Name: Hoja de luz fluorescencia microscopía para el estudio del corazón murino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Aprende microscopía de hoja de luz con iluminación dual para estudiar el corazón murino en investigación cardíaca. Esta técnica permite imaginar rápidamente cambios estructurales post-terapia génica.

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Los autores desean agradecer a Thao Nguyen y Atsushi Nakano de UCLA para proporcionar la muestra de ratones a la imagen. Este estudio fue apoyado por subvenciones NIH HL118650 (a Tzung K. Hsiai), HL083015 (a Tzung K. Hsiai), HD069305 (y N. C. Chi Tzung K. Hsiai.), HL111437 (a Tzung K. Hsiai y N. C. Chi), HL129727 (a Tzung K. Hsiai), sistema universitario de Texas estrellas financiación (Juhyun Lee).

Todos los procedimientos que implican el uso de animales han sido aprobados por los comités de revisión institucional (IACUC) en la Universidad de California, Los Ángeles, California.
1. proyección de imagen de configuración del sistema
Nota: Ver figura 1 y figura 2.
<ol><li>Recuperar láser onda continua (CW) con 3 longitudes de onda: 405 nm, 473 nm y 532 nm. Poner 2 espejos (M1 y M2) 150 mm aparte y alinearlos con sus planos del espejo a 45° a la viga. Nota: Este paso se realiza para dirigir el láser a la instalación de iluminación de doble cara. El haz resultante estará en la misma dirección que el rayo inicial.</li>
	<li>Pasar el rayo a través de un diámetro de 25 mm diafragma iris/agujero de alfiler (PH), un filtro de densidad neutra de 50 mm de diámetro (FDN) con un rango de densidad óptica de 0 - 4.0, un expansor de haz (BE), una raja de 30 mm (S) con la anchura de ~ 0 - 6 mm y un espejo (M3) , todo colocado 150 mm unos de otros. Coloque el espejo con su plano de espejo a 45° a la viga.</li>
	<li>Pasar el rayo a través de un divisor de viga de 50: 50 a 150 mm de M3. Coloque un espejo (M6) 150 mm desde el divisor de viga y alinearlo para que sea su plano de espejo a 45° para la viga que se emite en la dirección de avance. Utilizar la viga reflejada para formar un lado de la hoja de luz de doble iluminación.</li>
	<li>Coloque un espejo (M4) 150 mm desde el divisor de viga y alinearlo para que sea su plano de espejo a 45° para la viga que fue emitida en un ángulo de 90° desde el divisor de viga. Coloque un segundo espejo (M5) 150 mm del M4 y alinearlo para que sea su plano de espejo a 45° a la viga reflejada de M6. Utilizar la viga emitida de M5 para formar el segundo lado de la hoja de luz de doble iluminación.</li>
	<li>Configurar el sistema de iluminación de doble cara de forma simétrica (ver figura 1). Coloque una lente cilíndrica (CL1) [diámetro (d) = 1; longitud focal (f) = 50 mm] 150 mm en línea con el haz emitido desde M5 a un lado y otra idéntica lente cilíndrica (CL2) 150 mm en la viga emitida por M6 en el otro lado de la doble iluminación setu p. Coloque 2 espejos (M7 y M8) cada uno en consonancia con las lentes cilíndricas a distancias de 50 mm para reflejar el haz a 90 °.</li>
	<li>Forman un doblete acromático de un par de lentes. Coloque la primera lente, L1 (d = 1; f = 100 mm), 100 mm de la M7 y la segunda lente, L2 (d = 1; f = 60 mm), 160 mm de L1. Repita que esto en el otro lado de la doble iluminación con lentes idénticas (L3, L4) colocado a la misma distancia de M8.</li>
	<li>Lugar los espejos, M9 y M10, 60 mm de lentes L2 y L4, respectivamente y en consonancia con la viga. Colocar los objetivos de la iluminación, OL1 y OL2 (d = 2; f = 150 mm), 150 mm de la M9 y M10 y de acuerdo con el rayo. El haz emitido desde los objetivos forma la ficha técnica de iluminación para las muestras de la proyección de imagen.</li>
	<li>Utilice una impresora 3D para imprimir el portamuestras de acrilonitrilo butadieno estireno (ABS). Embeber un trozo de vidrio de cubierta [índice de refracción (RI) = 1.4745] a cada lado de la cámara, perpendicular a la viga de la iluminación, para minimizar la disparidad entre el índice de refracción. Colocar uniformemente la cámara entre las vigas de las lentes del objetivo.</li>
	<li>Instalar un microscopio estéreo con 1 X objetivo de aumento y una cámara de semiconductor (sCMOS) científico del óxido de metal complementario perpendicular la iluminación del plano (ver figura 2).</li>
</ol>2. proyección de imagen de la calibración del sistema
<ol><li>Recuperar los granos del poliestireno fluorescentes que son 0.53 μm de diámetro.</li>
	<li>Preparar la muestra de grano fluorescente diluyendo la solución de grano en una solución de correspondencia para índice de refracción (llantas) con bajo-derretir de 1% agarosa señala a 1: 150, 000. Corte un trozo de tubo de vidrio de borosilicato con un diámetro interior de 12 mm y un diámetro exterior de 18 mm a 30 mm de longitud. Nota: El tubo de vidrio de borosilicato se utiliza para que coincida con el índice de refracción (1,47).</li>
	<li>Mezcle la muestra diluida del grano con agarosa al 1% y pipetear la solución de agarosa/grano en el tubo de borosilicato. Permita que la agarosa se solidifique a temperatura ambiente (23 ° C).</li>
	<li>Llene la cámara ABS (de paso 1.7) con una solución de glicerol 99.5%. Coloque el tubo de vidrio borosilicato que contiene los granos dentro de la cámara. Coloque la cámara ABS en el sistema de proyección de imagen que está en el centro de la viga Gaussian creado por el sistema de iluminación dual.</li>
	<li>Coloque una etapa traslación motorizada 3-d en el tubo de vidrio borosilicato para controlar el movimiento y la orientación de la muestra dentro de la cámara ABS (ver figura 1 complementaria).</li>
	<li>Adquisición de imágenes mediante la cámara sCMOS a una velocidad de 30 fotogramas por segundo (fps). Utilizando el controlador del motor, mover la muestra de 1 mm en dirección lateral y adquirir imágenes en cada incremento de 1 mm, usando la cámara sCMOS. Continúe hasta que toda la muestra ha sido reflejada.</li>
	<li>Las imágenes adquiridas mediante un software de visualización de la pila (véase Tabla de materiales). Medir la función de punto de extensión (PSF) del sistema usando estas imágenes de grano. Utilice este PSF para la deconvolución durante el procesamiento de imágenes en pasos posteriores.</li>
</ol>3. preparación de la muestra
<ol><li>Diseccionar el corazón de un ratón de tipo P1 y de doble heterozigótico sarcolipin-Cre knockin ratón con el gen Rosa26 YFP (SlnCre / +; R26reportero YFP / +) en P7. Nota: La eutanasia fue realizada usando pentobarbital y la técnica descrita por Robbins et al. 10. la disección se realizó según la técnica descrita por el corazón nacional, pulmón y sangre Institute (NHLBI)10,11.</li>
	<li>Realizar un producto claro de los corazones de ratón como descrito por Kevin Sung et al. 12. Nota: Los pasos siguientes deben realizarse en una campana de humos ya que los productos químicos que se utilizan son tóxicos.<ol>
<li>Enjuague los corazones 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS) 3 x 10 min. Después de enjuagar, colocar los corazones en una solución de paraformaldehído al 4% e incubar las muestras a 4 ° C durante la noche.</li>
		<li>Coloque las muestras en una solución de acrilamida del 4% que contiene 0.5% w/v de 2, 2'-Azobis diclorhidrato de. Permita que las muestras a incubar a 4 ° C durante la noche. Después de la incubación durante la noche, retire las muestras e incubar a 37 ° C durante 2-3 h.</li>
		<li>Enjuagar las muestras con PBS y luego colocarlos en una solución de 8% w/v sodio dodecil sulfato y el ácido bórico 1.25% w/v. Incubar las muestras a 37 ° C hasta que estén claras. Esto puede tomar varias horas dependiendo del grosor de la muestra. Después de la tala, sacar las muestras y en 1 x solución salina con tampón fosfato para 1 día.</li>
		<li>Preparar un índice de refracción que solución con 40 g de medio de gradiente de densidad no iónicos (véase Tabla de materiales) en 30 mL de tampón de fosfato de 0.02 M (PB), 0,1% Tween-20 y el 0,01% de azida sódica. Llevar la solución a un pH de 7,5 con hidróxido de sodio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque la muestra limpia en los bordes con un índice de refracción de 1.46 1.48 y 1% agarosa. Inserte la muestra en tubos de vidrio de borosilicato y permitir que la agarosa se solidifique a temperatura ambiente (23 ° C).</li>
	<li>Coloque una etapa traslación motorizada 3-d en el tubo de vidrio borosilicato para controlar el movimiento y orientación de la muestra dentro de la 3D impreso cámara ABS (ver figura 1 complementaria).</li>
</ol>4. proyección de imagen de corazón adulto
<ol><li>Inyecte 8,7 x 1012 virus de vector de virus adeno-asociado tipo 9 (AAV9) que contiene un promotor específico cardiaco troponin T (cTnT) y la proteína verde fluorescente (GFP) en un volumen de 100 μL en la vena de la cola de un ratón de tipo salvaje de 2 meses (C57BL/6). Nota: El AAV9 fue desarrollado según la técnica descrita por Yuan et al. 13. esto hace GFP enlazar con el canal medular externo renal del potasio (ROMK) produciendo AAV9-reposo-ROMK-GFP (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Diseccionar el corazón de ratón adulto a 7,5 meses de edad según la técnica descrita por el NHLBI11. Preparar las muestras siguiendo pasos 3.1-3.3.</li>
	<li>Conectar el controlador del motor al actuador de motor. Fije el actuador a la tubería de vidrio borosilicato para controlar el movimiento y orientación de la muestra dentro de la 3D impreso cámara ABS.</li>
	<li>Coloque la muestra de modo que está en el centro de la viga Gaussian creado por el sistema de iluminación dual. Adquisición de imágenes con la cámara sCMOS a una tasa de 100 fps.</li>
	<li>Utilizando el controlador del motor, mover la muestra de 1 mm en la dirección axial y adquirir imágenes en cada incremento de 1 mm con la cámara del sCMOS. Continúe hasta que toda la muestra ha sido reflejada. Nota: El sistema es controlado por un software de control de instrumentos desarrollados a medida.</li>
	<li>Las imágenes adquiridas mediante un software de visualización de la pila (véase Tabla de materiales). Desarrollar imágenes 3-d usando las pilas de la imagen y el software de visualización14. Deconvolve el PSF del paso 2.6 con la pila de la imagen adquirida. Defina un valor de intensidad umbral de pixel a observar los contornos del corazón pseudo-color para las imágenes basadas en esta intensidad de escala de grises.</li>
</ol>

<ol><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4537058/">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li>
<li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).</li>
<li>High, F. A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+role+of+Notch+in+cardiac+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).</li>
<li>Sachinidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+specific+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+imaging+to+localize+cardiac+lineage+and+protein+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution.</a> Scientific Reports. 7, 42209(2017).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+excision+of+murine+aorta%3B+a+versatile+technique+in+the+study+of+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52172(2014).</li>
<li>National Heart, L., Blood Institute, <a target="_blank" href="http://community.parentprojectmd.org/profiles/blogs/standard-operating-procedures-for-duchenne-animal-models">Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models</a>. , (2015).</li>
<li>Sung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+three-dimensional+tissue+clearing+and+incorporation+of+colorimetric+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping.</a> Scientific Reports. 6, 30736(2016).</li>
<li>Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+adeno-associated+virus+vector+producer+cell+line+method+for+scalable+vector+production+of+different+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes.</a> Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).</li>
<li>FEI, <a target="_blank" href="https://www.fei.com/software/amira-user-guide/">Amira User's Guide</a>. , Konrad-Zuse-Zentrum fur Informationstechnik. Berlin. 59-138 (2017).</li>
<li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+3D+dynamics+in+thickly+fluorescent+specimens+beyond+the+diffraction+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit.</a> Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).</li>
<li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+light-sheet+imaging+with+virtual+reality+to+recapitulate+developmental+cardiac+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El sistema de LSFM y técnica descrita aquí utiliza un haz de iluminación de doble cara, combinado con una compensación óptica a imagen del corazón de ratón en etapas de su desarrollo postnatales y adulto. Un haz de iluminación única tradicional sufre de dispersión del fotón y la absorción a través de las muestras de tejido más grueso y más grande de1,3. Las vigas de doble cara ofrecen una iluminación más uniforme de la muestra, reduciendo así el efecto de rayas y...

Microscopía de fluorescencia de luz-hoja técnica desarrollado en 1903 y se utiliza hoy como un método para el estudio de expresión génica y también para producir modelos 3D o 4D de las muestras de tejido1,2,3. Este método de imagen utiliza una hoja fina de la luz para iluminar un solo plano de una muestra para que sólo ese plano es capturado por el detector. La muestra entonces puede mover en la dirección axial para capturar cada capa, una sección a la vez y renderizar un modelo 3-d después de post-procesamiento de las imágenes adquiridas4. Sin embargo, debido a la absorción y dispersión de fotones, LSFM se ha limitado a las muestras que son ópticamente transparente1o sea unos pocos micrones de espesor.
Las limitaciones de LSFM han conducido a estudios de organismos que tienen los tejidos que son ópticamente transparentes, como el pez cebra. Que implica la diferenciación y desarrollo cardíaco son a menudo estudios en pez cebra ya que hay genes conservados entre los seres humanos y de pez cebra5,6. Aunque estos estudios han llevado a avances en la investigación cardiaca miocardiopatías6,7, todavía hay una necesidad para llevar a cabo investigaciones similares en organismos superiores como los mamíferos.
Tejido cardiaco mamífero presenta un desafío debido al grosor y opacidad de los tejidos, la absorción debido a la hemoglobina en los glóbulos rojos y las bandas que se produce debido a la iluminación de un solo lado de la muestra bajo tradicional LSFM métodos1 , 8. para compensar estas limitaciones, nos propone utilizar iluminación de doble cara y una versión simplificada de la claridad técnica9 combinado con un índice de refracción que solución (bordes). Por lo tanto, este sistema permite la proyección de imagen de una muestra que es mayor que 10 x 10 x 10 mm3 , mientras que mantener una buena calidad de resolución axial y lateral planos8.
Este sistema primero se calibró usando perlas fluorescentes dispuestas en diferentes configuraciones dentro de los tubos de vidrio. Entonces, el sistema fue utilizado para corazones murinos postnatales y adulto de la imagen. En primer lugar, el corazón postnatal del ratón era reflejado en 7 días (P7) a la cavidad ventricular, el espesor de la pared ventricular, las estructuras de la válvula y la presencia de trabeculación. En segundo lugar, se realizó un estudio para identificar las células que se diferencian en cardiomiocitos usando un corazón de ratón después del parto en 1 día (P1) con cardiomiocitos Cre-etiquetados y proteína fluorescente amarilla (YFP). Finalmente, fueron imágenes de ratones adultos a los 7,5 meses para observar la presencia de potasio medular externo renal canales (ROMK) después de la terapia de gene8.

<table><tbody><tr><td>CW Laser</td><td>Laserglow Technologies</td><td>LMM-GBV1-PF3-00300-05</td><td>Excitación de fluoróforos Filtro de</td></tr><tr><td>densidad neutra</td><td>Thorlabs</td><td>NDC-50C-4M</td><td>Controla la cantidad de luz que entra en el sistema</td></tr><tr><td>Expansor de haz acromático</td><td>Thorlabs</td><td>GBE05-A</td><td>Expande el haz de luz</td></tr><tr><td>Ranura mecánica</td><td>Thorlabs</td><td>VA100C</td><td>Controla la anchura del haz</td></tr><tr><td>Divisor de haz</td><td>Thorlabs</td><td>BS013</td><td>Formas haz de doble iluminación</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico con lente de objetivo 1X</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td>Se utiliza para la observación de muestras</td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 LT Cámara sCMOS</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-42U</td><td>Se utiliza para capturar imágenes</td></tr><tr><td>Acrilonitrilo butadieno estireno (ABS)</td><td>Stratasys</td><td>uPrint</td><td>Material utilizado para imprimir en 3D un portamuestras</td></tr><tr><td>Perlas de poliestireno fluorescente</td><td>Spherotech Inc</td><td>PP-05-10</td><td>Se utiliza para la calibración del sistema de imágenes</td></tr><tr><td>Tubo de vidrio de borosilicato</td><td>Corning</td><td>Pyrex 7740</td><td>Tubo para la inclusión de muestras</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td>Relleno para cámara de muestras</td></tr><tr><td>Salina tamponada con fosfato</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>BP39920 Solución de enjuague para corazones de ratón</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>RT-15700</td><td>Primera solución de incubación</td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Wako Chemicals</td><td>AAL-107</td><td>Mezclado con diclorhidrato de 2,2'-Azobis para la segunda solución de incubación para corazones</td></tr><tr><td>de ratón 2,2'-Clorhidrato de Azobis</td><td>Wako Chemicals</td><td>VA-044</td><td>Mezclado con acrilamida para la segunda solución de incubación para corazones</td></tr> <tr><td>de ratónDodecil sulfato de sodio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71725</td><td>Mezclado con ácido bórico para la tercera solución de incubación para corazones de ratón</td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Fischer Scientific</td><td>A74-1</td><td>Mezclado con dodecil sulfato de sodio para la tercera solución de incubación para corazones de ratón</td></tr><tr><td>Sigma D2158</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2158</td><td>Mezclado con PB, Tween-20 y azida de sodio como solución de coincidencia de índice de refracción</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11332465001</td><td>Mezclado con Sigma D2158, PB y azida de sodio como solución de coincidencia de índice de refracción</td></tr><tr><td>Azida de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>Mezclado con Sigma D2158, PB y Tween-20 como solución de coincidencia de índice de refracción</td></tr><tr><td>Vector de virus adenoasociado 9 con un promotor de troponina T específico del corazón marcado con GFP</td><td>Vector Biolabs</td><td>VB2045</td><td>Expresa GFP cuando se une al</td></tr><tr><td>actuador de servomotor de CC</td><td>ROMK Thorlabs</td><td>Z825B</td><td>Se utiliza para el movimiento de la muestra en dirección axial dentro de la lámina de luz</td></tr><tr><td>K-Cube Controlador de servomotor de CC cepillado</td><td>Thorlabs</td><td>KDC101</td><td>Se conecta al actuador del motor y controla el movimiento del actuador</td></tr><tr><td>Software AMIRA</td><td>FEI</td><td>N/A</td><td>Software de visualización para la producción de imágenes 2D y 3D</td></tr></tbody></table>

hoja de luz fluorescencia microscopía para el estudio del corazón murino

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Microscopía de fluorescencia de la hoja de luz ha sido ampliamente utilizado para la adquisición rápida de la imagen con una resolución axial de micrómetro a escala milimétrica. Técnicas tradicionales de la hoja de luz incluyen el uso de un haz de iluminación único dirigido ortogonalmente en el tejido de muestra. Imágenes de muestras grandes que se producen con un rayo de iluminación solo contienen rayas o artefactos y sufren una resolución reducida debido a la dispersión y la absorción de luz por el tejido. Este estudio utiliza un haz de iluminación de doble cara y una simplificada claridad óptica compensación técnica al corazón murino. Estas técnicas permiten la proyección de imagen profunda mediante la eliminación de lípidos desde el corazón y producen un gran campo de imágenes, superior a 10 x 10 x 10 mm3. Como resultado, esta estrategia nos permite cuantificar las dimensiones ventriculares, rastrear el linaje cardiaco y localizar la distribución espacial de proteínas cardiacas específicas y canales iónicos de la post-natal a corazones de ratón adulto con suficiente contraste y resolución.

La técnica descrita aquí utiliza un haz de iluminación de doble cara, combinado con una compensación óptica de las muestras de tejido de corazón de ratón para lograr una profundidad de imagen más profunda y mayor volumen de imágenes con suficiente resolución de imagen (figura 1). Para calibrar el sistema, perlas fluorescentes fueron colocados dentro del tubo de vidrio y dentro del sistema de proyección de imagen. Los granos fueron luego reflejados y visualiza...

Este estudio utiliza una técnica de microscopía (LSFM) de hoja de luz fluorescencia iluminación doble cara combinada con la compensación óptica para estudiar el corazón murino.

Hoja de luz fluorescencia microscopía para el estudio del corazón murino

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

La principal ventaja de esta tecnología es que permite tomar imágenes rápidas del corazón del ratón. Y se puede utilizar para observar la presencia de canales de aire después de la terapia génica. Aunque este método puede proporcionar información sobre la cardiología del desarrollo, también se puede aplicar a otros sistemas, como la neurología y la neumología.Generalmente, los individuos tendrán problemas con esta técnica porque montar una imagen del corazón adulto del ratón puede ser difícil, y es diferente de otras técnicas tradicionales, como la microscopía confocal e invertida. Coloque un láser de onda continua con tres longitudes de onda de 405 nanómetros, 473 nanómetros y 532 nanómetros. A continuación, coloque la simetría uno y alinee con el plano de espejo a 45 grados a la viga.Esto dirigirá el láser hacia el divisor de haz, que forma la configuración de iluminación de doble cara. A continuación, pase la viga a través de un filtro de densidad neutra de 50 milímetros de diámetro, un expansor de viga y un agujero de pasador de 25 milímetros de diámetro, todos colocados a 150 milímetros entre sí. Pasar la viga a través de un divisor de 50-50 vigas, colocado 150 milímetros desde el agujero.A continuación, coloque el espejo a dos 150 milímetros del divisor de viga, a 90 grados hasta la viga delantera, y alinee para que su plano de espejo esté en un ángulo de 45 grados con respecto a la viga. A continuación, coloque el espejo a tres 100 milímetros del espejo dos y alinee para que su plano de espejo esté en un ángulo de 45 grados con respecto a la viga reflejada desde el espejo dos. Utilice este haz reflejado para formar un lado de la lámina de luz de iluminación dual.En el otro lado del divisor de viga, coloque el espejo cinco para que su plano de espejo esté a 45 grados de la viga que se emite en una dirección de avance. Utilice el haz emitido desde el espejo cinco para formar el segundo lado de la lámina de luz de iluminación doble. A continuación, configure el sistema de iluminación de doble cara de forma sistémica.Coloque la lente cilíndrica a dos 150 milímetros del espejo tres, y otra lente cilíndrica idéntica a 150 milímetros del espejo cinco, al otro lado de la configuración de iluminación dual. A continuación, coloque dos espejos, cada uno en línea con las lentes cilíndricas, a distancias de 50 milímetros para reflejar el haz a 90 grados. A ambos lados de la lámina de luz, forma un doblete acromático a partir de un par de lentes, con la primera lente colocada a 100 milímetros del espejo anterior, y con un diámetro de una pulgada y una distancia focal de 100 milímetros.La segunda lente debe colocarse a 160 milímetros de la lente uno, con un diámetro de una pulgada, y una distancia focal de 60 milímetros. A continuación, coloque los objetivos de iluminación uno y dos de 150 milímetros de los dobletes acromáticos anteriores, de modo que estén en línea con la viga. El haz emitido por los objetivos forma la hoja de luz para la toma de imágenes de las muestras.En primer lugar, prepare la muestra de perlas fluorescentes diluyendo una solución de perlas de 0,53 micrómetros, de uno a 150.000, en una solución de coincidencia de índice de refracción precale calentada, con una agarosa de punto de fusión un % bajo. A continuación, utilice un pedazo de tubo de vidrio borosilicato con un diámetro interior de 12 milímetros, y un diámetro exterior de 18 milímetros, a una longitud de 30 milímetros. Pipetear la solución de agarosa en el tubo de borosilicato y permitir que la agarosa se solidifique a temperatura ambiente.Ahora, llene una cámara ABS impresa en 3D con una solución de giro del 99,5 por ciento. Coloque el tubo de vidrio borosilicato, que contiene las cuentas, dentro de la cámara. Fije una etapa traslacional motorizada 3D al tubo de vidrio borosilicato para controlar el movimiento y la orientación de la muestra dentro de la cámara ABS.A continuación, utilice software diseñado a medida para adquirir imágenes utilizando la cámara sCMOS, a una velocidad de 30 fotogramas por segundo. Usando el controlador del motor, mueva la muestra un milímetro en la dirección lateral y adquiera imágenes en cada incremento de un milímetro, hasta que se haya hecho una imagen de toda la muestra. Apile las imágenes adquiridas utilizando un software de visualización y mida la función de propagación de puntos del sistema utilizando estas imágenes de cordón.Utilice una solución de coincidencia de índice de refracción, con un pH de 7,5, y disuelva el uno por ciento de agarosa en la solución coincidente. Coloque una muestra de corazón de ratón adulto transparente en la solución de coincidencia del índice de refracción, con un uno por ciento de agarosa disuelta. A continuación, inserte la muestra en un tubo de vidrio de borosilicato y deje que la agarosa se solidifique a temperatura ambiente.Fije una etapa traslacional motorizada 3D al tubo de vidrio borosilicato para controlar el movimiento y la orientación de la muestra dentro de una cámara ABS impresa en 3D. Coloque la muestra de modo que esté en el centro del haz gaussiano, creado por el sistema de iluminación dual. A continuación, establezca la velocidad de adquisición de la cámara sCMOS en 30 fotogramas por segundo.Ahora, usando el controlador del motor, mueva la muestra un milímetro en la dirección axial y adquiera imágenes en cada incremento de un milímetro. Continúe hasta que se haya hecho una imagen de toda la muestra. Apile las imágenes adquiridas utilizando un software de visualización.Desarrolle las imágenes 3D utilizando estas pilas de imágenes. Para lograr esto, deconvolgue la función de propagación de puntos determinada anteriormente y utiliúcela para las pilas de imágenes adquiridas. Por último, establezca un valor de intensidad de umbral de píxeles para observar los contornos del corazón y agregue pseudocolor a las imágenes, en función de esta intensidad de escala de grises.En el primer día postnatal, se pueden visualizar las válvulas, la aurícula, el ventrículo, el músculo pectinato y la trabeculación, entre otras características. En el día siete postnatal, las características están aún más definidas. La aurícula, el ventrículo, las dimensiones de la cavidad ventricular y el grosor de la pared del ventrículo son evidentes.Para estudiar la diferenciación de cardiomiocitos dentro del corazón, los ratones heterocigotos fueron etiquetados con cre para mostrar cardiomiocitos. Las celdas etiquetadas se muestran aquí, en cada dirección del plano. Los tres planos se fusionaron, para crear una representación tridimensional del corazón.La región de círculo rojo dentro del recuadro muestra dos corazones de ratón translúcidos después de someterse a la técnica de claridad y ser insertado en el tubo de vidrio borosilicato. Además de estudiar ratones postnatales, el sistema de imágenes también se puede utilizar para estudiar el corazón adulto del ratón. Aquí, los canales ROMK etiquetados con GFP se muestran a los 7,5 meses.Estos se encontraron principalmente en la pared ventricular. Una vez masterada, esta técnica se puede hacer en uno o dos minutos. Al intentar este procedimiento, es importante eliminar todas las burbujas alrededor de la muestra en el tubo.Otros métodos, como la segmentación automática de las pilas de imágenes, se pueden realizar para responder preguntas adicionales relacionadas con lesiones cardiovasculares y regeneración. Después de su desarrollo, esta técnica fue utilizada por los investigadores para estudiar la arquitectura cardíaca en etapas de desarrollo postnatal y adulto en ratones.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

En el corazón, los eventos moleculares coordinan la función eléctrica y contráctil del órgano. Un conjunto de técnicas de microscopía de fluorescencia de campo locales que aquí se presenta permite el registro de las variables celulares en los corazones intactos. La identificación de los mecanismos que definen la función cardíaca es fundamental para entender cómo el corazón trabaja en situaciones patológicas.

El campo local microscopía de fluorescencia: Imágenes señales celulares en los corazones intactos

En este sentido, describimos un microscopio de luz para visualizar el infiltrado de leucocitos CD45 + cardíaco en un modelo murino de miocarditis fulminante aséptica, que es inducido por el tratamiento de la toxina diftérica intratraqueal de ratones CD11c.DTR.

Visualización Cuantitativa del Infiltrado de Leucocitos en un Modelo Murino de Miocarditis Fulminante por Microscopía de Hoja Ligera

Aquí, presentamos un protocolo para visualizar el desarrollo de corazón en pez cebra en 4 dimensiones (4D). Imagen 4-D, mediante microscopía de fluorescencia de luz-hoja (LSFM), toma 3 dimensiones (3D) imágenes en el tiempo, reconstruir el corazón en desarrollo. Mostramos cualitativamente y cuantitativamente que esa tensión de esquileo activa endocárdica muesca señalización durante el desarrollo de la cámara, que promueve la trabeculación cardiaca.

Microscopía de fluorescencia de la hoja de luz para capturar imágenes de 4 dimensiones de los efectos de la modulación de la tensión de esquileo en el corazón de pez cebra en desarrollo

Describimos herramientas optimizadas para estudiar el corazón de pez cebra in vivo con microscopía de fluorescencia de lámina de luz. Específicamente, sugerimos líneas transgénicas cardíacas brillantes y presentamos nuevas técnicas suaves de incrustación e inmovilización que evitan defectos de desarrollo y cardíacos. También se proporciona una posible línea de adquisición y análisis de datos adaptada a las imágenes cardíacas.

Microscopía de hoja de luz de dinámica cardíaca rápida en embriones de pez cebra

Presentamos un método para la reconstrucción mesoscópica de todo el corazón del ratón mediante la combinación de nuevos avances en la transformación de tejidos y la tinción con el desarrollo de un microscopio de hoja de luz escaneado axialmente.

Imágenes ópticas mesoscópicas del corazón de todo el ratón

Este protocolo demuestra el aislamiento guiado por microscopía y la tinción por inmunofluorescencia de las venas pulmonares murinas. Preparamos muestras de tejido que contienen la aurícula izquierda, las venas pulmonares y los pulmones correspondientes y las teñimos para troponina T cardíaca y conexina 43.

Microdisección y tinción con inmunofluorescencia de mangas miocárdicas en venas pulmonares murinas

El protocolo utiliza microscopía avanzada de lámina de luz junto con métodos de limpieza de tejidos adaptados para investigar estructuras cardíacas intrincadas en corazones de roedores, con un gran potencial para la comprensión de la morfogénesis y la remodelación cardíaca.

Imágenes con lámina de luz para revelar la estructura cardíaca en corazones de roedores

La reconstrucción tridimensional (3D) del daño cardíaco en el infarto agudo de miocardio reperfundido (repAMI) permite la cuantificación fiel y la colocalización de los patrones asociados que afectan a la enfermedad. Aquí, se proporciona un enfoque de imágenes automatizado guiado por hojas de luz para la medición contemporánea del daño cardíaco, el área en riesgo y la respuesta de las células inmunitarias.

Análisis 3D simultáneo del daño cardíaco y la respuesta inmune en el infarto agudo de miocardio reperfundido mediante microscopía de fluorescencia de hoja de luz

Un biorreactor presión cíclica capaz de someter a los tejidos del corazón de la válvula de presión a las condiciones fisiológicas y patológicas ha sido diseñado. Un programa LabVIEW permite a los usuarios para controlar la presión magnitud, amplitud y frecuencia. Este dispositivo puede ser utilizado para estudiar el tejido mecanobiología de las válvulas del corazón o células aisladas.

Diseño de un biorreactor de presión cíclica de la Ex Vivo Estudio de las válvulas aórtica del corazón

Una metodología para estimar las orientaciones de fibras ventriculares de imágenes in vivo de las geometrías del corazón del paciente para el modelado personalizado se describe. Validación de la metodología a cabo utilizando normal y no corazones caninos demostrar que que no hay diferencias significativas entre las orientaciones de las fibras estimados y adquirido a un nivel clínicamente observable.

Modelado específico del paciente del corazón: Estimación de las orientaciones de las fibras ventriculares

Aprende microscopía de hoja de luz con iluminación dual para estudiar el corazón murino en investigación cardíaca. Esta técnica permite imaginar rápidamente cambios estructurales post-terapia génica.

Hoja de luz fluorescencia microscopía para el estudio del corazón murino

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