Sola molécula fluorescencia In Situ hibridación (smFISH) análisis de florecimiento levadura crecimiento vegetativo y la Meiosis

El objetivo general de esta hibridación in situ de ARN de molécula única optimizada, o smFISH, es detectar y cuantificar moléculas de ARN individuales por célula durante el crecimiento vegetativo y la meiosis de la levadura en ciernes. Este método revela la variabilidad de célula a célula en la expresión génica en la localización del ARN subcelular y, por lo tanto, es una técnica poderosa para estudiar la regulación génica. Aparte de la información única que puede revelar smFISH, la principal ventaja de la técnica es que, una vez optimizada, es robusta y altamente reproducible.

Se utilizará una cultura meiótica para la demostración de este protocolo. Para fijar el cultivo en formaldehído al 3%, agregue 1840 microlitros del cultivo a 160 microlitros de formaldehído al 37% en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros. Invierta unas cinco veces para mezclar.

Coloque el tubo en un tambor de rodillo a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después de 20 minutos, continúe fijando a cuatro grados centígrados con rotación durante la noche. Al día siguiente, prepárese para la digestión descongelando primero 200 complejos de ribonucleósidos de vanadil milimolares, o VRC, a 65 grados centígrados durante al menos 10 minutos.

Para preparar la mezcla maestra de digestión, primero pipetee 2125 microlitros de tampón B en un tubo de 15 mililitros. A continuación, agite el VRC caliente durante cinco segundos para volver a suspenderlo por completo y añadir 200 microlitros de VRC al tubo de 15 mililitros. La mezcla debe tener un color verde parduzco claro.

Centrifugar la muestra meiótica a 21.000 x g durante un minuto y medio a temperatura ambiente. Aspire el sobrenadante con cuidado, colocando la punta del vacío en el lado opuesto del pellet para evitar perturbar el pellet. Vuelva a suspender las células en un mililitro y medio de tampón frío B pipeteando hacia arriba y hacia abajo para mezclar.

Centrifugar a 21.000 x g durante un minuto y medio. Retire la mayor parte del líquido por aspiración al vacío, dejando unos 100 microlitros. Vuelva a suspender las células en un mililitro y medio de tampón frío B. Centrifugue las muestras, retire el líquido y vuelva a suspender las células en un mililitro y medio de tampón frío B nuevamente.

Centrifugar a 21.000 x g durante un minuto y medio. Aspire el líquido completamente mediante pipeteo. Resuspenda las células en 425 microlitros de mezcla maestra de digestión y vórtice brevemente.

Agregue cinco microlitros de zimolyase al tubo y al vórtice durante dos o tres segundos para mezclar. Coloque el tubo en un tambor de rodillo y digiera a 30 grados centígrados durante 15 a 30 minutos. Después de 15 minutos, revise las células por microscopía cada cinco minutos y detenga la digestión cuando aproximadamente el 80% de las células parezcan no transparentes y no refractivas.

Centrifugar el tubo a 376 x g durante tres minutos. Retire el sobrenadante por completo. Vuelva a suspender suavemente las células con un mililitro de tampón B pipeteando hacia arriba y hacia abajo una o dos veces para mezclar.

Centrifugar el tubo y retirar el tampón. Vuelva a suspender suavemente las células en un mililitro de etanol al 70% e incube a temperatura ambiente durante tres horas y media o cuatro horas. Para comenzar el procedimiento de hibridación, centrifugar el tubo de células a 376 x g durante tres minutos.

Retire 500 microlitros de etanol al 70% del tubo. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para resuspender las células restantes y transferir las células a un tubo de baja adherencia. La transferencia de la muestra a un tubo de baja adherencia es fundamental para evitar la pérdida excesiva de células durante los lavados posteriores con formamida.

Centrifugar el tubo de baja adherencia y eliminar todo el etanol. Agregue un mililitro de tampón de lavado al 10% de formamida al tubo y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces para resuspender las células. Deje que las celdas se asienten a temperatura ambiente durante unos 20 minutos mientras prepara las soluciones de hibridación, como se describe en el protocolo de texto.

Centrifugar la muestra y eliminar el sobrenadante en residuos peligrosos. Agregue al menos 50 microlitros de cada solución de hibridación al tubo y agite el tubo para mezclar. Incubar a 30 grados centígrados en un tambor de rodillo durante al menos 16 horas en la oscuridad.

Cuando se complete la hibridación, coloque el tubo de células en una caja cubierta con papel de aluminio para protegerlo de la luz. Centrifugar la muestra a 376 x g durante tres minutos. Elimine el sobrenadante en los residuos peligrosos mediante pipeteo.

Vuelva a suspender la muestra en un mililitro de tampón de lavado de formamida al 10% pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces. Vuelva a colocar el tubo de células en una caja cubierta con papel de aluminio para protegerlo de la luz e incube a 30 grados centígrados durante 30 minutos. Después de 30 minutos, centrifugar la muestra.

Retire el sobrenadante a los residuos peligrosos mediante pipeteo, dejando unos 50 microlitros. Vuelva a suspender la muestra en un mililitro de solución de DAPI pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces. Una vez más, coloque el tubo de células en la caja cubierta con papel de aluminio e incube a 30 grados centígrados durante 30 minutos.

Centrifugar la muestra y eliminar completamente el sobrenadante mediante pipeteo. Para las muestras que no se tomarán imágenes inmediatamente, vuelva a suspender el pellet en 50 microlitros de tampón GLOX sin enzimas. Pipetea hacia arriba y hacia abajo tres o cuatro veces para mezclar.

Manténgalo en la caja cubierta con papel de aluminio a cuatro grados centígrados hasta que esté listo para tomar la imagen. Para las muestras que se obtienen de inmediato, agregue de 15 a 20 microlitros de tampón GLOX con enzimas. Pipetee cinco microlitros en un cubreobjetos y coloque el cubreobjetos en un portaobjetos.

Coloque una toallita de laboratorio encima del portaobjetos donde se coloca el cubreobjetos. Presione suavemente la toallita para colocar la corredera. Coloque el portaobjetos en una caja cubierta con papel de aluminio para transferirlo a la sala del microscopio.

Este protocolo se utilizó para examinar la expresión del gen NDC80, que expresa dos isoformas de ARNm. La isoforma de transcripción larga sin decodificar tiene una extensión de 400 pares de bases y cinco primos en comparación con la isoforma corta. Se diseñaron dos conjuntos de sondas.

El conjunto CF 590 se une a la única región de cinco primos de la isoforma larga, y el conjunto Q 670 se une a la región común de ambas isoformas. En condiciones optimizadas, se identificaron claramente distintos puntos smFISH para ambos conjuntos de sondas. Los dos juegos de sondas se utilizaron para estudiar la expresión de NDC80 durante el crecimiento vegetativo y la meiosis.

En las células vegetativas, se detectó una señal robusta del conjunto de sondas Q 670, pero no del conjunto de sondas CF 590. Por el contrario, se detectó una señal robusta de ambos conjuntos de sondas en la profase meiótica, y la mayoría de los puntos tenían señal colocalizada. El análisis de Northern blot confirmó que la isoforma larga se expresaba específicamente en la meiosis.

Se encontró que las células vegetativas tenían una mediana de cinco transcripciones de isoformas cortas por célula, mientras que en las células de profase meiótica, la mediana se redujo significativamente a cuatro transcripciones por célula. En la profase meiótica, la mediana del número de transcritos de isoformas largas por célula fue del 21 y el 100% de las células expresaron el transcrito. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 72 horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante optimizar primero la duración de la digestión y la concentración de sondas smFISH necesarias para lograr la relación señal-ruido óptima. Además, recuerde agregar VRC durante la digestión y la hibridación durante la noche para prevenir la actividad de la nucleasa. Con este desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores exploraran la regulación dinámica de genes y la localización del ARN subcelular.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar FISH de ARN molecular único en la meiosis de levadura en ciernes.