Cuantificación de Vibrio cholerae de colonización y de la diarrea en el modelo de pez cebra adulto

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del vibrio cholerae, como por ejemplo cómo el vibrio cholerae coloniza la Costa Tranquila y compite con la microbiota intestinal para establecer un nicho. La principal ventaja de esta técnica es que los peces son un huésped natural de Vibrio cholerae, por lo que podemos estudiar el ciclo de vida completo del Vibrio cholerae. La demostración del procedimiento estará a cargo de Dhrubajyoti Nag, un postdoc de mi laboratorio, y Paul Breen, un estudiante de doctorado de mi laboratorio.

Después de preparar los cultivos de V. cholerae, inocular el pez cebra por inmersión. Primero, coloque cuatro o cinco peces cebra en un vaso de precipitados de 400 mililitros que contenga 200 mililitros de agua estéril para infecciones. A continuación, añada un mililitro de cultivo de V. cholerae para obtener la concentración de infección deseada.

Luego, cubra el vaso de precipitados con una tapa perforada. Después de preparar todos los vasos de precipitados, transfiéralos a una incubadora con frente de vidrio a 28 grados centígrados Para una exposición transitoria, después de aproximadamente seis horas, vierta el agua del vaso de precipitados a través de una red de pesca para recoger los peces. El agua infectada debe desecharse en lejía para matar las bacterias.

Luego, coloque el pescado en 200 mililitros de agua estéril para infecciones durante cinco minutos. Después de cinco minutos, deje correr esta agua a través de una red, desechando el agua en lejía. Ahora, los peces pueden ir a un nuevo vaso de precipitados limpio con 200 mililitros de agua estéril para infecciones.

Cuando el experimento haya alcanzado el punto final deseado, tome una muestra de 15 mililitros del agua de la infección con fines diagnósticos. A continuación, recoja los peces y deseche el agua infectada de forma adecuada. Oriente el lado ventral hacia arriba y asegure el cuerpo con un alfiler a través de la mandíbula inferior y otro alfiler justo después del ano.

Incline ambos pasadores lejos del cuerpo. A continuación, limpie la superficie ventral del pescado con etanol al 70%. A continuación, esteriliza un bisturí y unas tijeras Vannas utilizando etanol al 70% y una llama.

Ahora, con el bisturí, haz una pequeña incisión longitudinal en el vientre que penetre en las escamas, pero solo tan profunda como la piel. A continuación, con las tijeras, extienda la incisión con cuidado a lo largo del cuerpo, sin cortar más allá del nivel de la piel. Evite cortar el ano.

A continuación, haz dos cortes laterales hacia la cabeza para ampliar la abertura. Luego, sujete la piel a cada lado de las incisiones laterales a la superficie de disección, inclinando los alfileres hacia afuera, lejos del cuerpo. El tracto intestinal ahora debería ser visible como un tubo muy delgado y pálido.

Ahora, use dos pares de pinzas esterilizadas con llama para extraer con cuidado todo el tracto intestinal, que puede ser bastante frágil. Transfiera el tejido a un tubo de hominización que contenga cuentas de vidrio y un mililitro de tampón frío. A continuación, homogeneizar los tejidos tal y como se describe en el protocolo de texto y cuantificar los niveles de colonización intestinal.

A continuación, realice diluciones en serie del homogeneizado intestinal y tampón. Para cada pescado, prepare cinco o seis diluciones de diez veces en volúmenes de un mililitro. Vórtice los tubos para mezclar.

Luego, coloque de 100 a 200 microlitros de cada dilución en placas de agar LB que contengan estreptomicina y X-gal. Incubar las placas a 30 grados centígrados durante 16 a 18 horas. Después de la incubación durante la noche, cuente las colonias de V. cholerae en las placas.

Estas bacterias suelen producir colonias de color azul pálido en el medio LB con X-gal. Si se observan varias morfologías de colonias, coloque algunas colonias de cada morfología diferente en una placa TCBS diferente. En TCBS, V. cholerae produce colonias amarillas grandes, ligeramente aplanadas, con centros opacos y periferias translúcidas.

Para determinar los niveles de mucina en la diarrea de los peces, realice un ensayo en una placa de 96 pocillos. Por triplicado, cargue 100 microlitros de agua de infección para cada condición de prueba, incluida una pieza en blanco, en los pozos. A continuación, mezcle 50 microlitros de solución fresca de ácido perjudico al 0,1% en cada pocillo de prueba.

Utilice el pipeteo para mezclar. A continuación, envuelva bien la placa en plástico e incube la placa a 37 grados centígrados durante una a una hora y media. Después de la incubación, enfríe la placa a temperatura ambiente.

En cada pocillo, agregue 100 microlitros de solución de fucsina y mezcle con pipeteo. Ahora, vuelva a envolver el plato y colóquelo en una mecedora a temperatura ambiente. En unos 20 minutos, lea la placa a 560 nanómetros con un lector de placas.

Cuantificar la reacción causada por la mucina en solución. Para medir los niveles de proteínas en la diarrea de pescado, utilice el ensayo de Bradford. Mezcle 66 microlitros de uno de los estándares BSA o 66 microlitros de agua de infección con 1.000 microlitros de reactivo de ensayo Bradford en una cubeta desechable.

Ahora, incuba las muestras a temperatura ambiente durante dos minutos. Y luego leer la absorbancia a 660 nanómetros en un espectrofotómetro. Una métrica simple para la cantidad de diarrea es la turbidez en el agua medida a 600 nanómetros.

Mezcle bien el agua, agregue un mililitro a una cubeta desechable y tome una medida. Para una medición en blanco de referencia, use agua limpia para infecciones. También se puede medir la bacteria V. cholerae excretada.

Esto se puede hacer con peces que han sido trasladados a agua limpia después de ser inoculados. Realice diluciones en serie de un aliquat de agua del tanque como se describió anteriormente. A continuación, coloque las diluciones en medios selectivos e incube las placas a 30 grados centígrados durante 24 horas.

Posteriormente, cuente las colonias como se describió anteriormente y luego determine la UFC. Grupos de peces cebra alojados en 200 mililitros de agua fueron inoculados con cinco millones de UFC de un cólera pandémico. Después de seis horas en el agua infestada de bacterias, los peces pasan a agua limpia durante 18 horas.

A continuación, se extrajeron los intestinos aéreos. Cada pez albergaba un estimado de 100.000 a 1.000.000 de células de V. cholerae. El agua de la infección se utilizó para otros ensayos.

Los niveles de mucina fueron más altos cuando las dosis infecciosas fueron más altas. La OD600 del agua fue significativamente mayor cuando los peces estaban infectados con V. cholerae. Finalmente, el nivel total de proteína en el agua de los peces infectados fue casi el doble que el observado en el agua de los peces no infectados.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo infectar al pez cebra adulto con vibrio cholerae y cuantificar la diarrea inducida por la infección. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como los ensayos de transmisión, para evaluar la infección de peces naïve por peces previamente infectados.