Hoja de luz fluorescencia microscopía para el estudio del corazón murino

La principal ventaja de esta tecnología es que permite tomar imágenes rápidas del corazón del ratón. Y se puede utilizar para observar la presencia de canales de aire después de la terapia génica. Aunque este método puede proporcionar información sobre la cardiología del desarrollo, también se puede aplicar a otros sistemas, como la neurología y la neumología.

Generalmente, los individuos tendrán problemas con esta técnica porque montar una imagen del corazón adulto del ratón puede ser difícil, y es diferente de otras técnicas tradicionales, como la microscopía confocal e invertida. Coloque un láser de onda continua con tres longitudes de onda de 405 nanómetros, 473 nanómetros y 532 nanómetros. A continuación, coloque la simetría uno y alinee con el plano de espejo a 45 grados a la viga.

Esto dirigirá el láser hacia el divisor de haz, que forma la configuración de iluminación de doble cara. A continuación, pase la viga a través de un filtro de densidad neutra de 50 milímetros de diámetro, un expansor de viga y un agujero de pasador de 25 milímetros de diámetro, todos colocados a 150 milímetros entre sí. Pasar la viga a través de un divisor de 50-50 vigas, colocado 150 milímetros desde el agujero.

A continuación, coloque el espejo a dos 150 milímetros del divisor de viga, a 90 grados hasta la viga delantera, y alinee para que su plano de espejo esté en un ángulo de 45 grados con respecto a la viga. A continuación, coloque el espejo a tres 100 milímetros del espejo dos y alinee para que su plano de espejo esté en un ángulo de 45 grados con respecto a la viga reflejada desde el espejo dos. Utilice este haz reflejado para formar un lado de la lámina de luz de iluminación dual.

En el otro lado del divisor de viga, coloque el espejo cinco para que su plano de espejo esté a 45 grados de la viga que se emite en una dirección de avance. Utilice el haz emitido desde el espejo cinco para formar el segundo lado de la lámina de luz de iluminación doble. A continuación, configure el sistema de iluminación de doble cara de forma sistémica.

Coloque la lente cilíndrica a dos 150 milímetros del espejo tres, y otra lente cilíndrica idéntica a 150 milímetros del espejo cinco, al otro lado de la configuración de iluminación dual. A continuación, coloque dos espejos, cada uno en línea con las lentes cilíndricas, a distancias de 50 milímetros para reflejar el haz a 90 grados. A ambos lados de la lámina de luz, forma un doblete acromático a partir de un par de lentes, con la primera lente colocada a 100 milímetros del espejo anterior, y con un diámetro de una pulgada y una distancia focal de 100 milímetros.

La segunda lente debe colocarse a 160 milímetros de la lente uno, con un diámetro de una pulgada, y una distancia focal de 60 milímetros. A continuación, coloque los objetivos de iluminación uno y dos de 150 milímetros de los dobletes acromáticos anteriores, de modo que estén en línea con la viga. El haz emitido por los objetivos forma la hoja de luz para la toma de imágenes de las muestras.

En primer lugar, prepare la muestra de perlas fluorescentes diluyendo una solución de perlas de 0,53 micrómetros, de uno a 150.000, en una solución de coincidencia de índice de refracción precale calentada, con una agarosa de punto de fusión un % bajo. A continuación, utilice un pedazo de tubo de vidrio borosilicato con un diámetro interior de 12 milímetros, y un diámetro exterior de 18 milímetros, a una longitud de 30 milímetros. Pipetear la solución de agarosa en el tubo de borosilicato y permitir que la agarosa se solidifique a temperatura ambiente.

Ahora, llene una cámara ABS impresa en 3D con una solución de giro del 99,5 por ciento. Coloque el tubo de vidrio borosilicato, que contiene las cuentas, dentro de la cámara. Fije una etapa traslacional motorizada 3D al tubo de vidrio borosilicato para controlar el movimiento y la orientación de la muestra dentro de la cámara ABS.

A continuación, utilice software diseñado a medida para adquirir imágenes utilizando la cámara sCMOS, a una velocidad de 30 fotogramas por segundo. Usando el controlador del motor, mueva la muestra un milímetro en la dirección lateral y adquiera imágenes en cada incremento de un milímetro, hasta que se haya hecho una imagen de toda la muestra. Apile las imágenes adquiridas utilizando un software de visualización y mida la función de propagación de puntos del sistema utilizando estas imágenes de cordón.

Utilice una solución de coincidencia de índice de refracción, con un pH de 7,5, y disuelva el uno por ciento de agarosa en la solución coincidente. Coloque una muestra de corazón de ratón adulto transparente en la solución de coincidencia del índice de refracción, con un uno por ciento de agarosa disuelta. A continuación, inserte la muestra en un tubo de vidrio de borosilicato y deje que la agarosa se solidifique a temperatura ambiente.

Fije una etapa traslacional motorizada 3D al tubo de vidrio borosilicato para controlar el movimiento y la orientación de la muestra dentro de una cámara ABS impresa en 3D. Coloque la muestra de modo que esté en el centro del haz gaussiano, creado por el sistema de iluminación dual. A continuación, establezca la velocidad de adquisición de la cámara sCMOS en 30 fotogramas por segundo.

Ahora, usando el controlador del motor, mueva la muestra un milímetro en la dirección axial y adquiera imágenes en cada incremento de un milímetro. Continúe hasta que se haya hecho una imagen de toda la muestra. Apile las imágenes adquiridas utilizando un software de visualización.

Desarrolle las imágenes 3D utilizando estas pilas de imágenes. Para lograr esto, deconvolgue la función de propagación de puntos determinada anteriormente y utiliúcela para las pilas de imágenes adquiridas. Por último, establezca un valor de intensidad de umbral de píxeles para observar los contornos del corazón y agregue pseudocolor a las imágenes, en función de esta intensidad de escala de grises.

En el primer día postnatal, se pueden visualizar las válvulas, la aurícula, el ventrículo, el músculo pectinato y la trabeculación, entre otras características. En el día siete postnatal, las características están aún más definidas. La aurícula, el ventrículo, las dimensiones de la cavidad ventricular y el grosor de la pared del ventrículo son evidentes.

Para estudiar la diferenciación de cardiomiocitos dentro del corazón, los ratones heterocigotos fueron etiquetados con cre para mostrar cardiomiocitos. Las celdas etiquetadas se muestran aquí, en cada dirección del plano. Los tres planos se fusionaron, para crear una representación tridimensional del corazón.

La región de círculo rojo dentro del recuadro muestra dos corazones de ratón translúcidos después de someterse a la técnica de claridad y ser insertado en el tubo de vidrio borosilicato. Además de estudiar ratones postnatales, el sistema de imágenes también se puede utilizar para estudiar el corazón adulto del ratón. Aquí, los canales ROMK etiquetados con GFP se muestran a los 7,5 meses.

Estos se encontraron principalmente en la pared ventricular. Una vez masterada, esta técnica se puede hacer en uno o dos minutos. Al intentar este procedimiento, es importante eliminar todas las burbujas alrededor de la muestra en el tubo.

Otros métodos, como la segmentación automática de las pilas de imágenes, se pueden realizar para responder preguntas adicionales relacionadas con lesiones cardiovasculares y regeneración. Después de su desarrollo, esta técnica fue utilizada por los investigadores para estudiar la arquitectura cardíaca en etapas de desarrollo postnatal y adulto en ratones.