células: 28. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Vaso de precipitados con cultivo de algas verdes para estudio de fotosíntesis en experimento de laboratorio." src="/files/ftp_upload/57759/57759video1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Movie 1"> Video de 1. Ejemplo de una sana cultura de Stentor . Generalmente, si una cultura es concentrado, División de la cultura se recomienda. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video1.mp4" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)</a>
<img alt="Gota bajo microscopio; estudio de tensión superficial líquida; método de microscopía; análisis educativo." src="/files/ftp_upload/57759/57759video2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Movie 2"> Video 2. Desaceleración de Stentor con metilcelulosa. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video2.mov" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)</a>
<img alt="Imagen microscópica de una configuración microfluídica, destacando la posición de las gotas en un alambre delgado." src="/files/ftp_upload/57759/57759video3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Movie 3"> Video 3. Corte Stentor. Células individuales pueden ser cortadas manualmente en pedazos múltiples bajo un estéreo microscopio de disección presionando una aguja de vidrio a través de la célula. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video3.mov" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Problema con la cultura</td>
			<td>Posible solución</td>
			<td>Prevención de posibles</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cultura es abrumada por rotíferos u otros grandes organismos.</td>
			<td>Quitar tantos Stentor como sea posible en un nuevo plato de cultura. Luego lavar las células 3 veces.</td>
			<td>Lave bien Stentor cuando recibirlos, aun cuando compra de un proveedor comercial.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cultura es abrumada por hongos y otros organismos pequeños.</td>
			<td>Identificar una esquina donde hay menos Stentor. En esa zona, eliminar tanto los medios como sea posible sin la eliminación de muchos Stentor y agregue nueva PSW. Mezclar suavemente pero profundamente a representar los organismos invasores. Omitir la siguiente alimentación y Stentor come.</td>
			<td>Observar el cultivo regularmente y eliminar contaminantes pequeños mediante el intercambio de los medios de comunicación para fresco PSW.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor están poniendo encima de la otra.</td>
			<td>Partido de la cultura de modo que la concentración es de menos de 20 células/mL.</td>
			<td>Dividir las culturas más a menudo.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Células de Stentor de apareamiento.</td>
			<td>Alimentar cada 4 días, en vez de cada 5 días.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Cultura tiene un montón de material de desecho oscuro.</td>
			<td>Eliminar tanto el material oscuro, residuos de Stentor , como sea posible sin la eliminación de las células. Si Stentor se unen al material oscuro, pipeta hacia arriba y hacia abajo para liberar las células de Stentor de sus residuos y luego retire los medios de comunicación con los residuos sin la eliminación de las células. O, retire los Stentor y por consiguiente la alimentación menos.</td>
			<td>Alimentación Stentor 1 mL menos de alimento por cada 100 mL de la cultura.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aspecto saludable (vacuolated, hinchados o redondeados) Stentor.
</td>
			<td>Eliminar tanto los medios como sea posible sin la eliminación de muchas células de Stentor y Añadir nueva PSW.</td>
			<td>Intercambiar periódicamente los medios de comunicación.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1. Guía para el cultivo de Stentor.

El ciliado gigante, Stentor coeruleus, es un excelente sistema para estudiar la regeneración y cicatrización de heridas. Presentamos los procedimientos para establecer Stentor cultivos celulares de las células o fragmentos celulares, inducir la regeneración de las células de corte, químicamente inducir la regeneración de la banda membranellar y aparato bucal, proyección de imagen y análisis de células regeneración.

Métodos para el estudio de la regeneración en Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

El objetivo general de este protocolo es cultivar Stentor para su uso como organismo modelo para estudiar la regeneración a nivel de una sola célula. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular, como por ejemplo, cómo las células construyen estructuras a partir de partes discretas. Las principales ventajas de Stentor son que son células individuales que pueden regenerarse y que son lo suficientemente grandes como para realizar una cirugía.En general, la parte desafiante de este protocolo es que las personas están acostumbradas a trabajar con células como cultivos en lugar de como individuos. Comience buscando la placa de Petri que contiene muestras de Stentor bajo un microscopio estereoscópico utilizando luz oblicua con un aumento de 5X. Tenga en cuenta que las células Stentor exhiben una forma de trompeta cuando se unen a un sustrato.Mientras no están unidas, las células Stentor nadadoras tienen una apariencia menos extendida. Con una pipeta de un mililitro, transfiera las células individuales de Stentor al pocillo de una placa de vidrio que contenga al menos 100 microlitros de agua de manantial pasteurizada disponible comercialmente. A continuación, extraiga aproximadamente el 90% del agua del pozo sin retirar las células Stentor y añada 500 microlitros de agua de manantial pasteurizada fresca al pozo tres veces para lavar las células.Para alimentar las células, primero transfiera una alícuota de un mililitro de un cultivo de Chlamydomonas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros para centrifugar a 2.095 g durante tres minutos a temperatura ambiente. Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de agua de manantial pasteurizada para una segunda centrifugación, seguida de una resuspensión en 500 microlitros de agua de manantial pasteurizada. Si se necesita un cultivo clonal de Stenttor, transfiera 500 microlitros de medio acondicionado por cultivo a pocillos individuales de una placa puntual de vidrio y transfiera una célula de Stentor a cada pocillo de medio.Alimente cada cultivo de Stentor con cinco microlitros de las Chlamydomonas preparadas cada 48 horas y mantenga los cultivos en un área sombreada. Cuente el número de nuevas células de Stentor antes de cada alimentación y ajuste el volumen de Chlamydomonas administradas en consecuencia. Cada 96 horas, pipetee suavemente el medio de cultivo unas cuantas veces para separar el Stentor del menisco de cada pocillo y utilice una pipeta de un mililitro para aspirar cuidadosamente el medio de los pocillos sin extraer ninguna célula.Luego agregue 500 microlitros de medios acondicionados frescos a cada pocillo. Cuando el número de celdas en al menos un pocillo exceda las 20, agregue 20 mililitros de agua de manantial pasteurizada a un frasco de vidrio de boca ancha esterilizado en autoclave y separe con cuidado las celdas Stentor del fondo de cada pocillo como se demuestra. Recoja todas las células de Stentor con una pipeta de un mililitro y transfiera suavemente las células al frasco de vidrio.Agregue agua de manantial pasteurizada fresca al frasco cada 48 horas para mantener la densidad de Stentor a aproximadamente 20 células por mililitro y alimente las células de Stentor con 200 a 1,000 microlitros de Chlamydomonas preparadas. Cuando el volumen de cultivo alcance aproximadamente el 90% de la capacidad del frasco, transfiera todo el contenido del frasco a un recipiente de vidrio de dos tazas alimentando los cultivos de Stentor de alto volumen con dos mililitros de Chlamydomonas preparadas por cada 100 mililitros de cultivo y agregando agua de manantial pasteurizada al cultivo cada cuatro o cinco días para mantener la densidad de Stentor en aproximadamente 20 células por mililitro. Una vez a la semana, inspeccione los cultivos bajo un microscopio de disección 5X en busca de rotíferos, hongos y otros crecimientos utilizando una pipeta de un mililitro para eliminar cualquier microorganismo contaminante junto con cualquier célula Stentor de forma anormal e incolora.Divida el cultivo cuando el recipiente de vidrio esté lleno en un 90%, agregando 25 mililitros de agua de manantial pasteurizada al cultivo y usando una pipeta de 50 mililitros para separar el Stentor del vidrio como se demuestra. A continuación, traslade aproximadamente el 50% del cultivo a un nuevo recipiente de vidrio de dos tazas. Para inducir la regeneración por fragmentación celular, primero use un extractor de agujas para hacer varias agujas a partir de tubos capilares.A continuación, recoja un Stentor sano con una forma de trompeta definida, un color azul verdoso vibrante y sin vacuolas grandes en una gota de dos microlitros. Coloque la gota en un portaobjetos y ralentice el movimiento del Stentor con dos microlitros de metilcelulosa al 4%. Coloque la gota bajo un microscopio de disección y sostenga la aguja de vidrio lo más paralela posible a la superficie de corte para evitar que la aguja se rompa.Presione suavemente el Stentor contraído con el costado de la aguja para dividir el extremo anterior de la célula del extremo posterior de la célula. Confirme que ambos fragmentos tienen al menos un nodo macronuclear y mueva los fragmentos a pocillos individuales de una placa puntual de vidrio. Para inducir la regeneración de la banda llar y del aparato oral, transfiera de 30 a 60 células Stentor en un mililitro de medio de cultivo a un tubo de microcentrífuga y utilice una pipeta de 200 microlitros para recoger todas las células del tubo en una sola extracción de volumen de 125 microlitros.Dispense las células en un tubo que contenga 500 microlitros de sacarosa al 25% recién preparada y ponga en marcha un cronómetro. Después de girar las células en el tubo en la rejilla durante un minuto, recoja todas las células en una sola extracción de 200 microlitros y sostenga las células en la punta de la pipeta hasta que el cronómetro muestre dos minutos de tratamiento con sacarosa. A continuación, expulse el Stentor en un tubo de microcentrífuga que contenga un mililitro de agua de manantial pasteurizada durante tres lavados de centrifugado.Para obtener una imagen de la regeneración, agregue 100 microlitros de agua de manantial pasteurizada en un pocillo de una placa de vidrio y use una punta de pipeta de 20 microlitros para recolectar una célula Stentor en cuatro microlitros de medio de cultivo. Deposite la gota en el centro de un cubreobjetos de 22 por 22 milímetros cuadrados y coloque cuatro gotas más alrededor de la gota anterior. Invierta el cubreobjetos y colóquelo suavemente sobre el pozo con agua de manantial pasteurizada.A continuación, obtenga imágenes de las células en regeneración bajo un microscopio óptico con la resolución de tiempo adecuada. Durante la primera etapa de la regeneración, que ocurre inmediatamente después del lavado de sacarosa, las células de Stentor parecen lágrimas sin ninguna banda membrana. Después de tres a seis horas, aparece una banda membranar.Esta etapa, la segunda etapa, dura otras tres o cuatro horas. La tercera etapa ocurre cuando aparece un primordio oral en el extremo posterior de la banda membrana llar y ambas estructuras comienzan a moverse hacia el extremo anterior de la célula. Esta etapa tiene una duración de una a dos horas.Cuando tanto la banda membrana llar como el aparato oral alcanzan el extremo anterior de la célula, la regeneración se completa y la célula habrá adoptado la característica forma de trompeta de Stentor. Represente el porcentaje de celdas en cada etapa de regeneración en cada punto de tiempo en un diagrama de caja apilado. La medición del tiempo de regeneración después del corte celular y el tratamiento con sacarosa revela una dispersión de una hora en el tiempo que tarda la población de células en alcanzar cualquier etapa particular, lo que demuestra la heterogeneidad temporal del proceso de regeneración dentro de una población dada de células en regeneración.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar Stentor e iniciar su regeneración y cuantificarla. Al intentar este procedimiento, es importante recordar ser paciente. Stentor tarda de tres a cinco días en dividirse en cultivo y la identificación de las etapas de regeneración de Stentor requiere práctica.Esta técnica allanará el camino para que los investigadores de biología celular exploren la regeneración en Stentor.

methods-for-the-study-of-regeneration-in-stentor

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Un modelo atractivo para el estudio de la diferenciación de células madre en un animal vivo es el gusano planaria. La regeneración se estudia por medio de experimentos sencillos que la amputación se realiza fácilmente en un laboratorio básico y son susceptibles de (farmacológicos y...

Los ensayos farmacológicos y genéticos funcionales para manipular la regeneración de la planaria Japonica Dugesia</em

Un método eficaz para el injerto tejido de tamaño definido y constante entre planaria se describe. También se incluye una descripción de cómo la técnica de inmovilización utilizado para el trasplante se puede adaptar, en conjunción con los escudos de plomo, para la irradiación parcial de animales vivos.

La inmovilización de las planarias, irradiación parcial, y el trasplante de tejido

Se describe un modelo de implantación de un stent en la arteria carótida del ratón. En comparación con otros métodos similares, este procedimiento es muy rápido, simple y accesible, que ofrece la posibilidad de estudiar de una manera conveniente la reacción de la pared vascular a diferentes stents liberadores de fármacos y los mecanismos moleculares de la restenosis.

Un modelo murino de la implantación de un stent en la arteria carótida para el Estudio de la reestenosis

El ciliado gigante Stentor coeruleus es un sistema clásico para estudiar la regeneración y la cicatrización de heridas en células individuales. Al obtener imágenes de las células de Stentor simultáneamente con aumento bajo y alto, es posible medir los flujos citoplasmáticos antes, durante y después de la herida.

Visualización del flujo citoplasmático durante la cicatrización de heridas unicelulares en Stentor coeruleus

Debido a que muchos modelos de pez cebra de enfermedades neurológicas y no neurológicas se estudian en los peces adultos en lugar de el embrión / larvas, hemos desarrollado un ensayo cuantitativo regenerativa línea lateral que se puede aplicar a modelos de enfermedad de pez cebra adultos. El ensayo implicó resolución en el neuromast 1) y 2) los niveles de células cabello individual.

Un ensayo para la línea lateral de regeneración en adultos de pez cebra

Aquí se presenta un protocolo que se basa en rebanadas de la médula espinal cultivadas en matrices de electrodos múltiples para estudiar la regeneración funcional de conexiones propioespinal in vitro.

La investigación de la regeneración funcional en organotípicos médula espinal Co-culturas cultivadas en Arrays Multi-electrodos

En este estudio se demuestra un protocolo de video paso a paso de la resección apical. La resección apical es un abordaje quirúrgico recientemente destacado en la investigación de la regeneración cardíaca en mamíferos. Este estudio puede promover la aplicación de la resección apical como metodología estándar en la investigación del mecanismo subyacente a la regeneración del corazón.

Modelo apical Resección ratón para el Estudio de la regeneración del corazón de mamíferos Temprana

Aquí demostramos cómo inducir y monitorizar la regeneración en la anémona de mar estrellada Nematostella vectensis, un antozoo cnidario modelo.  Demostramos cómo amputar y categorizar la regeneración utilizando un sistema de estadificación morfológica, y utilizamos este sistema para revelar un requisito para la autofagia en la regeneración de estructuras de pólipos.

Inducir completa Pólipo regeneración de la aboral Physa de la anémona de mar Starlet Vectensis Nematostella

Presentamos un protocolo para la caracterización de la motilidad y el comportamiento de una población de células de cien micras a milímetros utilizando microscopía de campo brillante y seguimiento celular. Este ensayo revela que Stentor coeruleus pasa por cuatro fases conductualmente distintas al regenerar un aparato oral perdido.

Análisis de los patrones de motilidad del estentor durante y después de la regeneración del aparato oral mediante el seguimiento celular

Aquí describimos el flujo de trabajo para usar el sistema TetON para lograr la expresión génica específica del tejido en la aleta de la cola del pez cebra adulto en regeneración.

El uso del Sistema de Teton para estudiar los mecanismos moleculares de la regeneración de pez cebra

Aprende métodos para cultivar Stentor coeruleus e inducir su regeneración mediante fragmentación celular y tratamiento con sacarosa. Esta técnica permite estudiar la biología celular y la cicatrización de heridas a nivel de célula única.

Métodos para el estudio de la regeneración en Stentor

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