Microscopía de fluorescencia de la hoja de luz para capturar imágenes de 4 dimensiones de los efectos de la modulación de la tensión de esquileo en el corazón de pez cebra en desarrollo
10 de agosto de 2018
Aquí, presentamos un protocolo para visualizar el desarrollo de corazón en pez cebra en 4 dimensiones (4D). Imagen 4-D, mediante microscopía de fluorescencia de luz-hoja (LSFM), toma 3 dimensiones (3D) imágenes en el tiempo, reconstruir el corazón en desarrollo. Mostramos cualitativamente y cuantitativamente que esa tensión de esquileo activa endocárdica muesca señalización durante el desarrollo de la cámara, que promueve la trabeculación cardiaca.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la mecanobiología cardíaca del desarrollo, como la modulación del esfuerzo cortante en la trabeculación cardíaca a través de la señalización de muesca utilizando un microscopio de lámina de luz 4D. La principal ventaja de esta técnica es que ilumina una sección delgada de la muestra con un plano de cinco micras, lo que lleva a un menor fotoblanqueo y daño a la foto. Además, nuestro algoritmo computacional nos permite reconstruir un corazón de pez cebra latiendo en 4D.
Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de enfermedades cardíacas congénitas, ya que permite la visualización secuencial in vivo de la trabeculación cardíaca en una etapa temprana del desarrollo hasta el fenotipo posterior. Generalmente, las personas que son nuevas en esta técnica encontrarán que pensar en tres dimensiones a lo largo del tiempo es difícil de imaginar. Además, se necesita tiempo para crear el sistema y alinearlo con precisión.
Para empezar, separe el pez cebra macho y hembra en los tanques de cría utilizando un divisor. Luego, levante el divisor y permita que el pez cebra macho y hembra se reproduzcan. Recoja los embriones de pez cebra e inyecte un oligoolino morfolino en el embrión para inhibir la trabeculación.
A continuación, prepare un gel de agarosa al uno por ciento agregando un gramo de agarosa a 100 mililitros de agua destilada y caliéntelo hasta que se disuelva toda la agarosa. Deje que la agarosa se enfríe y luego use una pipeta de 20 microlitros para cargar un pequeño tubo de plástico con uno de los embriones preparados y agarosa. Fije el tubo a la platina del microscopio y utilice el objetivo de diez x.
Ajuste el objetivo con la perilla para que la parte superior del embrión esté enfocada. Tome imágenes de todo el embrión de pez a lo largo de múltiples ciclos de latidos cardíacos utilizando una lámina ligera de cinco micras de grosor. Recoge 500 fotogramas xy con un tiempo de exposición de diez milisegundos.
A continuación, mueva la etapa una micra en el acceso z a una nueva capa y repita el procedimiento de imagen. Continúe imaginando 500 fotogramas por plano z hasta que todo el corazón esté completamente visualizado. A continuación, abra el software de procesamiento de imágenes y comience a apilar las imágenes en 3D.
Para lograr esto, primero haga clic en datos abiertos. Aquí, seleccione todas las imágenes que se van a apilar en 3D y, a continuación, seleccione cargar. A continuación, añada el tamaño de vóxel de 0,65 por 0,65 por una micra y haga clic en aceptar.
Introducir el tamaño de vóxel correcto es fundamental para un análisis preciso de las imágenes 3D. Ahora, haga clic en el cuadro de vista multiplaner y visualice la imagen 3D. Haga clic con el botón derecho en el cuadro tiff de un punto de corte azul, seleccione pantalla y, a continuación, haga clic en volran.
En el menú de edición, seleccione opciones y, a continuación, edite el mapa de colores. Ajuste el color usando los cuadros y luego haga clic en aceptar. Mientras aún está en el software de procesamiento de imágenes, haga clic en archivo y abra los datos de la serie temporal.
Seleccione los tiffs 3D que se acaban de hacer haciendo clic en cargar, e introduzca el mismo tamaño de vóxel que antes. Haga clic con el botón secundario en el cuadro tiff de un punto de corte azul y, a continuación, seleccione display seguido de volran. Ahora, haz clic en editar.
Seleccione las opciones. Y luego seleccione editar mapa de color. Ajuste el color usando los cuadros y luego haga clic en aceptar.
A continuación, haga clic con el botón derecho en el control de serie temporal, haga clic en el creador de películas y presione el botón de reproducción para ver la película. Para terminar, agregue un nombre de archivo, tamaño de fotograma, velocidad de fotogramas, calidad igual a uno y escriba monoscópico. A continuación, haga clic en aplicar.
Finalmente, exporta el video. Las fuerzas biomecánicas, como el esfuerzo cortante hemodinámico, están íntimamente involucradas en la morfogénesis cardíaca. En este caso, se utilizó microscopía de fluorescencia de lámina de luz para visualizar las crestas trabeculares que sobresalen en la luz ventricular a las 75 horas después de la fertilización.
A las 100 horas después de la fecundación se puede ver claramente una red trabecular. En un embrión tratado con la microinyección gata1aMO, la hematopoyesis y la viscosidad se reducen en un 90 por ciento. Esta disminución de la viscosidad atenuó el esfuerzo cortante hemodinámico, lo que resultó en un inicio tardío y una red trabecular menos densa.
Este retraso y densidad de la red trabecular pudo recuperarse mediante la regulación ascendente de la expresión génica relacionada con el notch, rescatando la formación trabecular a las 75 horas después de la fertilización y a las 100 horas después de la fertilización. Por lo tanto, los oligonucleótidos morfolino gata1a redujeron las fuerzas hemodinámicas que conducen a la regulación a la baja de la señalización de la muesca, mientras que el ARNm de Nrg1 rescata los genes relacionados con la muesca regulados y reinició la trabeculación. Una vez dominada, esta técnica de imagen puede completarse en aproximadamente dos horas si se realiza correctamente.
Tras su desarrollo, esta técnica abrió el camino para que los investigadores en el campo del desarrollo cardíaco estudiaran los factores del gen notch, responsables de la correcta formación de la trabeculación en el pez cebra. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo adquirir imágenes utilizando microscopía de iluminación de plano selectivo y crear archivos de imagen 4D. No olvide que trabajar con láseres puede ser extremadamente peligroso.
Y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de anteojos adecuados, durante este procedimiento.
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Visión general
Este artículo presenta un protocolo para visualizar corazones en desarrollo en pez cebra utilizando microscopía de fluorescencia de hoja de luz 4-D (LSFM). El método permite la reconstrucción del desarrollo cardíaco a lo largo del tiempo, revelando el papel del estrés cortante en la activación de la señalización Notch endocárdica durante el desarrollo de las cámaras.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Biología del desarrollo
- Mecanobiología cardíaca
- Técnicas de imagen
Antecedentes
- Entender el desarrollo cardíaco es crucial para diagnosticar enfermedades cardíacas congénitas.
- El estrés cortante influye en la trabeculatura cardíaca a través de la señalización Notch.
- La imagen 4-D proporciona información sobre procesos biológicos dinámicos.
- La microscopía de hoja de luz minimiza el blanqueo fotoquímico y el daño.
Propósito del estudio
- Visualizar el desarrollo cardíaco en pez cebra en tiempo real.
- Investigar los efectos del estrés cortante en la trabeculatura cardíaca.
- Desarrollar un algoritmo computacional para la reconstrucción cardíaca 4-D.
Métodos utilizados
- Microscopía de fluorescencia de hoja de luz 4-D (LSFM).
- Reconstrucción de corazones de pez cebra latientes usando algoritmos computacionales.
- Visualización secuencial de etapas del desarrollo cardíaco.
- Análisis de los efectos del estrés cortante en la señalización Notch.
Resultados principales
- El estrés cortante activa la señalización Notch endocárdica durante el desarrollo de las cámaras cardíacas.
- La técnica de imagen 4-D permite una observación detallada de la trabeculatura cardíaca.
- La reducción del blanqueo fotoquímico y el daño mejora la calidad de las imágenes.
- El método ayuda a entender los mecanismos de las enfermedades cardíacas congénitas.
Conclusiones
- La técnica de LSFM 4-D es una herramienta poderosa para estudiar el desarrollo cardíaco.
- Los conocimientos adquiridos podrían conducir a mejores métodos de diagnóstico para enfermedades cardíacas congénitas.
- Las aplicaciones futuras pueden extenderse a otras áreas de la biología del desarrollo.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Understanding hemodynamic forces in cardiac development provides mechanistic insights into congenital heart disease pathways, supporting target validation in preclinical models. Light-sheet fluorescence microscopy enables quantitative, dynamic visualization of shear stress effects on Notch signaling, a pathway implicated in ventricular non-compaction. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking biomechanical inputs to molecular outputs in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the causal relationship between hemodynamic shear stress and Notch signaling in trabeculation formation.
- Operational Value: Enables phenotypic screening of genetic and pharmacological modulators of cardiac morphogenesis.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by visualizing how reduced shear stress down-regulates Notch target genes and attenuates trabeculation.
- Operational Value: Facilitates rescue experiments, such as Nrg1 mRNA co-injection, to confirm target pathway specificity and reversibility.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative 4-D readouts of trabecular density and initiation timing for dose-response analysis.
- Operational Value: Standardizes imaging protocols across experimental conditions using synchronized light-sheet acquisition and voxel-based reconstruction.
- Scientific Value: Enables shear stress modulation via gata1a-MO to create controlled hypodynamic conditions for assay validation.
- Operational Value: Produces scalable, reproducible 3D+time datasets suitable for high-content analysis pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects endothelial Notch gene expression under pulsatile flow to in vivo trabeculation phenotypes, strengthening translational continuity.
- Operational Value: Provides a preclinical zebrafish model for studying Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy mechanisms.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by correlating molecular rescue (e.g., Nrg1) with phenotypic recovery of trabeculation.
- Operational Value: Supports cross-functional collaboration through shared 4-D visualization platforms for cardiology, genetics, and bioengineering teams.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing of mechanotransduction pathways in cardiac development, bridging phenotypic screening to target validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by visualizing how shear stress modulates Notch signaling during ventricular chamber formation.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs on trabecular network dynamics for compound or genetic modifier evaluation.
- Analytics: Generates synchronized 4-D image stacks with voxel-scale precision, enabling statistical comparison of hemodynamic conditions.
- Translational Research: Links in vivo trabeculation phenotypes to in vitro endothelial flow responses, supporting biomarker alignment studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for studying hemodynamic influences across developmental and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in mechanobiological pathway interpretation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through synchronized 4-D acquisition and computational reconstruction.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early phenotypic assessment of cardiac morphogenesis modifiers.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets involved in shear stress-Notch-trabeculation axes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, microinjection techniques, and light-sheet microscopy alignment.
- Dependent on specialized instrumentation including selective plane illumination microscopy and high-speed sCMOS cameras.
- Necessitates cross-team standardization of image acquisition parameters, voxel sizing, and time-series synchronization.
- Involves adaptation considerations when translating protocols across different genetic backgrounds or disease models.
- Limited by the physical accessibility of the embryonic heart and the need for precise temporal sampling across cardiac cycles.
