Name: Metodología para la detección exacta de la metilación del ADN mitocondrial (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Aprende a cuantificar con precisión la metilación del ADN mitocondrial mediante secuenciación con bisulfito y un pipeline bioinformático. Este método evita la sobreestimación mediante digestión con BamHI.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Novo Nordisk Fundación Centro para la investigación metabólica básica es un centro independiente de investigación en la Universidad de Copenhague, parcialmente financiado por una donación sin restricciones de la Fundación de Novo Nordisk.

1. tratamiento enzimático de la restricción
<ol><li>Alinear el mtDNA por tratar el DNA humana total con la enzima de restricción BamHI, que corta en la posición 14258 en el ADN mitocondrial humano. Nota: Para ADN de ratón, utilice la enzima de restricción BglII en condiciones idénticas como abajo.</li>
	<li>Para cada muestra donde metilación del mtDNA es evaluarse, preparar un tubo de reacción de 0.2 mL y añadir el siguiente mezcla: 3 μg ADN genómico (cuantificado por fluorometría), 15 μL tampón 3, 3 μL BamHI y agua hasta de 150 μL</li>
	<li>Colocar los tubos en un termociclador durante 4 h a 37 ° C.</li>
</ol>2. bisulfito conversión
<ol><li>Convertir el ADN BamHI-tratado con bisulfito de sodio como se describe en otra parte29.</li>
	<li>Utilizar 200-500 ng de ADN tratados con BamHI para cada reacción de conversión en un volumen total de 20 μL. La recuperación de ADN es 50-70%.</li>
	<li>Eluir la DNA bisulfito-convertido en tampón de elución de 10 μL.</li>
	<li>Cuantificar el ADN por fluorometría.</li>
	<li>Opcional: Almacenar DNA bisulfito-convertido a-20 ° C antes de continuar el resto del protocolo. Para el almacenamiento a largo plazo, almacenar DNA bisulfito-convertido a-80 ° C</li>
</ol>3. diseño de bisulfito de cebadores de secuencia
<ol><li>Diseño de iniciadores para la secuenciación de bisulfito usando las herramientas en línea Methprimer30 y31,de BiSearch32. Nota: Methprimer y BiSearch permiten para buscar secuencias de primer enlace en secuencias genómicas donde cytosines se convierten en thymines, semejantemente al bisulfito post tratamiento.</li>
	<li>Para la amplificación óptima e imparcial, evitar dinucleótidos CpG en las cartillas y diseñar el tamaño de amplicón entre 100-300 bp.</li>
	<li>Que sean diseñados primers específicos para el ADN mitocondrial usando la función de BiSearch Primer búsqueda. Inserte los cebadores ya diseñados bisulfito convertido, marque la casilla de bisulfito e incluyen un genoma de referencia y parámetros de la polimerización en cadena. Nota: Se mostrará una lista de posibles productos PCR.</li>
	<li>Copiar la parte superior de secuencias de la cartilla de 1-5 y pegar en un formulario de pedido para síntesis de oligonucleótidos. Nota: Una lista de los humanos y secuencias de la cartilla de mtDNA ratón que ha sido validado en el laboratorio se muestra en la tabla 1.</li>
	<li>Cartillas de prueba utilizando bisulfito convierten PCR después de electroforesis en gel de agarosa como se describe en el paso 4. Probar y optimizar por separado todos los pares de la cartilla y el tamaño de amplicón correcta aparece en el gel de agarosa. Nota: Si necesitan cebadores multiplexación, añadir cartillas múltiples a una sola reacción de PCR y visualizar los productos PCR en electroforesis en gel de agarosa o, un método más resolutivo como electroforesis en gel de poliacrilamida, para distinguir productos de similares tamaño.</li>
</ol>4. bisulfito convertido PCR y extracción del Gel
<ol><li>Para amplificar las regiones de interés, realizar PCR utilizando una polimerasa de Taq hot start. Brevemente, mezcla 100 ng convertido ADN, 500 μm cebadores sentido y anti-sentido, mezcla de dNTP 1 μl (10 μm de cada dNTP) y polimerasa en 7,5 U reacción en un volumen total de 50 μl. ejecutar PCR con las siguientes condiciones: 5 min a 95 ° C (60 s 94 ° C, 60 s 55 ° C *; 60 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 ciclos; 10 min 72 ° C. Utilizar cebadores ya sea por separado o multiplexados.</li>
	<li>Opcional: Al multiplexación cartillas, uso 200 ng convierte en ADN y las siguientes condiciones bicicleta: 5 min 95 ° C (60 s 94 ° C; 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 ciclos; 10 min 72 ° C. Nota: La temperatura puede variar dependiendo de la temperatura de fusión de los primers.</li>
	<li>Productos PCR sujetos a gelificarse electroforesis en agarosa al 2% de 100 voltios.</li>
	<li>Bajo la suave luz de UV, extraer productos de PCR con un bisturí y añadir a microtubos. No exponga los productos PCR a la luz UV excesiva para evitar daños en el ADN. Evitar el tiempo de exposición de más de 30 s.</li>
	<li>Purificar los productos PCR usando gel de purificación como se describió anteriormente3.</li>
	<li>Cuantificar el ADN purificado de paso 4.5 mediante fluorometría. Proceda al paso 5 o del almacén de muestras a-20 ° C.</li>
</ol>5. secuencia biblioteca elaboración de bisulfito
<ol><li>Realizar la preparación de la biblioteca de productos PCR convertido a bisulfito. Opcional: múltiplex productos de PCR en esta etapa.</li>
	<li>Realizar reparación final con hasta 100 ng del producto de PCR. Agregar 3 μl final preparación enzima y 6,5 μl finales reparación reacción de tampón (10 x) a 55,5 μl del producto de PCR en un tubo de 0.2 mL. Lugar e incubar los tubos en un termociclador durante 30 min a 20 ° C, seguida por 30 min a 65 ° C.</li>
	<li>Ligan adaptadores de secuencia mezclando el ADN reparado final con 15 μl Blunt/TA ligasa mezclar, 2,5 μl adaptador y potenciador de la ligadura de 1 μl. Si utiliza &lt; 100 producto PCR de ng como entrada, adaptador de diluir 10 veces.</li>
	<li>Colocar la mezcla (paso 5.3) en un termociclador e incubar 15 min a 20 ° C. Hacer una pausa en el termociclador y agregar 3 μl usuario enzima al tubo. Mezcla y vuelva a colocar el tubo en el termociclador e incubar 15 min a 37 ° C.</li>
	<li>Tamaño Seleccione el ADN ligada adaptador usando granos de sólido fase Reversible inmovilización (SPRI) con diferentes proporciones de granos al ADN dependiendo de tamaño del producto PCR.</li>
	<li>Añadir 13,5 μl de H2O a ADN ligada adaptador de paso 5.4 y 55 μl resuspendió SPRI granos. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos y lugar el tubo sobre un soporte magnético. Cuando la solución esté clara, transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y deseche el tubo que contiene los granos. Nota: El sobrenadante contiene el ADN ligada adaptador y grandes fragmentos no deseados están limitados a los granos descartados.</li>
	<li>Añadir 25 μl resuspendió SPRI cuentas al sobrenadante del paso 5.6, mezclar e incube durante 5 min a temperatura ambiente. Coloque el tubo en el soporte magnético y descarte el sobrenadante cuando la solución es clara. Nota: El sobrenadante desechado contiene ADN no deseado, mientras que el ADN ligada por el adaptador está enlazado a granos.</li>
	<li>Mientras el tubo está en el soporte magnético, agregar 200 μL 80% de etanol (recién preparado) para lavar los granos. Incubar 30 s y quite y descarte el sobrenadante. Repita este paso para un total de 2 lavados.</li>
	<li>Aire seco granos durante 5 minutos mientras que el tubo está en soporte magnético con una tapa abierta.</li>
	<li>Retirar el tubo del imán, eluir el ADN en 23 μl de tampón de elución y mezclar. Incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos.</li>
	<li>Coloque el tubo sobre un soporte magnético y cuando la solución esté clara, transferir 2 μL en una placa PCR de 96 pocillos para la amplificación de pre-PCR (paso 5.14).</li>
	<li>Transferir el resto aproximadamente 21 μl a un nuevo tubo 0.2 mL para amplificación por PCR (paso 5.17). Nota: No olvide transfiera cualquier granos como granos pueden inhibir reacciones enzimáticas de los próximos pasos.</li>
	<li>Proceder a paso 5.14 o almacén de muestras a-20 ° C.</li>
	<li>Realizar la amplificación por RT-qPCR para estimar el número de ciclos necesarios para amplificar el ADN ligada adaptador pre-PCR. Por reacción, añadir lo siguiente en la PCR de 96 pocillos de la placa que contiene de 2 μl ADN (paso 5.11): 0,4 μL índice la cartilla, cartilla PCR universal de 0.4 μL, 7,2 μl de H2O, 10 μl RT-qPCR master mezclar.</li>
	<li>Colocar la placa en una máquina PCR en tiempo real y someter la placa a las siguientes condiciones: 30 s a 98 ° C (10 s 98 ° C, 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 20 ciclos; 5 min 65 ° C.</li>
	<li>Estimar el número de ciclos de amplificación necesarios para cada muestra al restar un valor de Ct para el Ct-valor de la amplificación previa RT-qPCR correspondiente al final de la fase lineal de la reacción de PCR.</li>
	<li>Amplificar el ADN ligada adaptador de paso 5.12 mezclando: 21 μl ADN, 25 μl PCR master mix, 1 μl índice la cartilla, cartilla de PCR Universal de 1 μl y 2 μl de H2O. En un termociclador, tema cada muestra a las siguientes condiciones: 30 s a 98 ° C (10 s 98 ° C, 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> [Ct calculado en el paso 5.16] ciclos; 5 min 65 ° C. Nota: Recuerde utilizar solamente un primer índice por muestra para permitir la multiplexación. El índice se inserta durante la PCR.</li>
	<li>Purificar las cuentas SPRI ADN amplificadas y eluir en 22 μL de tampón de elución.</li>
	<li>Control de calidad de la biblioteca por gel electroforesis o alternativa método. Buscar tamaños de pico biblioteca correcta (tamaño de producto PCR más adaptador).</li>
	<li>Estimar el tamaño promedio de pares de base de los productos de la biblioteca por el análisis de frotis: en avanzada configuración global, haga doble clic en "tabla" bajo análisis de frotis. Definir la región de 100-1000 bp y haga clic en Aceptar. Debajo de la Mesa de la región, la región definida aparece y se calcula el tamaño promedio de la biblioteca (bp).</li>
	<li>Cuantificar las bibliotecas por fluorometría. Proceda al paso 6 o bibliotecas de tienda a-20 ° C.</li>
</ol>6. la siguiente secuencia de generación
<ol><li>Calcular la concentración de nM de bibliotecas mediante la fórmula: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq1.jpg">
</li>
	<li>Diluir las bibliotecas para el mismo nM de concentración por ejemplo de 2 nM (elegir 4 nM, 2 nM, 1 nM y 0,5 nM dependiendo de las concentraciones de la biblioteca). Todas las bibliotecas para conseguir una piscina de 2 bibliotecas nM de la piscina.</li>
	<li>Desnaturalizar y diluir las bibliotecas siguiendo la guía de instrumento de la secuencia. En Resumen: desnaturalizar la piscina nM 2 mediante la adición de 0.2 N NaOH e incubar a temperatura ambiente durante 5 min diluir la piscina desnaturalizada a una dilución final de 22:00. Desnaturalizar y diluir una biblioteca de Control disponible en el mercado a una dilución final de 12:05. A un tubo nuevo, mezcla de la piscina de 22:00 con la biblioteca de Control 20% 12:05. Nota: Conversión de bisulfito presenta muy baja complejidad. 20% control biblioteca spike en resultará en una mejor calidad de la secuencia.</li>
	<li>Ejecute una secuencia de extremo apareado de 150 bp usando un instrumento de secuenciación profunda.</li>
</ol>7. Computación Análisis - niveles de metilación de estimación
<ol><li>Generar archivos de .fastq (aquí llamados sample1_R1.fastq.gz y sample1_R2.fastq.gz), generar un índice de bismark de la totalidad del genoma de interés (aquí en una carpeta llamada bismarkIndex) y asegúrese de que la secuencia genomic de chrM está disponible en fasta formato (aquí en una carpeta llamada chrM).</li>
	<li>Procesamiento previo de Lee para eliminar el sesgo introducido por los iniciadores y adaptadores: utilizar la herramienta Trim_galore33. Quite dos nucleótidos del extremo 5' de Lee hacia adelante y hacia atrás. trim_galore--clip_R1 2--clip_R2 2 -o. /--trim1 - junto sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz</li>
	<li>Alinee el preprocesado lee el genoma entero con Bismark34 Bismark, cola de pato - bam -o. /. / bismarkIndex / -1./sample1_R1_val_1.fq.gz -2./sample1_R2_val_2.fq.gz Nota: Si se utiliza otro alineador, asegúrese de que dice que no puede ser alineado únicamente se descarta.</li>
	<li>Extracto de Lee traz al cromosoma M, utilizando aquí Samtools35 samtools tipo -l 0 - O BAM -o sample1_sorted.bam sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.BAM samtools índice sample1_sorted.bam samtools ve -u sample1_sorted.bam chrM | samtools tipo - n - O BAM -o sample1_chrM.bam</li>
	<li>Extraer la información de la metilación bismark_methylation_extractor -p--CX--cytosine_report--completo--genome_folder. / chrM./sample1_chrM.bam</li>
	<li>Use el .bedGraph, la COV o los archivos de CX_report.txt para su posterior análisis. Utilice el archivo sample1_chrM.CX_report.txt para visualización y pruebas.</li>
	<li>Realizar más recortes en el paso de preprocesamiento, si varias regiones son interrogadas y un sesgo de la cartilla puede ser visible en las parcelas M-sesgo generadas durante la asignación. Consulte la documentación de Bismark para obtener más información.</li>
</ol>8. computación de análisis - prueba de las diferencias
<ol><li>Asegúrese de que el archivo CX_report.txt contiene 7 columnas, cromosoma (aquí chrM), posición, filamento, número de lecturas metilados, el número de lecturas unmethylated, C contexto y secuencia circundante, para cada C en el cromosoma M.</li>
	<li>Como la CX_report cubre chrM en su totalidad, compruebe el subconjunto a la región o regiones que se amplifica.</li>
	<li>Utilizar pruebas no paramétricas para las diferencias entre las muestras, como la prueba exacta de pescadores individuales c o una prueba de signo para toda la región. Nota: Cuantificación a menudo estará cerca de 0% de metilación, que es la razón por qué no es apropiado asumir normalidad.</li>
	<li>Del mismo modo, para la visualización, visualizar cuantiles o calcular intervalos de confianza de la proporción binomial.</li>
</ol>

<ol><li>Falkenberg, M., Larsson, N. -G., Gustafsson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+and+transcription+in+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">DNA replication and transcription in mammalian mitochondria.</a> Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).</li>
<li>Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -H., Kaufman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+intact+mitochondrial+DNA+agarose+electrophoresis+reveals+the+structural+complexity+of+the+mammalian+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e58(2013).</li>
<li>Mechta, M., Ingerslev, L. R., Fabre, O., Picard, M., Barres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+Suggesting+Absence+of+Mitochondrial+DNA+Methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Evidence Suggesting Absence of Mitochondrial DNA Methylation.</a> Front Genet. 8, 166(2017).</li>
<li>Ehrlich, M., Gama-Sosa, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amount+and+distribution+of+5-methylcytosine+in+human+DNA+from+different+types+of+tissues+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells.</a> Nucleic Acids Res. 10 (8), 2709-2721 (1982).</li>
<li>Lister, R., Pelizzola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).</li>
<li>Yan, J., Zierath, J. R., Barres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+non-CpG+methylation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Evidence for non-CpG methylation in mammals.</a> Exp Cell Res. 317 (18), 2555-2561 (2011).</li>
<li>Patil, V., Ward, R. L., Hesson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evidence+for+functional+non-CpG+methylation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells.</a> Epigenetics. 9 (6), 823-828 (2014).</li>
<li>Nass, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+methylation+of+mitochondrial+and+nuclear+DNA+in+cultured+mouse%2C+hamser+and+virus+trasnforemd+hamser+cells+in+vivo+and+in+vitro+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential methylation of mitochondrial and nuclear DNA in cultured mouse, hamser and virus trasnforemd hamser cells in vivo and in vitro methylation.</a> J Mol Biol. 80 (1), 155-175 (1973).</li>
<li>Shock, L. S., Thakkar, P. V., Peterson, E. J., Moran, R. G., Taylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methyltransferase+1%2C+cytosine+methylation%2C+and+cytosine+hydroxymethylation+in+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria.</a> PNAS. 108 (9), 3630-3635 (2011).</li>
<li>Bellizzi, D., D'Aquila, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Control+Region+of+Mitochondrial+DNA+Shows+an+Unusual+CpG+and+Non-CpG+Methylation+Pattern%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern.</a> DNA Res. 20 (6), 537-547 (2013).</li>
<li>Jia, Y., Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Low-Protein+Diet+Affects+Epigenetic+Regulation+of+Hepatic+Mitochondrial+DNA+Transcription+in+a+Sex-Specific+Manner+in+Newborn+Piglets+Associated+with+GR+Binding+to+Its+Promoter%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Maternal Low-Protein Diet Affects Epigenetic Regulation of Hepatic Mitochondrial DNA Transcription in a Sex-Specific Manner in Newborn Piglets Associated with GR Binding to Its Promoter.</a> PLoS ONE. 8 (5), e63855(2013).</li>
<li>Jia, Y., Song, H., Gao, G., Cai, D., Yang, X., Zhao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Betaine+Supplementation+during+Gestation+Enhances+Expression+of+mtDNA-Encoded+Genes+through+D-Loop+DNA+Hypomethylation+in+the+Skeletal+Muscle+of+Newborn+Piglets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Maternal Betaine Supplementation during Gestation Enhances Expression of mtDNA-Encoded Genes through D-Loop DNA Hypomethylation in the Skeletal Muscle of Newborn Piglets.</a> J Agric Food Chem. 63 (46), 10152-10160 (2015).</li>
<li>Infantino, V., Castegna, A., Iacobazzi, F., Spera, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+methyl+cycle+affects+mitochondrial+methyl+availability+and+glutathione+level+in+Down%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Metab%22%5BJournal%5D)">Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down's syndrome.</a> Mol Genet Metab. 102 (3), 378-382 (2011).</li>
<li>Chen, H., Dzitoyeva, S., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+valproic+acid+on+mitochondrial+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effect of valproic acid on mitochondrial epigenetics.</a> Eur J Pharmacol. 690 (1-3), 51-59 (2012).</li>
<li>Dzitoyeva, S., Chen, H., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+aging+on+5-hydroxymethylcytosine+in+brain+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria.</a> Neurobiol Aging. 33 (12), 2881-2891 (2012).</li>
<li>Menga, A., Palmieri, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC25A26+overexpression+impairs+cell+function+via+mtDNA+hypermethylation+and+rewiring+of+methyl+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">SLC25A26 overexpression impairs cell function via mtDNA hypermethylation and rewiring of methyl metabolism.</a> FEBS J. 284 (6), 967-984 (2017).</li>
<li>Frommer, M., McDonald, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> PNAS. 89 (5), 1827-1831 (1992).</li>
<li>Byun, H. -M., Panni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+airborne+pollutants+on+mitochondrial+DNA+Methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Part+Fibre+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA Methylation.</a> Part Fibre Toxicol. 10 (1), 1(2013).</li>
<li>Janssen, B. G., Byun, H. -M., Gyselaers, W., Lefebvre, W., Baccarelli, A. A., Nawrot, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+mitochondrial+methylation+and+exposure+to+airborne+particulate+matter+in+the+early+life+environment%3A+An+ENVIRONAGE+birth+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Placental mitochondrial methylation and exposure to airborne particulate matter in the early life environment: An ENVIRONAGE birth cohort study.</a> Epigenetics. 10 (6), 536-544 (2015).</li>
<li>Zheng, L. D., Linarelli, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+is+associated+with+epigenetic+and+genetic+regulation+of+mitochondrial+DNA+in+obese+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance is associated with epigenetic and genetic regulation of mitochondrial DNA in obese humans.</a> Clin Epigenetics. 7 (1), 1739(2015).</li>
<li>Byun, H. -M., Colicino, E., Trevisi, L., Fan, T., Christiani, D. C., Baccarelli, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Air+Pollution+and+Blood+Mitochondrial+DNA+Methylation+on+Markers+of+Heart+Rate+Variability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Effects of Air Pollution and Blood Mitochondrial DNA Methylation on Markers of Heart Rate Variability.</a> J Am Heart Assoc. 5 (4), (2016).</li>
<li>Bianchessi, V., Vinci, M. C., et al. Mitochondrion. MITOCH. 27 (C), 40-47 (2016).</li>
<li>Wijst, M. G. P., van Tilburg, A. Y., Ruiters, M. H. J., Rots, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+mitochondria-targeted+DNA+methylation+identifies+GpC+methylation%2C+not+CpG+methylation%2C+as+potential+regulator+of+mitochondrial+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Experimental mitochondria-targeted DNA methylation identifies GpC methylation, not CpG methylation, as potential regulator of mitochondrial gene expression.</a> Sci Rep. 7 (1), 177(2017).</li>
<li>Wong, M., Gertz, B., Chestnut, B. A., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNMT3A+and+DNA+methylation+in+skeletal+muscle+and+CNS+of+transgenic+mouse+models+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Front+cellr+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS.</a> Front cellr Neurosci. 7, 279(2013).</li>
<li>Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-methylcytidylic+acid%3A+absence+from+mitochondrial+DNA+of+frogs+and+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells.</a> Science. 184 (4132), 80-81 (1974).</li>
<li>Gama-Sosa, M. A. <a target="_blank" href="http://www.worldcat.org/title/levels-and-distribution-of-5-methylcytosine-in-chordate-dna/oclc/15059352">Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA</a>. , 1-201 (1985).</li>
<li>Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regionally+specific+and+genome-wide+analyses+conclusively+demonstrate+the+absence+of+CpG+methylation+in+human+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA.</a> Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).</li>
<li>Liu, B., Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG+methylation+patterns+ofhuman+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Publishing+Group%22%5BJournal%5D)">CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA.</a> Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).</li>
<li>Donkin, I., Versteyhe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+and+Bariatric+Surgery+Drive+Epigenetic+Variation+of+Spermatozoa+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans.</a> Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).</li>
<li>Li, L. C., Dahiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MethPrimer%3A+designing+primers+for+methylation+PCRs%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MethPrimer: designing primers for methylation PCRs.</a> Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).</li>
<li>Tusnády, G. E., Simon, I., Váradi, A., Arányi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiSearch%3A+primer-design+and+search+tool+for+PCR+on+bisulfite-treated+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes.</a> Nucleic Acids Res. 33 (1), e9(2005).</li>
<li>Arányi, T., Váradi, A., Simon, I., Tusnády, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BiSearch+web+server%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The BiSearch web server.</a> BMC bioinformatics. 7, 431(2006).</li>
<li>Krueger, F. Trim Galore!. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/</a> (2018).</li>
<li>Krueger, F., Andrews, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bismark%3A+a+flexible+aligner+and+methylation+caller+for+Bisulfite-Seq+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications.</a> Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).</li>
<li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Ramos, A., Barbena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+insertions+of+mitochondrial+origin%3A+Database+updating+and+usefulness+in+cancer+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies.</a> Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).</li>
<li>Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+resolution+of+artifacts+in+bisulfite+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing.</a> Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).</li>
</ol>

Los autores tienen intereses financieros que compiten para declarar.

Presentamos un protocolo de secuenciación del bisulfito que está específicamente diseñado para interrogar a metilación del mtDNA. Las diferencias con la secuenciación del bisulfito de protocolos utilizados para la extracción de ADN genómico se encuentra en la utilización de un paso de digestión de la enzima de la restricción anterior y un análisis Bioinformático predominante hacia fuera falso positivo derivados NUMT secuencias.
Proporcionamos un protocolo para evitar artefactos de secuenciació...

El genoma mitocondrial es una estructura circular, doble cadena de aproximadamente 16,5 kilos base (kb), lo que constituye de un pesado y un filamento de la luz. El genoma mitocondrial está presente en múltiples copias en cada célula, maternal heredado y codifica componentes esenciales de la cadena respiratoria complejos1. Similar a los genomas bacterianos y a diferencia del genoma nuclear, el genoma mitocondrial se organiza en numerosas estructuras secundarias y terciarias, como en las estructuras en espiral y superenrollado2, que puede hacer que acceso difícil durante la secuencia experimentos3.
En el núcleo, la metilación del ADN es una marca epigenética ampliamente estudiada que interviene en numerosos procesos, en particular en la regulación de la expresión génica. En genomas mamíferos, la metilación del ADN ocurre principalmente en la posición 5 del anillo de pirimidina de deoxycytidines, sobre todo en los dinucleótidos CG (o CpG). Metilación de la citosina se encuentra en el 70% de los CpG en el genoma de las células somáticas y ~ 1% del total que bases de ADN4. Metilaciones del ADN se ha descrito también en contextos no-CpG, CpC, CpA y CpT y existen en cantidades diferentes en el ADN nuclear, con valores de hasta un 25% de todos los cytosines metilados en células madre embrionarias5,6,7.
Mientras que la metilación de la citosina del genoma nuclear es ampliamente aceptada, la existencia de la metilación de la DNA (mtDNA) mitocondrial es aún controversial. La metilación de mtDNA investigadora primer estudio fue realizada en células cultivadas donde mtDNA metilación fue detectada fácilmente, aunque en niveles más bajos en comparación con el ADN nuclear8. En las células humanas y murinas, metilación del mtDNA también fue detectada en niveles bajos (2-5%). Usando análisis basándose en 5 METILCITOSINA captura como inmunoprecipitación de ADN metilada (MeDIP) seguida de PCR cuantitativa, metilación del mtDNA también fue detectada en varios ratón y humanos y células líneas9,10, 11,12. Usando los anticuerpos contra 5-METILCITOSINA en un ensayo ELISA o espectrometría de masas, niveles considerables de metilación del ADN fueron detectados de fracciones purificadas mitocondriales13,14,15, 16. sin embargo, la mayoría de los ensayos en los estudios antes mencionados utiliza técnicas que no fueron diseñadas para proporcionar la cuantificación absoluta de la metilación del ADN en la sola resolución de base.
Análisis de metilación de DNA cuantitativo y resolutivo puede lograrse mediante una técnica llamada "bisulfito de secuenciación", que se aprovecha de la propiedad de bisulfito de sodio para convertir unmethylated citosina en uracilo en single-stranded DNA contexto17 . Mediante secuenciación de bisulfito, una constelación de estudios ha detectado la presencia de metilación de citosina en los distintos niveles. MtDNA de la metilación de la región D-loop, el 12S o la región 16S fue detectado fácilmente en humanos18,19,20,21,22,23 y ratón24 tejidos y células, sin embargo, con una variabilidad intrigante, de 1-20% del total cytosines en estudios.
En comparación con estos numerosos estudios, sólo unos pocos estudios, como de nuestro grupo, han disputado la presencia de mtDNA metilación3,25,26,27 o cuestionado la importancia biológica de niveles muy bajos de mtDNA (por debajo de 2%)28. Recientemente, informó de la observación de un artefacto de bisulfito de-secuencias posibles en todo mitocondrial bisulfito secuencia3. Proporcionamos evidencia que la estructura secundaria del ADN mitocondrial podría dar lugar a falsos positivos en secuenciación de bisulfito, así sobreestimar los niveles de metilación. Aquí proporcionamos un protocolo para evitar que un artefacto de bisulfito-conversión del ADNmt. Este protocolo utiliza una simple digestión enzimática del ADN para desarticular estructuras secundarias de mtDNA y permitir un acceso completo a siguiendo un protocolo de secuencia de bisulfito bisulfito. Además, ofrecemos un acompañamiento pipeline bioinformática para el análisis de secuenciación de bisulfito.

<table><tbody><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td><td># R0136</td><td></td></tr><tr><td>Kit de metilación de rayos de ADN EZ</td><td>Zymo Research</td><td># D5030&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ensayo Qubit ssDNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q10212</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ensayo Qubit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q32856</td><td></td></tr><tr><td>HotStarTaq más kit de ADN polimerasa</td><td>Qiagen</td><td># 203603&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td># 28704</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra DNA Library Kit para Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td># E7370S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos para Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td># E7335S</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td># A63881</td><td></td></tr><tr><td>Chip de ADN de alta sensibilidad</td><td>Agilent</td><td># 5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Ensayo de dsDNA de alta sensibilidad Qubit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q33230</td><td></td></tr><tr><td>Kit de reactivos MiSeq v2 300 ciclos</td><td>Illumina</td><td># MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>PhiX control v3</td><td>Illumina</td><td># FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td># S5881</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador C1000</td><td>Biorad</td><td># 1851148</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Sistema de detección PCR en tiempo real</td><td>Biorad&nbsp;</td><td>#1855195</td><td></td></tr><tr><td>Fluorómetro Qubit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q33226</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td># G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento MiSeq</td><td>Illumina</td><td># SY-410-1003</td><td></td></tr></tbody></table>

metodología para la detección exacta de la metilación del adn mitocondrial

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Cuantificación de la metilación del ADN puede lograrse utilizando secuenciación de bisulfito, que aprovecha la propiedad de bisulfito de sodio para convertir unmethylated citosina en uracilo, en un contexto de ADN monocatenario. Secuenciación de bisulfito puede ser dirigida (mediante PCR) o en todo el genoma y proporciona la cuantificación absoluta de la metilación de la citosina en la sola base-resolución. Dada la naturaleza distinta del ADN nuclear y mitocondrial, en particular en la estructura secundaria, deben realizarse adaptaciones de métodos de secuenciación de bisulfito para la investigación de metilación de citosina en el ADNmt. Estructura secundaria y terciaria del mtDNA puede de hecho conducir a bisulfito de secuenciación artefactos llevando a falsos positivos debido a la deficiente acceso desnaturalización incompleta de bisulfito a ADN monocatenario. Aquí, describimos un protocolo con una digestión enzimática del ADN BamHI juntada con tubería de análisis bioinformáticos para permitir la cuantificación exacta de la citosina niveles de metilación en el ADNmt. Además, proporcionamos las pautas para el diseño de los cebadores de secuencia de bisulfito específicos de mtDNA, para evitar dirigidos a segmentos NUclear mitocondrial indeseables (NUMTs) insertan en el genoma nuclear.

Dos pasos en este protocolo son cruciales al investigar metilación del mtDNA. 1) la apertura de la estructura secundaria y 2) el diseño de iniciadores específicos de ADN mitocondriales.
Por digerir el ADN genómico humano con la enzima de restricción BamHI (figura 1), se reducirá la estructura del ADN mitocondrial en la posición del nucleótido 14.258 y se abrirá la estructura secundaria.
<p class...

Aquí, presentamos un protocolo para permitir la cuantificación exacta de la metilación de la DNA (mtDNA) mitocondrial. En este protocolo, describimos una digestión enzimática del ADN con BamHI juntada con una tubería de análisis bioinformáticos que se puede utilizar para evitar la sobreestimación de los niveles de metilación de mtDNA causada por la estructura secundaria del ADNmt.

Metodología para la detección exacta de la metilación del ADN mitocondrial

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

El objetivo general de este protocolo de secuenciación de bisulfito y canalización bioinformática es lograr una cuantificación precisa de la metilación del ADN mitocondrial. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo mitoepigenético, como ¿la metilación del ADN mitocondrial cambia la enfermedad humana? La principal ventaja de esta técnica es que permite una cuantificación precisa de la metilación del ADN mitocondrial.Un paso crucial cuando se investiga la metilación del ADN mitocondrial es linealizar el ADN mitocondrial mediante la digestión con BamH1 antes del tratamiento con bisulfito de sodio. El sitio de la enzima de restricción BamH1 se muestra en este mapa del genoma mitocondrial humano. También se muestran las cinco regiones del genoma mitocondrial que se investigarán mediante secuenciación de bisulfito.Bucle de desplazamiento, ARNt fenilalanina y ribosoma 12S, ribosoma 16S, NADH deshidrogenasa 5, gen codificante del ARNm del citocromo B. Después de diseñar los cebadores para la secuenciación de bisulfito, utilizando herramientas en línea como se describe en el protocolo de texto, la especificidad del cebador hacia el genoma mitocondrial se verifica mediante BiSearch. Las secuencias de cebadores se añaden a la función de búsqueda de cebadores BiSearch.Se marca la casilla de bisulfito y se selecciona un genoma de referencia. Los resultados de la búsqueda mostrarán los posibles productos de PCR generados en las cadenas de sentido y antisentido. Para amplificar las regiones de interés del genoma mitocondrial convertido en bisulfito, realice la PCR utilizando una polimerasa Taq de inicio en caliente.Si utiliza cebadores por separado, mezcle 100 nanogramos de ADN convertido, 500 micromolares de cebadores de sentido y antisentido, una mezcla de dNTP de microlitros y polimerasa a 7,5 unidades por reacción en un volumen total de 50 microlitros. Ejecute la PCR con las siguientes condiciones: cinco minutos a 95 grados Celsius, un minuto a 94 grados Celsius, un minuto a 55 grados Celsius, un minuto a 72 grados Celsius durante 35 ciclos, seguidos de 10 minutos a 72 grados Celsius. Para la multiplexación de cebadores, utilice 200 nanogramos de ADN convertido en las siguientes condiciones de ciclo: cinco minutos a 95 grados Celsius, un minuto a 94 grados Celsius, 1,5 minutos a 55 grados Celsius y 1,5 minutos a 72 grados Celsius durante 35 ciclos, seguidos de 10 minutos a 72 grados Celsius.Una vez finalizada la PCR, realice una electroforesis en gel en los productos de PCR, utilizando una agarosa al 2% a 100 voltios. La extracción de los productos de PCR del gel de agarosa debe realizarse de forma que se minimice la exposición a los rayos UV y el riesgo de daños en el ADN. Tome una foto del gel bajo luz ultravioleta.Luego, muy rápidamente, marque alrededor del producto PCR con un bisturí y apague la luz UV. A continuación, corte el producto de PCR lentamente sin exponerlo a la luz ultravioleta. Coloque las rodajas de gel en tubos de microcentrífuga y purifique los productos de PCR mediante purificación de gel como se describe en el protocolo de texto.Cuantificar el ADN purificado mediante fluorometría. Almacene las muestras a 20 grados centígrados, si no procede inmediatamente a la preparación de la biblioteca de secuenciación de bisulfito. Comience la preparación de la biblioteca de productos de PCR convertidos en bisulfito realizando la reparación final con hasta 100 nanogramos de producto de PCR.A cada tubo de 0,2 mililitros, agregue 55,5 microlitros de producto PCR, tres microlitros de enzima de preparación final y 6,5 microlitros de tampón de reacción de reparación final 10X. Incubar los tubos en un termociclador a 20 grados centígrados durante 30 minutos, seguido de 65 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, se utilizan adaptadores de secuenciación de ligatos mezclando el ADN final reparado con 15 microlitros de mezcla de ligasa Blunt/TA, 2,5 microlitros de adaptador y un microlitro de potenciador de ligadura.Coloque la mezcla en un termociclador e incube a 20 grados centígrados durante 15 minutos. Detenga el termociclador y agregue 3 microlitros de enzima USER a cada tubo. Mezcle y vuelva a colocar los tubos en el termociclador e incube a 37 grados centígrados durante 15 minutos.Tamaño: seleccione el ADN ligado al adaptador mediante inmovilización reversible en fase sólida o SPRI. Añadir al ADN ligado al adaptador 13,5 microlitros de agua y 55 microlitros de perlas SPRI resuspendidas. Incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.Coloque los tubos en un soporte magnético. Cuando la solución esté clara, transfiera el sobrenadante, que contiene el ADN ligado al adaptador, a un nuevo tubo y deseche el tubo que contiene las perlas. Agregue 25 microlitros de perlas SPRI resuspendidas al sobrenadante; Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.Coloque los tubos en el soporte magnético y cuando la solución esté clara, deseche el sobrenadante. El ADN ligado al adaptador ahora está unido a las cuentas. Mientras los tubos están en el soporte magnético, agregue 200 microlitros de etanol al 80% recién preparado a cada tubo e incube durante 30 segundos para lavar las perlas.Retire y deseche el sobrenadante. Repita este paso de lavado con etanol para un total de dos lavados. Retire el etanol del segundo lavado y seque las perlas al aire dejando los tubos en el soporte magnético, con la tapa abierta, durante cinco minutos.Después de cinco minutos, retire los tubos del soporte magnético, agregue 23 microlitros de tampón de elución de ADN a las perlas y mezcle. Incubar a temperatura ambiente durante dos minutos. Coloque los tubos en el soporte magnético hasta que la solución esté clara.A continuación, transfiera dos microlitros de la solución a una placa de PCR de 96 pocillos para la amplificación previa a la PCR. Mientras evita cuidadosamente las perlas, transfiera el resto de la solución a un nuevo tubo de 0,2 mililitros para la amplificación por PCR. Realice la amplificación previa a la PCR mediante RT-qPCR para estimar el número de ciclos necesarios para amplificar el ADN ligado al adaptador.Haga una mezcla maestra de lo siguiente por reacción utilizada: 0,4 microlitros de cebador índice, 0,4 microlitros de cebador de PCR universal, 7,2 microlitros de agua y 10 microlitros de mezcla maestra de RT-qPCR. A continuación, mezcle la mezcla maestra y añada 18 microlitros de mezcla maestra a los dos microlitros de ADN en la placa de PCR de 96 pocillos.Coloque la placa en una máquina de PCR en tiempo real y realice la amplificación en las siguientes condiciones: 30 segundos a 98 grados Celsius, 10 segundos a 98 grados Celsius y 75 segundos a 65 grados Celsius durante 20 ciclos, seguidos de cinco minutos a 65 grados Celsius. Después de estimar el número de ciclos de amplificación necesarios para cada muestra, como se describe en el protocolo de texto, amplifique el ADN ligado al adaptador. Para cada muestra, mezcle 21 microlitros de ADN, 25 microlitros de mezcla maestra de PCR, un microlitro de cebador índice, un microlitro de cebador de PCR universal y dos microlitros de agua.En el termociclador, someta cada muestra a las siguientes condiciones: 30 segundos a 98 grados Celsius, 10 segundos a 98 grados Celsius y 75 segundos a 65 grados Celsius para el número calculado de ciclos, seguidos de cinco minutos a 65 grados Celsius. Purifique el ADN amplificado utilizando perlas SPRI, como se demostró anteriormente, y eluya en 22 microlitros de tampón de elución. Controle la calidad de la biblioteca mediante el uso de un bioanalizador.Busque los tamaños de pico de biblioteca correctos. Estime el tamaño promedio del par de bases de los productos de la biblioteca mediante análisis de frotis. En Configuración global avanzada, en Análisis de frotis, haga doble clic en Tabla.Busque la región del par de bases 100 a 1000 y haga clic en Aceptar. En Tabla de regiones, aparecerá la región definida y se calculará el tamaño promedio de la biblioteca. Cuantificar la biblioteca por fluorometría. Almacene la biblioteca a 20 grados centígrados hasta que esté lista para la secuenciación de próxima generación y los análisis computacionales.Mediante secuenciación de bisulfito, se investigó la metilación del ADN mitocondrial en ADN total no digerido y digerido de células de músculo esquelético humano en cinco regiones diferentes del genoma mitocondrial. Un cuadrado completo representa los sitios dinucleótidos de citosina guanina. El cuadrado abierto representa los sitios de dinucleótidos de guanina no citosina.Para el ADN mitocondrial no digerido, los niveles de metilación oscilaron entre el 0 y el 15,1% en todas las regiones investigadas. Sin embargo, cuando el ADN se digirió antes de la conversión del bisulfito, la tasa de no coversión se redujo a un máximo del 1% en todas las regiones. Esto ilustra la importancia de la digestión de BamH1 antes de la conversión de bisulfito para evitar la sobreestimación de los niveles de metilación del ADN mitocondrial.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la secuenciación de bisulfito mitocondrial y, siguiendo nuestra línea bioinformática, puede lograr una cuantificación precisa de la metilación del ADN mitocondrial.

methodology-for-accurate-detection-of-mitochondrial-dna-methylation

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este video muestra el protocolo para la inmunoprecipitación de ADN metilado (MeDIP). MeDIP es un procedimiento de dos días que selectivamente extrae fragmentos de ADN metilado de una muestra de ADN genómico utilizando anticuerpos con especificidad para el 5-metilcitosina (anti-5 MC).

Inmunoprecipitación de ADN metilado

El estándar de oro para el análisis de metilación del ADN es la secuencia del genoma de ADN de bisulfito de convertir. Este método tiene la ventaja de la mayor sensibilidad de la citosina en comparación con el 5-metilcitosina (5-MEC) de bisulfito de desaminación en condiciones ácidas. Citosinas no metiladas se puede distinguir de citosinas metiladas después de la amplificación por PCR del DNA genómico de destino.

La metilación del ADN: Bisulfito de modificación y análisis

Un flujo de trabajo simplificado para estudiar la metilación del ADN y los cambios de expresión génica a principios del estrés de la vida se muestra. A partir de la separación materna de los ratones recién nacidos y el aislamiento de los tejidos cerebrales discretas, que representan un protocolo para aislar al mismo tiempo el ADN y el ARN de golpes de tejido cerebral para la secuenciación de bisulfito y posterior análisis de RT-PCR.

Análisis Optimizado de la metilación del ADN y la expresión génica de áreas pequeñas, anatómicamente definidas del cerebro

Este video describe la técnica de dot-blot para determinar el nivel de metilación del ADN en condrocitos humanos in vitro a través de la transferencia de muestras de ADN en una membrana de nylon y la posterior visualización utilizando anticuerpos monoclonales. Esto ayuda a determinar el fenotipo de los condrocitos en varias etapas del cultivo.

Transferencia de puntos de 5-metilcitosina para determinar el grado de metilación del ADN

Secuenciación de bisulfito de representación reducida mejorada es un método para la preparación de bibliotecas de secuenciación para el análisis de metilación del ADN basado en la digestión de enzimas de restricción combinada con la conversión de bisulfito de citosina. Este protocolo requiere 50 ng de material de partida y produce datos de resolución de pares de bases en regiones genómicas ricas en GC.

Enhanced reducido Representación bisulfito secuenciación para la Evaluación de la metilación del ADN en la Resolución Base Par

La secuenciación de amplicones de bisulfito (BSAS) es un método para cuantificar la metilación de citosina en regiones genómicas específicas de interés. Este método utiliza la conversión de bisulfito emparejada con la amplificación por PCR de las regiones objetivo antes de la secuenciación de próxima generación para producir una cuantificación absoluta de la metilación del ADN a un nivel específico de base.

Dirigida análisis de metilación del ADN mediante secuenciación de próxima generación

Las metiltransferasas de ADN son posibles objetivos farmacológicos contra el cáncer. Aquí, se presenta un protocolo para evaluar moléculas pequeñas para la inhibición de la metiltransferasa de ADN. Este ensayo utiliza una endonucleasa para acoplar la metilación del ADN a la generación de fluorescencia y permite monitorear la actividad enzimática en tiempo real.

Ensayo continuo de metilación del ADN acoplado a endonucleasa basado en fluorescencia para detectar inhibidores de la metiltransferasa de ADN

Aquí presentamos un protocolo para medir el número absoluto de copias de ADN mitocondrial (mt) y los niveles de heteroplasmia de deleción de ADNmt en células individuales.

Medición del número de copias de ADN mitocondrial unicelular y la heteroplasmia mediante la reacción en cadena de la polimerasa de gotitas digitales

Los ensayos de pirosecuenciación permiten el genotipado robusto y rápido de polimorfismos de nucleótido único de ADN mitocondrial en células o tejidos heteroplásmicos.

Genotipado de polimorfismos de nucleótido único en el genoma mitocondrial mediante pirosecuenciación

Se describe un procedimiento para estudiar la dinámica del metabolismo del ADN mitocondrial (ADNmt) en las células utilizando un formato de placa de múltiples pocillos e imágenes de inmunofluorescencia automatizadas para detectar y cuantificar la síntesis y distribución del ADNmt. Esto se puede utilizar aún más para investigar los efectos de varios inhibidores, tensiones celulares y silenciamiento génico en el metabolismo del ADNmt.

Cuantificación basada en imágenes de alto rendimiento de la síntesis y distribución del ADN mitocondrial

Aprende a cuantificar con precisión la metilación del ADN mitocondrial mediante secuenciación con bisulfito y un pipeline bioinformático. Este método evita la sobreestimación mediante digestión con BamHI.

Metodología para la detección exacta de la metilación del ADN mitocondrial

Explorar más videos