Protocolos para las pruebas de la toxicidad de la novela química insecticida para mosquitos
February 13th, 2019
Se describen los protocolos para la evaluación de la toxicidad de los químicos a los mosquitos inmaduros y adultos para el desarrollo como nuevas clases de larvicidas, adulticidas y endectocidas. Los protocolos permiten pruebas de alto rendimiento de múltiples químicos en dosis de un solo punto y posterior evaluación por análisis de respuesta de dosis para determinar toxicidad en contacto o por ingestión.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de descubrimiento de insecticidas y control de vectores. Por ejemplo, ¿cuán tóxica es una química noformulada para una población de larvas de mosquitos o adultos? ¿La química tiene potencial para el desarrollo como un larvicida o adulticida?
Y, ¿cuál podría ser la ruta de entrega más eficaz? Las principales ventajas de esta técnica son que se puede utilizar para evaluar la toxicidad de las químicas noformuladas La toxicidad de una química contra múltiples especies de mosquitos vectores, y se puede ampliar hasta evaluar cientos de compuestos en alta capacidad de producción. Demostrando el procedimiento estará Jasleen Kaur, un técnico científico de mi laboratorio.
Para empezar, etiquete los pozos de una placa de cultivo de tejido de 24 pozos. Utilice una balanza analítica para pesar el compuesto de prueba. A continuación, desoldar el compuesto en agua estéril doble destilada en un tubo de 1,5 ml, lo que resulta en una solución de stock de 80mM.
A continuación, diluir en serie la solución de stock utilizando agua destilada doble para preparar soluciones de stock de trabajo de las concentraciones deseadas. Tenga en cuenta que se deben tener cuidado las larvas se añaden a los pozos, durante la eliminación del exceso de agua, y cuando se añade la química de prueba para evitar daños físicos a las larvas. Las lesiones pueden aumentar la mortalidad y, por lo tanto, producir resultados falsos positivos o invalidar el ensayo.
Utilice una pipeta de transferencia de plástico de diámetro ancho para transferir cinco larvas instar de terceros a cada pozo de la placa. A continuación, utilice una pipeta de un ml para eliminar suavemente el agua y reemplácela con el volumen deseado de agua destilada doble. Tenga cuidado de no tocar las larvas al retirar el trabajo de agua rápidamente para asegurarse de que las larvas no desecarse, y añadir suavemente la química de prueba pipeteando contra el lado opuesto del pozo de plástico.
Agregue un volumen adecuado de solución de prueba a cada pozo, y gire suavemente la placa para asegurar una mezcla uniforme. Coloque la placa en una cámara de crecimiento manteniendo un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas a 25 grados centígrados con una humedad relativa del 75 al 85 por ciento. Para comprobar el movimiento de las larvas, toque suavemente la placa.
Si no se observa ningún movimiento, toque suavemente la larva con un palillo de dientes estéril. Puntuar la larva como muerta si no se nota respuesta, y utilizar una hoja de puntuación para registrar el número total de larvas muertas en cada pozo, en el momento de los puntos descritos en el protocolo de texto. Cultivo de tres a cinco días de edad adulto hembra mosquitos en una jaula de plástico de 20 litros.
Etiquete las tazas de papel de nueve onzas con el nombre y la concentración del compuesto de prueba. A continuación, preparar una solución de 10mg/ml en stock del compuesto de ensayo en acetona en un vial de vidrio de 20 ml. A continuación, diluya en serie la solución de stock para obtener las concentraciones de trabajo deseadas.
Limpie la jeringa de vidrio de un ml con acetona. A continuación, llénelo con la solución de ensayo en la concentración adecuada. Fije la jeringa en un microajustador ajustado para entregar un volumen de 0,25 ml.
A continuación, utilice un aspirador para eliminar mosquitos hembra adultos de 10, tres a cinco días de edad de la jaula. Anesthetizarlos durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Luego transfiera los mosquitos a un plato de petri.
Coloque el plato en hielo durante 10 minutos. Con el fin de evitar dañar el mosquito adulto, que podría contribuir a la mortalidad, asegúrese de que no se anestesian en la nevera durante más de cinco minutos, o se inmovilizan sobre hielo durante más de 10, y minimizar el manejo de los mosquitos. Si tiene acceso a una placa fría y a un micromanipulador con una etapa móvil, eso puede minimizar aún más el manejo de los mosquitos.
Use pinzas finas para eliminar cada mosquito del plato. Con el microaconteador de la jeringa aplicar 0.25uL de solución de prueba al tórax dorsal, bajo un microscopio diseccionador Siguiente, transferir los mosquitos a una taza de papel etiquetada sobre hielo. Selle la copa con un cuadrado de malla de 10 por 10 cm y una banda de goma, transfierala a la cámara de crecimiento y registre el número de mosquitos muertos como se describió anteriormente.
Recoger aproximadamente 150 mosquitos hembra adultos de cuatro a cinco días de edad con un aspirador, y transferirlos a una jaula separada. Retire la fuente de azúcar de una a 24 horas antes del ensayo de alimentación. Preparar una solución de 80mM de stock del compuesto de ensayo en agua.
A continuación, diluir en serie con agua, para obtener soluciones de stock de trabajo de las concentraciones deseadas. Para obtener las concentraciones de prueba deseadas, agregue 40uL de cada dilución a 960uL de sangre de conejo defibrinada en un tubo de 1,5 ml, y mezcle por pipeteo. Coloque un filtro de miembro en una unidad de alimentación y séquelo con un anillo de goma.
A continuación, utilice una pipeta para transferir un ml de sangre con solución de análisis a través del puerto de entrega, situado en el reverso de la unidad de alimentación. Conecte la unidad de alimentación a una unidad de calefacción. A continuación, frote suavemente la superficie de la membrana con una solución de ácido láctico 10 por ciento recién preparada.
Coloque la unidad de alimentación en la jaula. Cubra la jaula con un paño oscuro y deje que los mosquitos se alimenten durante una hora. Después de que los mosquitos se alimenten, coloque la jaula en un refrigerador a cuatro grados centígrados durante cinco minutos para anestesiar a los mosquitos.
A continuación, cuente y registre el número total de mosquitos en la jaula. Al examinar el abdomen, contar y registrar el número total de mosquitos hembra alimentados total y parcialmente. Se debe obtener un mínimo de 50 mosquitos alimentados con sangre por dosis.
Retire los mosquitos que no se hayan alimentado. A continuación, transfiera la jaula a una cámara de crecimiento y utilice una hoja de puntuación para registrar el número de mosquitos muertos en los puntos de tiempo adecuados. En el tercer día después de la alimentación de sangre, coloque una taza de huevo en la jaula durante 72 horas.
Utilice un microscopio de disección para contar el número total de óvulos producidos por tratamiento. Se realizó un ensayo de contacto larval para evaluar el efecto de la amitriptilina, un antagonista del receptor de dopamina, en la mortalidad larvaria con el tiempo. Los datos revelaron que el valor de LC 50 disminuye con el tiempo del experimento.
El efecto de la amitriptilina en la mortalidad de mosquitos hembra adultos se comparó con bifentrina, y dos controles negativos. En comparación con los controles negativos tratados con acetona y no tratados, tanto la amitriptilina como la bifentrina indujeron una mortalidad significativa en cada punto de tiempo experimental. Se realizó un ensayo cuantitativo de alimentación para evaluar el efecto de tres dosis diferentes de amitriptilina en la fecundidad y la mortalidad porcentual de los mosquitos hembra adultos.
Los datos no revelaron ninguna diferencia estadísticamente significativa en la fecundidad de los mosquitos alimentados con amitriptilina a la dosis más alta en comparación con sólo los controles alimentados con sangre. Una vez dominado, cualquiera de los ensayos que hemos descrito aquí, puede ser completado en aproximadamente dos horas por un solo individuo, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar manejar suavemente el organismo, y debe haber consistencia durante las aplicaciones tópicas y durante la puntuación larvaria o ensayo adulto.
Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como los bioensayos para evaluar la toxicidad a través de la absorción, a través del mosquito tarsi, el ensayo de botellas de los CDC y el ensayo de tubos de la OMS con el fin de responder a preguntas adicionales sobre la eficacia de la química no formulada, o un producto formulado, y el potencial de desarrollo como insecticida de contacto o aerosol espacial.
Visión general
Este artículo presenta protocolos para evaluar la toxicidad de varias químicas en mosquitos inmaduros y adultos, destinados a desarrollar nuevos larvicidas y adulticidas. Los métodos permiten pruebas de alto rendimiento y evaluaciones de respuesta a la dosis para determinar la toxicidad por contacto o ingestión.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Descubierta de insecticidas
- Control de vectores
- Toxicología
Antecedentes
- Entender la toxicidad de químicas no formuladas es crucial para el control de mosquitos.
- Las pruebas de alto rendimiento pueden evaluar múltiples compuestos eficientemente.
- Los protocolos están diseñados para minimizar el daño físico a los sujetos de prueba.
- Se exploran diferentes rutas de administración para probar las químicas.
Propósito del estudio
- Evaluar la toxicidad de varias químicas en poblaciones de mosquitos.
- Identificar potenciales larvicidas y adulticidas.
- Determinar los métodos de entrega más efectivos para estas químicas.
Métodos utilizados
- Preparación de soluciones madre y diluciones en serie de compuestos de prueba.
- Uso de placas de cultivo de tejidos de 24 pozos para ensayos larvarios.
- Aplicación de soluciones de prueba a mosquitos adultos usando micro-aplicadores.
- Ensayos de alimentación con sangre de conejo defibrinada mezclada con soluciones de prueba.
Resultados principales
- Los protocolos demostraron una evaluación efectiva de la mortalidad de mosquitos larvarios y adultos.
- Los datos indicaron niveles de toxicidad variables de los compuestos probados a lo largo del tiempo.
- La comparación de amitriptilina y bifentrina mostró diferencias significativas en las tasas de mortalidad.
- La capacidad de alto rendimiento permitió la evaluación de numerosos compuestos.
Conclusiones
- Los protocolos desarrollados son valiosos para la investigación de descubrimiento de insecticidas y control de vectores.
- Los resultados pueden guiar el desarrollo de nuevas estrategias de control de mosquitos.
- Se necesitan estudios adicionales para explorar los efectos a largo plazo de estas químicas.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This protocol enables early-stage evaluation of novel insecticidal chemistries against key mosquito vectors, supporting target validation and lead identification in vector control programs. By providing standardized, high-throughput assays for larval and adult toxicity via contact and ingestion routes, it facilitates mechanistic de-risking and predictive confidence in compound prioritization. The approach aids in triaging compounds for further development as larvicides or adulticides, reducing late-stage attrition in pesticide discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of toxicological hypotheses and pathway clarification for novel chemistries against mosquito vectors.
- Operational Value: Supports functional target validation through dose-response mortality assays in Aedes aegypti, Anopheles gambiae, and Culex quinquefasciatus.
- Strategic Value: Provides predictive confidence for portfolio triage by identifying compounds with larvicidal or adulticidal potential early in discovery.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing reproducible toxicity endpoints.
- Operational Value: Enables assay standardization and scalability, allowing evaluation of hundreds of compounds in high-throughput format.
- Strategic Value: Enhances screening readiness and platform reuse for iterative compound testing across delivery routes.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system testing using primary vector species of Zika, dengue, yellow fever, and malaria.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through preclinical validation via consistent mortality and fecundity readouts.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by quantifying toxicity and sublethal effects such as fecundity reduction.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early hit evaluation to lead optimization, particularly for vector control programs seeking novel modes of action.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by quantifying toxicity across species and exposure routes.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs (LC50, mortality rates) for reliable compound evaluation in 24-well and feeding assay formats.
- Analytics: Generates dose-response data and time-course mortality profiles that enable cross-compound comparison and structure-activity relationship initiation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through standardized adult feeding assays and fecundity assessments in disease-relevant mosquito models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for iterative testing of unformulated chemistries across multiple projects and vector species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in toxicity profiling.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across larval contact, adult topical, and blood-feeding assays.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in insecticide development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on species-specific toxicity and delivery route efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito rearing, handling, and assay techniques to avoid artifacts from physical damage.
- Needs analytical balances, micro-applicators, growth chambers with controlled temperature/humidity, and dosing equipment for precise compound delivery.
- Demands cross-team standardization in larval staging, adult age synchronization, and scoring criteria to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when extending protocols to alternative mosquito species or environmental conditions.
- Includes practical limitations such as solvent compatibility (e.g., acetone for topical applications) and the need to minimize organism stress during handling.
