Name: Microscopía de fluorescencia de la hoja de luz para capturar imágenes de 4 dimensiones de los efectos de la modulación de la tensión de esquileo en el corazón de pez cebra en desarrollo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Aprende a reconstruir corazones en desarrollo de Danio rerio mediante microscopía de hoja de luz 4D y algoritmos computacionales. Este método permite visualizar la activación de Notch por tensión de esquileo en cardiogénesis.

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Los autores desean agradecer a William Talbot de la Universidad de Stanford para proporcionar al ser humano Nrg1 cDNA y Deborah Yelon de UCSD para proporcionar la WEA mutantes. Los autores también desean agradecer a Cynthia Chen por ayudar con la adquisición de la imagen. Este estudio fue apoyado por subvenciones de NIH HL118650 (a T.K. Hsiai), HL083015 (a T.K. Hsiai), HD069305 (a Carolina del norte Chi y T.K. Hsiai.), HL111437 (a T.K. Hsiai y Chi de Carolina del norte), HL129727 (a T.K. Hsiai), T32HL007895 (a R.R. Sevag Packard), HL 134613 (a V. Messerschmidt) y Universidad de Texas sistema estrellas financiación (J. Lee).

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este protocolo, hemos demostrado que la proyección de imagen 4-D puede utilizarse para rastrear el desarrollo de una red trabecular en respuesta a cambios en las fuerzas biomecánicas. En particular, la tensión de corte experimentado por las células endoteliales inicia la muesca señalización cascada, que a su vez promueve la trabeculación. En este manuscrito, hemos demostrado que (1) gata1a MO inyección disminuyó la hematopoyesis y por lo tanto redujo la tensión de esquileo de la pared, (2) tnnt2a MO ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/57763/light-sheet-fluorescence-microscopy-to-capture-4-dimensional-images">Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart</a>.&#160;Additional author names were added, and an author affiliation was updated.
The author list was updated from:
Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1
to:
Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1
The author affiliation for Rongsong Li was updated from:
Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA
to:
College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57763/light-sheet-fluorescence-microscopy-to-capture-4-dimensional-images">Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart</a>. Additional&#160;author names were&#160;added, and an author affiliation was updated.

Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Fuerzas biomecánicas, como hemodinámica tensión de esquileo, están involucradas íntimamente en la morfogénesis cardiaca. En respuesta a las fuerzas de corte hemodinámica, surcos y crestas miocardio desarrollan en una red trabecular ondulatorio en alineación con la dirección de la tensión de esquileo en el auriculoventricular (AV) válvula1. Trabeculación cardiaca es necesario aumentar la función contráctil y masa miocárdica2. Mutaciones en vías de señalización Notch dan lugar a defectos congénitos del corazón en los seres humanos y otros vertebrados3. Por ejemplo, gata1a4 y tnnt2a5 morfolino oligonucleótidos (MO) han demostrado reducir la eritropoyesis, mientras aumenta el de mRNA (EPO) la eritropoyetina6 y7 de Isoproterenol (ISO) rojos de la sangre las células y la frecuencia cardíaca respectivamente y por lo tanto la pared tensión de esquileo (WSS). Además, señalización de ErbB2, aguas abajo de la muesca, promueve la proliferación de los cardiomiocitos y la diferenciación para generar la fuerza contráctil, que a su vez activa la muesca señalización8,9. Se sugiere que tensión de esquileo gobierna conducido trabeculación ventricular desarrollo de señalización de Notch. Actualmente, hay muchos estudios que intentan comprender aún más los eventos programación genéticos conduce a cardiopatía congénita (CHD) de defectos10,11,12, pero muy poco están investigando cómo fuerzas mecánicas influyen en el centro de formación.
Para investigar las fuerzas mecánicas actuando sobre el endocardio, una observación más cercana durante el período de desarrollo debe aplicarse. Sin embargo, es difícil obtener imágenes de buena calidad en vivo a las muestras debido a la injerencia de microscopía tradicional13. Para observar el desarrollo en el tiempo dentro de una muestra, física de seccionamiento y coloración, por lo tanto, deben ocurrir13,14,15. Aunque la microscopía confocal es ampliamente utilizada a la imagen de la estructura 3D de las muestras14,16, adquisición de estos sistemas de imagen todavía está limitado por bajas velocidades de barrido.
Microscopía de fluorescencia de luz-hoja (LSFM) es una única técnica de imagen que permite visualizar en vivo eventos dinámicos con largos de distancia de trabajo13. Esta técnica utiliza un microscopio fluorescente de luz de hoja a la sección ópticamente una muestra17. Debido a la iluminación de solo una hoja fina de la luz sobre la muestra, hay una reducción en el blanqueo de foto y foto toxicidad13,18. El gran campo de visión y distancia de funcionamiento larga permite muestras grandes a permanecer intacto como imagen13,14,17. La ampliación baja permite un área más grande al ser reflejada, mientras que la larga distancia de trabajo permite para que muestras más gruesas ser reflejada sin comprometer la relación señal a ruido. Muchos grupos han utilizado LSFM a imagen todo embriones17, cerebros de14,18, músculos y corazón19 entre otros tejidos, mostrando los diversos tipos de muestras que pueden ser reflejadas.
Aunque investigaciones previas demostraron fuerza hemodinámica reducida por oclusión de las vías de entrada o salida del corazón del pez cebra, la información es exclusivamente cualitativa. Traduce en una sala tercera anormal, bucle cardiaca disminuida y válvula deteriorada formación20. Las imágenes de 4D LSFM dan una nueva perspectiva en la manera de que la cizalla hemodinámica las fuerzas afectan el desarrollo del tejido cardiaco. Estas fuerzas mecánicas pueden activar moléculas de señalización sensibles a la fuerza e inducir la formación de las crestas trabeculares. Por el aspecto de mayor tiempo de proyección de imagen de 4-D, uno es capaz de seguir los cambios en el desarrollo en tiempo real, que podría conducir a nuevas revelaciones que habían pasado desapercibidas anteriormente. El pez cebra es un modelo ideal para la proyección de imagen porque los científicos pueden observar un animal vertebrado todo versus sólo interacciones de célula. Oxígeno puede difundir también por el embrión completo, que permite el desarrollo que se produzca sin dependiendo del sistema vascular, a diferencia de en el desarrollo de mamífero. A pesar de que el corazón del pez cebra carece de los órganos pulmonares, que requieren un corazón de cuatro cámaras, hay un gran número de genes cardíacos que se conservan entre el pez cebra y los seres humanos21.
En este manuscrito, se describe cómo utilizar microscopía de fluorescencia de la hoja de luz a la imagen de las trabéculas en desarrollo en el corazón del pez cebra bajo circunstancias diversas. En primer lugar, la inyección de gata1a4 o tnnt2a5 MOs utilizaron para baja la viscosidad de la sangre y por lo tanto WSS. Luego se registró la morfología del corazón. En un grupo separado de los peces, aumentamos el WSS mediante la administración de EPO mRNA6 o isoproterenol7 y observa los resultados. También se realizó un estudio de la célula con las tasas de flujo pulsátil u oscilatoria diferente. Después de cada grupo de imágenes, encontramos que WSS percibido por el endocardio mediante muesca señalización inicia trabeculación.

<table><tbody><tr><td>Premezcla de PCR Hifi de Clontech&nbsp;</td><td>Takara&nbsp;</td><td>639298</td><td>PCR mastermix 1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4</td></tr><tr><td>Human Nrg1 ADNc</td><td>Regalo de William Talbot, Universidad de Stanford, Stanford, California, EE. UU</td>. <td>N/A</td><td>Se utiliza para el rescate de trabeculación 1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1</td></tr><tr><td>CFX Connect&trade; Sistema de detección de PCR en tiempo real</td><td>Bio-Rad</td><td>1855201</td><td>PCR Machine 1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2</td></tr><tr><td>pCS2+</td><td>GE Health</td><td></td><td>Plásmido utilizado para sintetizar mRNA 1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5</td></tr><tr><td>Kit de purificación de nucleospinas&nbsp; &nbsp;</td><td>Clontech</td><td>740609.25</td><td>Purificación de ADN 1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2</td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa&nbsp;</td><td>Clontech</td><td>2011A Solución de</td><td>ligadura de PCR 1.1.2.5</td></tr><tr><td>Células competentes estelares</td><td>Clontech</td><td>636763</td><td>E. coli células utilizadas para la transformación 1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2</td></tr><tr><td>Reactivo de transfección Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668027</td><td>Reactivo de transfección 1.1.4</td></tr><tr><td>mMessage SP6 kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1340</td><td>Kit utilizado para sintetizar ARNm 1.1.6.3</td></tr><tr><td>Aurum ARN Total Mini Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>7326820</td><td>Purifica ARN&nbsp; 1.1.6.4, 3.1.2</td></tr><tr><td>GeneTools 4.3.8</td><td>GeneTools</td><td>N/A</td><td>Software para el diseño de imprimaciones 1.2.1, 3.1.3</td></tr><tr><td>EPO cDNA</td><td>Creative Biogene</td><td></td><td>CDFH006026 aumenta WSS 1.2.2, 1.2.3, 1.1.7</td></tr><tr><td>AG1478</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T4182</td><td>Inhibidor de ErbB 1.3.1</td></tr><tr><td>E3 medio</td><td></td><td></td><td>Para el crecimiento de embriones 1.3.1, 1.3.2, 5.1.5</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D5942</td><td>&gamma;inhibidor de la -secretasa 1.3.2</td></tr><tr><td>Agarosa&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9539</td><td>Se utiliza para el montaje de embriones 2.1.1.1</td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 LT&nbsp; Cámara digital CMOS</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-42U</td><td>Se utiliza para capturar imágenes 2.1.1.2, 2.1.1.3</td></tr><tr><td>Amira Software</td><td>FEI Software</td><td>N/A</td><td>Imágenes visualizadas y analizadas en 3D y 4D 2.1.5.1.1-2.1.5.2.8</td></tr><tr><td>Mesilato de Tricaone&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>886-86-2</td><td>Se utiliza para sedar o sacrificar embriones de forma humanitaria 3.1.1</td></tr><tr><td>Kit de síntesis de ADNc iScript</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td>sintetiza ADNc 3.1.2</td></tr><tr><td>Microcentrífuga Eppendorf 5424 Eppendorf</td><td></td><td>05-400-005</td><td>Microcentrífuga 4.1.1.3</td></tr><tr><td>GI254023X</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>260264-93-5</td><td>Inhibidor de ADAM10 4.1.2, 4.1.3&nbsp;</td></tr><tr><td>Clorhidrato de isoprenalina</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>I5627</td><td>El isoproterenol aumenta WSS 5.1.5</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>N/A</td><td>Análisis de mecánica cardíaca</td></tr></tbody></table>

microscopía de fluorescencia de la hoja de luz para capturar imágenes de 4 dimensiones de los efectos de la modulación de la tensión de esquileo en el corazón de pez cebra en desarrollo

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Las fuerzas hemodinámicas experimentadas por el desarrollo cardíaco corazón influencia, especialmente trabeculación, que forma una red de ramificación crecimientos del miocardio. Programa genético de defectos en la muesca de señalización cascada participan en defectos ventriculares como cardiomiopatía no compactación Ventricular izquierda o síndrome de corazón izquierdo hipoplásico. Mediante este protocolo, puede determinarse que tensión de esquileo conducido trabeculación y señalización Notch están relacionados con uno otro. Usando microscopía de fluorescencia de luz-hoja, visualización del corazón de pez cebra en desarrollo era posible. En este manuscrito, se evaluó si las fuerzas hemodinámicas modulan el inicio de la trabeculación vía de señalización Notch y por lo tanto, influyen en la función contráctil se produce. Cualitativa y cuantitativa del esquileo tensión análisis, 4-D (3-D + tiempo) imágenes fueron adquiridas durante la morfogénesis cardiaca de pez cebra, y de microscopía de fluorescencia de luz hoja integrada con 4 D sincronización capturado el movimiento ventricular. Viscosidad de la sangre se redujo gata1a- morfolino oligonucleótidos (MO) micro-inyectable para disminuir la tensión de esquileo, de tal modo, abajo-regulación de la muesca señalización y atenuando trabeculación. La inyección de mRNA de Nrg1 con gata1a MO rescatado genes relacionados con la muesca para restaurar trabeculación. Para confirmar la tensión de esquileo por señalización Notch influencias trabeculación, contracción de cardiomiocitos más fue detenida por tnnt2a-MO para reducir las fuerzas hemodinámicas, por lo tanto, abajo-regulan genes de la blanco del muesca para desarrollar no trabeculada miocardio. Por último, corroboración de los patrones de expresión de genes sensibles a la tensión de esquileo de muesca se realizó sometiendo las células endoteliales a flujo pulsátil. Así, la microscopía de luz-hoja 4-D al descubierto las fuerzas hemodinámicas subyacentes de señalización Notch y trabeculación con importancia clínica a la cardiomiopatía no compactación.

LSFM fue utilizado en este manuscrito para adquirir 2-D y 3-d imágenes de alta resolución. Como se ve en la figura 1A y 1B, el lente de la iluminación indica la ficha técnica de iluminación en la muestra. Debido a la delgadez de la ficha técnica de iluminación, se ilumina solamente un solo plano. El objetivo de la detección es colocada perpendicular a la lente de la iluminación y se centra en el plano iluminado (figura 1B...

Aquí, presentamos un protocolo para visualizar el desarrollo de corazón en pez cebra en 4 dimensiones (4D). Imagen 4-D, mediante microscopía de fluorescencia de luz-hoja (LSFM), toma 3 dimensiones (3D) imágenes en el tiempo, reconstruir el corazón en desarrollo. Mostramos cualitativamente y cuantitativamente que esa tensión de esquileo activa endocárdica muesca señalización durante el desarrollo de la cámara, que promueve la trabeculación cardiaca.

Microscopía de fluorescencia de la hoja de luz para capturar imágenes de 4 dimensiones de los efectos de la modulación de la tensión de esquileo en el corazón de pez cebra en desarrollo

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la mecanobiología cardíaca del desarrollo, como la modulación del esfuerzo cortante en la trabeculación cardíaca a través de la señalización de muesca utilizando un microscopio de lámina de luz 4D. La principal ventaja de esta técnica es que ilumina una sección delgada de la muestra con un plano de cinco micras, lo que lleva a un menor fotoblanqueo y daño a la foto. Además, nuestro algoritmo computacional nos permite reconstruir un corazón de pez cebra latiendo en 4D.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de enfermedades cardíacas congénitas, ya que permite la visualización secuencial in vivo de la trabeculación cardíaca en una etapa temprana del desarrollo hasta el fenotipo posterior. Generalmente, las personas que son nuevas en esta técnica encontrarán que pensar en tres dimensiones a lo largo del tiempo es difícil de imaginar. Además, se necesita tiempo para crear el sistema y alinearlo con precisión.Para empezar, separe el pez cebra macho y hembra en los tanques de cría utilizando un divisor. Luego, levante el divisor y permita que el pez cebra macho y hembra se reproduzcan. Recoja

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Bioengineering

Bioingeniería

La microscopía de fluorescencia de lámina de luz es una excelente herramienta para obtener imágenes del desarrollo embrionario. Permite la grabación de vídeos de largo lapso de tiempo de embriones vivos en condiciones casi fisiológicas. Demostramos su aplicación para obtener imágenes del desarrollo del ojo del pez cebra a través de amplias escalas espacio-temporales y presentamos una línea para la fusión y deconvolución de conjuntos de datos multivista.

Utilización de hojas de luz de microscopía de fluorescencia a la imagen de ojo de pez cebra Desarrollo

Aquí, se proporciona un protocolo para imágenes de lapso de tiempo de la morfogénesis ocular utilizando un microscopio de hoja de luz disponible comercialmente y una estación de trabajo de procesamiento de imágenes para analizar los datos resultantes. Este protocolo detalla los procedimientos para la anestesia embrionaria, la incrustación en agarosa a baja temperatura de fusión, la suspensión en la cámara de imágenes, la configuración de los parámetros de imagen y, finalmente, el análisis de...

Visualización de la morfogénesis ocular mediante microscopía de hoja de luz utilizando rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Describimos herramientas optimizadas para estudiar el corazón de pez cebra in vivo con microscopía de fluorescencia de lámina de luz. Específicamente, sugerimos líneas transgénicas cardíacas brillantes y presentamos nuevas técnicas suaves de incrustación e inmovilización que evitan defectos de desarrollo y cardíacos. También se proporciona una posible línea de adquisición y análisis de datos adaptada a las imágenes cardíacas.

Microscopía de hoja de luz de dinámica cardíaca rápida en embriones de pez cebra

Este protocolo utiliza imágenes de láminas de luz para investigar la función contráctil cardíaca en larvas de pez cebra y obtener información sobre la mecánica cardíaca a través del seguimiento celular y el análisis interactivo.

Imágenes de lámina de luz 4D de la contracción cardíaca del pez cebra

Un biorreactor presión cíclica capaz de someter a los tejidos del corazón de la válvula de presión a las condiciones fisiológicas y patológicas ha sido diseñado. Un programa LabVIEW permite a los usuarios para controlar la presión magnitud, amplitud y frecuencia. Este dispositivo puede ser utilizado para estudiar el tejido mecanobiología de las válvulas del corazón o células aisladas.

Diseño de un biorreactor de presión cíclica de la Ex Vivo Estudio de las válvulas aórtica del corazón

Hemos desarrollado una tecnología basada en película delgada de sílice mesoporoso para la recuperación selectiva de proteínas de bajo peso molecular y péptidos de suero humano. Las propiedades físico-químicas de nuestros chips mesoporosos fueron finamente sintonizada para proporcionar un control importante en el enriquecimiento de péptido y por lo tanto el perfil de la proteoma de suero para el diagnóstico.

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Un método para el montaje de gradientes adhesivas y soluble en una cámara de microscopía para estudios en vivo de células de migración se describe. El entorno de ingeniería combina superficies antiincrustantes y pistas adhesivas con gradientes de solución y por lo tanto permite determinar la importancia relativa de las señales de orientación.

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En este protocolo de video rastreamos, a alta velocidad y en tres dimensiones, lisosomas marcados con fluorescencia dentro de células vivas, utilizando el método de seguimiento orbital en un microscopio modificado de dos fotones.

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La distribución espacial y la dinámica temporal de las proteínas y lípidos de la membrana plasmática es un tema candente en biología. En este caso, este problema se aborda mediante un análisis de fluctuación de imagen espacio-temporal que proporciona conceptualmente las mismas cantidades físicas de seguimiento de una sola partícula, pero utiliza etiquetas moleculares pequeñas y configuraciones de microscopía estándar.

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Aquí se muestra la preparación de bicapas lipídicas planas funcionalizadas con proteínas, la determinación de la movilidad de las proteínas en su interior y la medición de las densidades de las proteínas. Se esboza una hoja de ruta para la construcción de un microscopio de reflexión interna total con reducción de ruido, que permite visualizar fluorocromos residentes de una sola capa con alta resolución espacio-temporal.

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Microscopía de fluorescencia de la hoja de luz para capturar imágenes de 4 dimensiones de los efectos de la modulación de la tensión de esquileo en el corazón de pez cebra en desarrollo (Video) | JoVE Journal

Microscopía de fluorescencia de la hoja de luz para capturar imágenes de 4 dimensiones de los efectos de la modulación de la tensión de esquileo en el corazón de pez cebra en desarrollo

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