Identificación de marcadores de virulencia de Mycobacterium abscessus para la replicación intracelular de fagocitos

El cribado de bibliotecas mutantes y los estudios transcriptómicos de patógenos intracelulares pueden ayudar a responder preguntas clave sobre adaptaciones genómicas y reglamentarias de patógenos de interés que se utilizan para sobrevivir dentro del huésped. Las principales ventajas de estas técnicas son que son técnicas de investigación a gran escala, y que proporcionan una visión objetiva de la adaptación a la vida intracelular. Las implicaciones de estas técnicas se extienden hacia la terapia de Absceso de Mycobacterium que se asocian a esta enfermedad dando una idea de los objetivos potenciales para la terapia con vacunas.

Comience por cultivar ameba Acanthamoeba castellani, o Ac, en 30 mililitros de medio de glucosa de levadura de peptona en matraces de cultivo de tejido de 75 centímetros cuadrados a temperatura ambiente. Después de una hora, utilice una pipeta de 25 mililitros para eliminar el sobrenadante, y lave las células tres veces con 10 mililitros de tampón de Ca sin carbono ni nitrógeno por lavado. Después del último lavado, desprende la ameba de la parte inferior del matraz con un solo batido vigoroso, y ajuste las células en un tubo Falcon, a cinco veces 10 a la concentración de cinco amebas por mil en tampón de Ca fresco.

Semilla cinco veces 10 a las cuatro amebas por pozo en una placa de 96 pozos. Coloque la placa a 32 grados centígrados durante una hora sin temblar, para permitir que las tropho-zoitas de la ameba flotante se adhieran a los pozos. Mientras tanto, calienta las bacterias sobre hielo, y añade cinco microlitros de las bacterias descongeladas a cada pozo al final de la incubación.

Después de 1,5 horas a 32 grados centígrados, deseche el sobrenadante invirtiendo la placa en una pila de gasa estéril en una bandeja de metal esterilizada bajo una campana de humo. Lave cada pozo tres veces con 200 microlitros de medio ac fresco por pozo. Después del último lavado, incubar el co-cultivo con 20 microlitros de medio fresco complementados con amikacina por pozo, para eliminar cualquier micobacteria extracelular restante durante dos horas.

Seguido de tres lavados en medio ac fresco, como se acaba de demostrar. A continuación, añadir 200 microlitros de medio, complementado con amikacina fresca a cada pozo, seguido de la adición de cinco veces 10 a las siete bacterias Escherichia coli inactivadas por calor. Después de 48 horas, anlice las células con 10 microlitros de 10%dodecil sulfato de sodio por pozo, durante 30 minutos a 32 grados centígrados, y esparza cinco microlitros del ésate en placas de agar Columbia que contienen 5% de sangre de oveja.

Diluir aún más los licatos añadiendo 25 microlitros de agua estéril en cada gota. Cuando todos los licatos hayan sido chapados, selle las placas con película de parafina de plástico e incubar los cultivos durante tres a cuatro días a 37 grados centígrados. Cuando las colonias aparecen en las placas, fotografíe los cultivos e identifique a los mutantes deteriorados para el crecimiento intracelular por los depósitos con el menor número de colonias bacterianas.

Para la extracción de ARN micobacteria intracelular, primero crecer M.abscessus en medio 7H9 complementado con glicerol y glucosa a la fase media exponencial en tubos de 50 mililitros a 120 RPM. Al final del cultivo, lave las bacterias dos veces con 10 mililitros de tampón de Ac por lavado, y mida el O.D.600 para estimar la concentración de bacterias. A continuación, agregue 8,5 veces 10 a las ocho micobacterias a 8,5 veces 10 a las seis amebas en 10 mililitros de medio ac fresco para una incubación de una hora a 30 grados centígrados y 80 RPM.

Al final de la incubación, cosecha las células por centrifugación, y lava el pellet tres veces en 10 mililitros de tampón de Ac fresco por lavado en las mismas condiciones de centrífuga. Luego re-suspende las células en 10 mililitros de tampón de Ac fresco complementado con amikacina para eliminar cualquier bacteria extracelular, e incubar las células durante cuatro horas a 30 grados centígrados y 80 RPM, seguido de dos lavados en tampón de Ac fresco. Después del último lavado, vuelva a suspender las amebas infectadas en cuatro mililitros de solución fría tres, complementados con 280 microlitros de beta mercaptoetanol para interrumpir la ameba en hielo durante 10 minutos.

Al final de la incubación, centrifugar la célula de litonato para peletizar las bacterias intracelulares liberadas, y volver a suspender el pellet bacteriano en un mililitro de solución fría tres. Es importante eliminar todo el sobrenadante para evitar la contaminación con ARN de ameba o proteasas que podrían haber hecho las muestras. Cosechar las bacterias liberadas con una segunda centrifugación, y volver a suspender el pellet en un mililitro de tampón de extracción.

Luego incubar durante 24 horas a 80 grados centígrados negativos. Transfiera la solución micobacteriana en dos tubos de tornillo de mililitro que contengan perlas de circonio hasta la marca de gradación de 500 microlitros, y almacene los tubos durante otras 24 horas a 80 grados centígrados negativos para facilitar la activación sin ARN y la disolución celular. El día del análisis, descongele las muestras sobre hielo y anlice las células con dos rondas de homogeneización a 6000 RPM durante 25 segundos, seguido de una homogeneización redonda a 6000 RPM durante 20 segundos.

Entre cada ronda de homogeneización, enfríe las muestras sobre hielo durante un minuto para evitar la degradación del ARN. Después de la tercera ronda de homogeneización, enfríe las muestras sobre hielo durante 20 minutos y agregue 200 microlitros de cloroformo diluidos en alcohol isoamilo a cada tubo. Vórtice durante un minuto, luego centrifugar las muestras, y añadir 0,8 mililitros de isopropanol frío a la fase acuosa para una incubación de dos a tres horas a 20 grados centígrados negativos.

Al final de la incubación, centrifugar las muestras de nuevo, y lavar los pellets en 500 microlitros de etanol frío 70%sin mezclar. A continuación, retire inmediatamente el etanol por centrifugación. Aspirar el sobrenadante para secar los pellets en un concentrador centrífugo, y volver a suspender los pellets en 100 microlitros de agua libre de ADN/ARN.

La extracción de MRNA micobacteriana como se demuestra, permite la evaluación de las familias de genes inducidos y reprimidos agrupando los genes de acuerdo a sus funciones en la respuesta a un entorno limitado en su fuente de nutrientes y minerales, o a un ambiente hipoxico o ácido. En la resistencia al estrés oxidativo y nitrosativo, o en la expresión de factores de virulencia en respuesta a la ameba ambiental. Al intentar esos procedimientos, es importante recordar realizar el cultivo y el aislamiento de ARN de las muestras controladas e infectadas al mismo tiempo para evitar efectos por lotes.

Después de este procedimiento, otros métodos como la secuenciación de ARN dual se pueden preformar para responder preguntas adicionales sobre las interacciones con patógenos del huésped. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para los investigadores en el campo de la microbiología hacia la virulencia de las micobacterias en el modelo de host de la ameba. No olvides que trabajar con amebas puede ser extremadamente peligroso, ya que las amebas podrían transformarse en quistes si no sigues los pasos descritos en el procedimiento.