Name: Sola molécula fluorescencia In Situ hibridación (smFISH) análisis de florecimiento levadura crecimiento vegetativo y la Meiosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Aprende a detectar y cuantificar moléculas de ARN individuales mediante smFISH en levadura de gemación durante el crecimiento vegetativo y la meiosis. Este método robusto revela la variabilidad en la expresión génica y la localización subcelular del ARN.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Anne Dodson y Stephanie Heinrich para consejos sobre cómo optimizar el protocolo de smFISH, Xavier Darzacq para ayudar con la plataforma de análisis, Haiyan Huang para sugerencias sobre el análisis estadístico. Este trabajo fue apoyado por fondos de March of Dimes (FY15-5-99), Pew Charitable Trusts (00027344), Damon Runyon Cancer Research Foundation (35-15) y Glenn Foundation a ésta y a NSF Graduate investigación beca Grant no. DGE-1106400 a JC.

Nota: Todos los buffers y los medios utilizados en el presente Protocolo se enumeran en la tabla 1. La información de proveedores para los reactivos se enumera en la Tabla de materiales.
Día 1/día 1-2:
Nota: Para el cultivo vegetal, cultivar células a un OD600 de 0.4 a 0.6 en un medio preferido. Para la cultura meiótica, inducir las células experimentan meiosis utilizando un método preferido (normalmente el cultivo en un OD600 de 1,85).
1. la fijación y la digestión de la muestra
<ol><li>Arreglar un total de ~3.5 OD600 de células en formaldehído al 3%.<ol>
<li>Para el cultivo vegetativo, añadir mL 5,52 de cultura a 480 μl de formaldehído al 37% en tubos cónicos de 15 mL.</li>
		<li>Para la cultura meiótica, añadir 1840 μl del cultivo a 160 μl de formaldehído al 37% en tubos de microcentrífuga de 2 mL. Invertir aproximadamente 5 veces para mezclar. PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico. Manipúlelo y deséchelo según las normas institucionales.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque los tubos en un tambor de rodillo a temperatura ambiente durante 20 minutos. Para muestras meióticas, después de fijar a temperatura ambiente durante 20 minutos, continúan la fijación durante la noche a 4 ° c, rotación. Nota: La fijación durante la noche aumenta la reproducibilidad y la calidad de los datos smFISH obtenidos para las muestras meióticas. Tiempo de fijación debe ser optimizado.</li>
	<li>Mientras que la fijación de las muestras, descongelar 200 mM Vanadyl ribonucleósido complejos (VRC) a 65 ° c durante al menos 10 minutos.</li>
	<li>Preparar la mezcla principal de digestión en un tubo de 15 mL: para la 1 muestra, mezclar 425 μl de tampón B con 40 μl de 200 mM VRC (calentado a 65 ° c); para las 5 muestras, mezclar 2125 μl de tampón B con 200 μL de 200 mM VRC (calentado a 65 ° c). Vórtice ~ 5 s para suspender de nuevo el VRC completamente antes de agregar a la mezcla principal, que aparecerá en verde marrón claro después de la adición de VRC. Nota: Además de VRC durante la digestión mejora la consistencia de los resultados de la smFISH, potencialmente inhibiendo el contaminante de nucleasa introducido por la mezcla de zymolyase, que es purificada del extracto crudo. La cantidad de VRC en este paso debe ser optimizada.</li>
	<li>Para las muestras vegetativas, centrifugar los tubos a ~ 1057 x g durante 3 minutos. Para muestras meióticas (después de la fijación durante la noche), centrifugar a 21.000 x g durante 1,5 minutos decantar o aspirar el sobrenadante de residuos de formaldehído. Nota: Todos los pasos de centrifugación se realizan a temperatura ambiente.</li>
	<li>Resuspender las células en 1,5 mL de tampón frío mediante pipeteo arriba y abajo o invertir los tubos y agitando para mezclar. Transferencia de muestras vegetativas a los tubos 2 mL después resuspension.</li>
	<li>Centrífuga a 21.000 x g durante 1,5 minutos quitar la mayor parte del líquido por aspiración o mediante pipeteo, dejando atrás ~ 100 μl.</li>
	<li>Resuspender las células en 1,5 mL de tampón frío B.</li>
	<li>Centrífuga a 21.000 x g durante 1,5 minutos quitar la mayor parte del líquido por aspiración o mediante pipeteo, dejando atrás ~ 100 μl.</li>
	<li>Resuspender las células en 1,5 mL de frío tampón B. centrífuga a 21.000 x g durante 1,5 minutos aspirado el líquido completamente por vacío o por pipeteo.</li>
	<li>Resuspender las células en 425 μl de la mezcla principal de la digestión y brevemente vortex para suspender de nuevo. Añadir 5 μl de 100T zymolyase de 10 mg/mL a cada tubo. Nota: Vortex zymolyase cada vez antes de agregarlo a los tubos. Añadir zymolyase a cada tubo individualmente, en lugar de agregar a la mezcla principal. Ambos pasos ayudará a mantener consistencia entre tubos de digestión porque zymolyase se precipita rápidamente.</li>
	<li>Vórtice 2-3 s para mezclar. Colocar los tubos en un tambor de rodillo y digerir a 30 ° c durante 15-30 minutos. Células vegetativas y primeras etapas meióticas, generalmente tarda ~ 15 min, y profase meiótica y divisiones meióticas, tarda generalmente 30 min. Nota: Comprobar en el microscopio cada 5 min después de 15 min y parada la digestión cuando ~ 80% de las células aparecen no transparente y no refractiva. Partir de este punto, las células son muy frágiles. Manejar suavemente las células y evitar el uso de extracción con bomba aspirativa o vórtex.
</li>
	<li>Centrifugar los tubos a ~ 376 x g durante 3 minutos Retire el líquido completamente mediante pipeteo.</li>
	<li>Resuspender suavemente las células con 1 mL de tampón B mediante pipeteo arriba y abajo 1 - 2 veces a la mezcla.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a ~ 376 x g durante 3 min líquido eliminar tampón B mediante pipeteo. Resuspender suavemente las células en 1 mL de etanol al 70% (diluida con agua libre de ARNasa).</li>
	<li>Incubar a temperatura ambiente por 3.5-4 horas.</li>
</ol>2. hibridación
<ol><li>Llevar formamida a temperatura ambiente (por alícuota de 50 mL, se tarda 30 min en baño de agua). Nota: No abra la botella de formamida hasta que la botella llegue a temperatura ambiente para evitar la oxidación de formamida. PRECAUCIÓN: La formamida es tóxico. Manipúlelo y deséchelo según las normas institucionales.</li>
	<li>Preparar el tampón de lavado 10% formamida en un tubo cónico de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a ~ 376 x g durante 3 minutos Retire 500 μl de etanol al 70% mediante pipeteo. Pipetee suavemente arriba y abajo para resuspender las células restantes y luego se transfieren las células a los tubos de baja adherencia. Nota: Usando tubos de adherencia baja grandemente reduce pérdida de la célula durante lavados posteriores.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a ~ 376 x g durante 3 minutos Retire el etanol mediante pipeteo.</li>
	<li>Añadir 1 mL de tampón de lavado 10% formamida y suavemente la pipeta hacia arriba y hacia abajo 2 - 3 veces para resuspender las células.</li>
	<li>Permitir a las células a reposar a temperatura ambiente unos 20 minutos mientras se prepara la solución de hibridación. Para la 1 muestra, mezcle 50 μl de tampón de hibridación (Temp. ambiente), 5 μl de 200 mM VRC (calentado a 65 ° c) y 1 μl de cada sondeo (final de 200 nM). Para las 5 muestras, mezclar 250 μl de tampón de hibridación (Temp. ambiente), 25 μl de 200 mM VRC (calentado a 65 ° c) y 5 μl de cada sondeo (final de 200 nM).<ol>
<li>Descongelar el tampón de hibridación (congelado a-20 ° c) a temperatura ambiente antes de abrir el tubo para evitar la oxidación de formamida.</li>
		<li>Después de agregar el 200 mM VRC, vortex por 5-10 s antes de añadir las puntas de prueba, que se diseñado y adquirido comercialmente y reconstituido según las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Si dos sondas Co incubadas, añadir 1 μl de la 1:10 dilución de la población de punta de prueba #1, y 1 μl de la 1:10 dilución de la población de punta de prueba #2, para hacer una dilución final de ~ 1: 500 para cada sonda. La concentración necesaria para que la mejor relación de señal a ruido deben ser optimizado (ver la discusión para más detalles).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugar las muestras a ~ 376 x g durante 3 minutos Retire el sobrenadante en residuos peligrosos por pipeteo.</li>
	<li>Añadir 50 μl de solución de hibridación a cada tubo. Película los tubos para mezclar.</li>
	<li>Incubar a 30 ° c en un tambor de rodillo durante al menos 16 horas en la oscuridad.</li>
</ol>Día 2/día 3
3. lavado y proyección de imagen
<ol><li>Llevar formamida a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar el tampón de lavado 10% formamida (FWB) en un tubo cónico de 15 mL.</li>
	<li>Retirar los tubos del tambor de rodillo y colocar en una caja cubierta de papel de aluminio para proteger de la luz.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a ~ 376 x g durante 3 minutos Retire el sobrenadante en residuos peligrosos por pipeteo.</li>
	<li>Resuspender en 1 mL de 10% FWB transfiriendo suavemente arriba y abajo 2 - 3 veces.</li>
	<li>Incubar a 30 ° c por 30 min (no gira) en la caja cubierta de papel de aluminio.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a ~ 376 x g para 3 minutos Retire el sobrenadante de residuos peligrosos mediante pipeteo y dejar ~ 50 μl.</li>
	<li>Mientras tanto, preparar el DAPI/FWB en un tubo cónico de 15 mL: para la 1 muestra, mezclar 1000 μl de tampón de lavado 10% formamida con 1 μl de DAPI de 5 mg/mL. De 10 muestras, mezclar 10 mL de tampón de lavado 10% formamida con 10 μl de DAPI de 5 mg/mL. Resuspender en 1 mL de DAPI/FWB transfiriendo suavemente arriba y abajo 2 - 3 veces.</li>
	<li>Incubar a 30 ° c por 30 min (no gira) en la caja cubierta de papel de aluminio.</li>
	<li>Descongelar los reactivos anti-bleach en el hielo.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a ~ 376 x g durante 3 minutos Retire el sobrenadante totalmente mediante pipeteo. Si es necesario, Centrifugue nuevamente para eliminar todo el sobrenadante.</li>
	<li>Para las muestras que no son imágenes inmediatamente, Resuspender el precipitado en 50 μl de tampón de GLOX sin enzimas. Pipeta de arriba y abajo 3 - 4 veces para mezclar.<ol>
<li>Mantener todas las muestras unimaged en la caja cubierta de papel de aluminio a 4 ° c hasta que esté listo a la imagen. Cuando esté listo para la imagen, centrifugar las muestras a ~ 376 x g durante 2 min y retire completamente el sobrenadante mediante pipeteo. Resuspender en GLOX con enzimas como abajo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para las muestras que se va a examinar inmediatamente, agregar 15-20 μl de tampón GLOX con enzimas. Suavemente la pipeta hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Nota: El volumen añadido puede variar dependiendo del tamaño de la pelotilla de la célula. Recomendamos Resuspender el pellet en 15 μl de tampón de GLOX con enzimas y comprobar la densidad de células en el microscopio. Si las células son demasiado densas (células agrupar uno encima del otro), añade tampón GLOX extra con las enzimas. Si las células son demasiado escasas, Centrifugue la muestra y eliminar ~ 5 μl de tampón.</li>
	<li>Pipeta de 5 μl sobre un cubreobjetos (18 mm x 18 mm, no. 1) y poner el cubreobjetos sobre un portaobjetos.</li>
	<li>Poner un trapo de laboratorio sobre el portaobjetos donde se coloca el cubreobjetos. Presione suavemente en el paño de laboratorio para establecer la diapositiva (debe ver salir líquido de los cuatro bordes del cubreobjetos).</li>
	<li>Transfiera el porta a la sala de microscopio en una caja cubierta por papel de aluminio.</li>
	<li>Imagen utilizando un microscopio de fluorescencia de campo amplio con gran aumento (60-100 X) y alta apertura numérica. Nota: Para recoger el máximo número de fotones emitidos por las sondas smFISH, microscopios confocales no se recomiendan, como limitan significativamente la cantidad de luz a recoger. Aquí, los datos se recolectaron en un microscopio equipado con 100 X, objetivo 1.4 en NA, usando filtros de CY5 (EX632/22, EM679/34) reflejado en 1.3 s, 100% T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100% T; y DAPI (EX390/18, EM435/48), 0.05-0.1 s, T. 32-50% También se debe adquirir una imagen de referencia de campo brillante. Adquirir cortes de 15-25 con un tamaño de paso de 0.1-0.2 μm, de enteramente bajo el enfoque del campo de visión totalmente arriba, para asegurarse de que todos los puntos de RNA se contabilizan.</li>
</ol>4. Análisis de la imagen
<ol><li>Analizar los datos de smFISH con smFISH publicado las herramientas de análisis como el pescado-quant17 y StarSearch2, o con programas a medida, dependiendo de las necesidades exactas del experimento. Nota: Una tubería de buen análisis debe permitir a los usuarios determinar un umbral para separar los verdaderos puntos de RNA de los antecedentes y estadísticas, como las coordenadas X, Y y Z (opcionales) y la intensidad de cada punto, el número de puntos en cada celda de salida y posiblemente los parámetros como una manera de filtrar las falsas detecciones.</li>
</ol>

<ol><li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li>
<li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li>
<li>Rahman, S., Zenklusen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+resolution+fluorescent+in+situ+hybridization+%28smFISH%29+in+the+yeast+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae.</a> Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).</li>
<li>Gaspar, I., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strength+in+numbers%3A+quantitative+single-molecule+RNA+detection+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).</li>
<li>Vargas, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+transcriptionally+coupled+and+uncoupled+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of transcriptionally coupled and uncoupled splicing.</a> Cell. 147 (5), 1054-1065 (2011).</li>
<li>Waks, Z., Klein, A. M., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+variability+of+alternative+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing.</a> Mol Syst Biol. 7, 506(2011).</li>
<li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li>
<li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309(2006).</li>
<li>Senecal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+modulate+c-Fos+transcriptional+bursts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcription factors modulate c-Fos transcriptional bursts.</a> Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).</li>
<li>Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+SNVs+to+quantify+allele-specific+expression+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells.</a> Nat Methods. 10 (9), 865-867 (2013).</li>
<li>Hansen, C. H., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+detection+of+single+mRNA+molecules+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ.</a> Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).</li>
<li>Ginart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+allele-specific+expression+in+single+cells+reveals+epigenetic+mosaicism+in+an+H19+loss-of-imprinting+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant.</a> Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).</li>
<li>Long, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mating+type+switching+in+yeast+controlled+by+asymmetric+localization+of+ASH1+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA.</a> Science. 277 (5324), 383-387 (1997).</li>
<li>Park, H. Y., Trcek, T., Wells, A. L., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unbiased+analysis+method+to+quantify+mRNA+localization+reveals+its+correlation+with+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">An unbiased analysis method to quantify mRNA localization reveals its correlation with cell motility.</a> Cell Rep. 1 (2), 179-184 (2012).</li>
<li>Jourdren, L., Delaveau, T., Marquenet, E., Jacq, C., Garcia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CORSEN%2C+a+new+software+dedicated+to+microscope-based+3D+distance+measurements%3A+mRNA-mitochondria+distance%2C+from+single-cell+to+population+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">CORSEN, a new software dedicated to microscope-based 3D distance measurements: mRNA-mitochondria distance, from single-cell to population analyses.</a> RNA. 16 (7), 1301-1307 (2010).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+inactivation+by+expression+of+a+repressive+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Kinetochore inactivation by expression of a repressive mRNA.</a> eLife. 6, e27417(2017).</li>
<li>Mueller, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH-quant%3A+automatic+counting+of+transcripts+in+3D+FISH+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images.</a> Nat Methods. 10 (4), 277-278 (2013).</li>
<li>Brar, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+view+of+the+yeast+meiotic+program+revealed+by+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution view of the yeast meiotic program revealed by ribosome profiling.</a> Science. 335 (6068), 552-557 (2012).</li>
<li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li>
<li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes Dev. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li>
<li>Dodson, A. E., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+capture+of+heterochromatin+dynamics+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Heritable capture of heterochromatin dynamics in Saccharomyces cerevisiae.</a> eLife. 4, e05007(2015).</li>
<li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat Protoc. 7 (2), 408-419 (2012).</li>
<li>Youk, H., Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+mRNA+molecules+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Imaging single mRNA molecules in yeast.</a> Methods Enzymol. 470, 429-446 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de interés que revelar.

El protocolo que presentamos se deriva de otros protocolos de smFISH publicadas de3,2,21,22,23y está específicamente optimizado para el fondo de la cepa de levadura SK1. Los parámetros optimizados incluyen el numero de celular, duración de la fijación, velocidad de centrifugación y duración, duración de digestión, tampón de digestión, concentración de sonda y tampón de hibridación. Otros parámetros como la temperatura de hibridación y duración no fueron optimizados. En esta sección, compartimos algunas notas que ayude a adaptar el presente Protocolo a cualquier fondo de la cepa de levadura y las condiciones de crecimiento de interés.
La pared celular de levadura de florecimiento es un gran reto contra la obtención de imágenes de alta calidad smFISH en levadura de florecimiento porque la pared celular previene la penetración de la sonda. Digestión incompleta de la pared celular por zymolyase conduce a ineficiente hibridación de las sondas y la alta variabilidad de célula a célula en la señal. Sin embargo, digestión excesiva puede hacer las células demasiado frágil, significativa pérdida de la célula durante los pasos de lavado y estallar durante la preparación de los portaobjetos para la proyección de imagen de la célula. Por lo tanto, es fundamental optimizar la duración de la digestión. Se recomienda llevar a cabo un experimento piloto smFISH por extracción de la misma muestra para diferentes cantidades de tiempo. En nuestro caso, obtuvimos los mejores datos de smFISH si nos detiene la digestión cuando no refractiva ~ 80% de las células. Por lo general, para la misma condición de crecimiento, diferentes cepas mutantes genéticas pueden ser digeridas con tiempos similares. Sin embargo, la duración de la digestión es diferente cuando se compara entre diferentes condiciones de crecimiento y diferentes etapas de la meiosis en levadura de florecimiento. Una vez que se determina el momento, la calidad de smFISH es reproducible. Nota que para cepas mutantes con pared celular defectuosa síntesis o composición, digestión puede completarse en menos de 15 minutos de uso de lotes diferentes de zymolyase puede cambiar también un poco el tiempo de digestión.
Concentración óptima de la sonda es necesario para lograr un alto cociente signal-to-noise. Hemos diseñado y había adquirido nuestras sondas smFISH comercialmente. Buenas sondas (a menudo 20-mers) deben tener un porcentaje de GC desde 35% hasta 45%, un espacio mínimo de 2 pares de bases entre las puntas de prueba y baja reactividad cruzada. Utilizamos un diseño de sonda basada en web del fabricante para generar una lista de las puntas de prueba, y si hay suficientes sondas a elegir, utilizamos el algoritmo BLAST en la base de datos del genoma de Saccharomyces para eliminar las puntas de prueba con más de 17 pares de bases superpuestas con otras regiones genómicas. Elegimos más Fotoestables colorante fluorescente (CAL Fluor 590) para el conjunto de sonda que recuece a la única región de NDC80luti (CF 590) porque en este sistema, el número de puntas de prueba que satisfacen todos los criterios anteriores (20 sondas) fue menor que la número mínimo recomendado por el fabricante (~ 25 sondas). Después de la reconstitución la solución de la sonda siguiendo las instrucciones del fabricante, hemos hecho un 1:10 dilución de la solución y la solución diluida en alícuotas de 5 μl a-20 ° c. Cada alícuota se utilizó solamente una vez. Para la optimización, uno debe hacer serie diluciones desde la 1:10 diluyeron solución y prueba de que la concentración produce la mejor relación señal a ruido. Le recomendamos una serie de diluciones de 1: 250, 1: 500, 1: 1000 y 1: 2000 de la población original. En nuestro caso, un factor de dilución 1: 500 dio lugar a la mejor relación señal a ruido, para el CF 590 y Q 670 sistemas de sonda.
Tiempo óptimo de fijación también es crítico para el éxito smFISH en levadura de florecimiento. Encontró que la fijación durante la noche a 4 ° c, en lugar de fijación a temperatura ambiente durante 20 minutos, mejoraron significativamente la consistencia y calidad de los resultados smFISH para muestras meióticas. Aunque no hemos probado cómo la noche fijación pueda impactar las muestras vegetativas, fijación a temperatura ambiente trabajó bien para esta condición de crecimiento. Por lo tanto, para optimizar el protocolo de smFISH de nuevas cepas o condiciones de crecimiento, se recomiendan a partir de tiempo de fijación corto a temperatura ambiente y aumentar el tiempo de fijación si se encuentra la alta variabilidad de la señal.
En comparación con otros protocolos publicados3,22,23, nuestro protocolo utiliza el inhibidor de Rnasa VRC durante la digestión y una mayor concentración de VRC durante la hibridación. Además de VRC en estos dos pasos mejoraron la consistencia de los resultados de la smFISH, posiblemente mejor preservar las moléculas de ARN contra actividad nucleasa, que se pueden introducir por la mezcla de zymolyase (la enzima purificada de extractos crudos y puede contener Rnasa contaminantes). Así, se recomienda utilizar la cantidad de VRC que figuran en nuestro protocolo o incluso altas concentraciones de VRC para optimización.
Se puede perder una porción significativa de las células durante los pasos de lavado en tampón B y el tampón de lavado de formamida. Para reducir la pérdida de la célula, uno podría aumentar la velocidad de centrifugación. En nuestro caso, utilizando una velocidad alta (21.000 x g) a nuestras muestras de pellets durante el búfer B lava pérdida significativamente reducida de la célula. Sin embargo, las células se convierten en muy frágiles después de la digestión zymolyase, por lo que no se recomienda el cambio de velocidad de centrifugación. Por el contrario, se sugiere utilizar los tubos de baja adherencia de científicos de Estados Unidos, que sedimenten las células durante los lavados en el tampón de lavado formamida de gran ayudan. En general, nuestro protocolo puede generar constantemente una monocapa de células lo suficientemente densas para la proyección de imagen eficiente. Por lo general, deben producir los 7 campos de vista > 130 células adecuadas para la cuantificación.
Por último, es importante determinar los parámetros óptimos para el y los resultados de análisis de imagen. Para detectar manchas de smFISH, programas de análisis publicado comúnmente las imágenes raws usando kernel gaussiano para quitar la señal de fondo del filtro y preguntar a los usuarios a determinar la relación de señal a ruido para cada conjunto de imágenes2,17. Por desgracia, actualmente no existe una norma por la que se determinan los parámetros apropiados, y así algunas pruebas empíricas de estos ambientes son necesario. Para establecer los parámetros necesarios para cada uno de estos pasos, uno necesita iterativamente diferentes conjuntos de parámetros de entrada y compruebe qué tan bien los resultados obtenidos en cada juego del recuento manual en algunas células representativas. Una vez que se encuentra un conjunto de parámetros, puede ser utilizado para la mayoría de las imágenes obtenidas a pesar de diferentes condiciones de crecimiento y antecedentes genéticos.
Además, uno puede probar si proyección de máxima intensidad de las imágenes de smFISH puede llevarse a cabo antes de la cuantificación22. Este paso simplifica el algoritmo de detección de punto y significativamente reduce el tiempo de proyección de imagen, aunque a costa de información potencialmente útil sobre manchas individuales, tales como su localización subcelular. En nuestro caso, el número de moléculas de ARNm producidas por el gene de NDC80 fue lo suficientemente bajo como para que los puntos estaban bien separados después de este proceso (no es infrecuente para las transcripciones en florecimiento levadura3,7). En casos donde está crítico el análisis de colocalización, la tubería del análisis debe determinar la ubicación de cada punto de smFISH en cada canal para evaluar colocalización. Dependiendo de las preguntas específicas se pide, otros datos como la intensidad de cada punto también pueden necesitar ser extraído de la tubería para su posterior análisis. Optimización de la clave de los pasos en el protocolo y la tubería de análisis de imagen es crucial en la obtención de alta calidad de los datos smFISH para estudiar la cuestión de interés.

Regulación dinámica de la expresión génica impulsa el desarrollo de un organismo, así como su respuesta al estrés ambiental, infección y cambios en el metabolismo. Estudios que se centran en la regulación transcripcional se basan en tecnologías que miden la abundancia de RNA. Un tal método, denominado sola molécula en situ hibridación de la fluorescencia (smFISH), se utiliza para la detección individuales de moléculas de ARN en las células1,2. Este método permite la medición de la variabilidad de célula a célula en la expresión génica y la determinación de la localización intracelular de RNA.
En la técnica de smFISH más utilizados, la detección de una molécula de RNA individual requiere múltiples cortas sondas de ADN (a menudo ~ 48 20-mer sondas) que son complementarios en el destino del RNA y se conjugan en el mismo tinte fluorescente. Fijación de una sola sonda fluorescente resulta en una señal débil, pero la señal desde el conjunto de todas las sondas es robusta. Esta característica mejora considerablemente la relación señal a ruido porque a pesar de una sola punta de prueba puede exhibir objetivo vinculante, tal señal se espera que sea muy débil en comparación con el objetivo de la molécula de RNA3. Dentro de error de detección, el número de moléculas de ARN puede ser contado y comparado en diferentes condiciones de crecimiento y entre mutantes diferentes.
Desde su primer desarrollo, smFISH ha sido adaptado para estudiar diversos aspectos de la gene expresión4, tales como transcripción elongación1,2,5,6, transcripcional estallar7 de empalme , 8 , 9la expresión alélica intracelular10,11,12y RNA localización13,14,15. Recientemente, hemos utilizado este método para estudiar la expresión de ambas isoformas de la transcripción del mismo gen, en la que la isoforma corta transcripción (NDC80ORF) tiene su secuencia de todo comparte con la isoforma larga (NDC80luti )16. Para identificar de forma única las dos isoformas mRNA, utilizamos dos tipos de sonda: un sistema es específico de la secuencia única de NDC80luti, y el otro conjunto, conjugado a otro colorante fluorescente, se une a la región común de las dos isoformas. NDC80luti RNA es identificado como un lugar colocalized con ambas señales fluorescentes, mientras que el NDC80ORF RNA es la que contiene sólo la señal desde el conjunto de sonda común. Dado que el número de la NDC80ORF transcripciones se calcula por un método de "resta", alta eficiencia de la hibridación de la sonda y un alto cociente signal-to-noise son necesarios para identificar puntos de smFISH con confianza y reducir el error propagación.
Este papel describe un protocolo optimizado para realizar smFISH en la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae. En este protocolo, numero de celular, tiempo de fijación, tiempo de digestión, tampón de digestión, concentración de la sonda e hibridación buffer utilizado para los experimentos de smFISH fueron optimizados para el SK1 cepa fondo de S. cerevisiae que vegetativo crecimiento o la meiosis. Sin embargo, también observamos en este manuscrito: (1) el método para comprobar la calidad de los datos de smFISH después de la adquisición de la imagen y (2) los pasos en el protocolo que requieran optimización adicional de tensión diferentes orígenes y condiciones de crecimiento.

<table><tbody><tr><td>BSA, sin RNasa (50 mg/mL)</td><td>Ambion</td><td>AM2616</td><td>Almacenar a -20 °C.</td></tr><tr><td>Tienda Catalase</td><td>Sigma</td><td>C3515</td><td>a 4 &deg; C para corto plazo. Vortex antes de usar.</td></tr><tr><td>Tienda DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9564</td><td>a -20 &deg; C después de la reconstitución en agua. Protégete de la luz.</td></tr><tr><td>50% Sulfato de Dextrano</td><td>Milli Pore</td><td>S4030 Conservar</td><td>a temperatura ambiente. Líquido muy viscoso. Manéjalo con paciencia.</td></tr><tr><td>E. coli tRNA</td><td>Sigma</td><td>R4251</td><td>Almacene a -20 &deg; C en alícuotas después de la reconstitución en agua.</td></tr><tr><td>Etanol (100%, 200 pruebas)</td> <td>varios</td><td></td><td>inflamables.</td></tr><tr><td>37% Formaldehído</td><td>Fisher</td><td>F79-500</td><td>Almacenar a temperatura ambiente. Nocivo. Úselo y deséchelo con precaución.</td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Ambion</td><td>AM9342</td><td>Almacenar a 4 &deg;C. Abrir después de que la temperatura se equilibre a temperatura ambiente para evitar la oxidación. Nocivo. Úselo y deséchelo con precaución.</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>varios</td><td></td><td>Almacene a 4 & deg; C después de disolverse en agua libre de nucleasas.</td></tr><tr><td>Glucosa oxidasa</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>Almacenar a -20 &deg; C en alícuotas después de la reconstitución en 50 mM de NaOAc, pH 5.</td></tr><tr><td>Agua sin nucleasas</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td>Conservar a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio (monobásico y dibásico)</td><td>Varios</td><td></td><td>Almacenar a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Biblioteca de sondas, diluidas en TE, pH 8.0&nbsp;</td><td>Tienda de Biosearch Technologies</td><td></td><td>a -20 &deg; C en alícuotas (5 &micro; L) después de la reconstitución en TE pH 8.0, siguiendo las instrucciones del fabricante. Protégete de la luz.</td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>vario</td><td></td><td>Almacenar a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Ambion</td><td>AM9763</td><td>Almacenar a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>TE, pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td>Almacenar a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>1 M Tris, pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9856</td><td>Conservar a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Tienda Trolox</td><td>Sigma</td><td>238813</td><td>a -20 &deg; C en alícuotas.</td></tr><tr><td>200 mM Complejo de ribonucleósidos de vanadilo (VRC)</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td>Almacenar a -20 &deg; C en alícuotas después de la reconstitución, siguiendo las instrucciones del fabricante.</td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>MP Biomedicals</td><td>08320932</td><td>Tienda a -20 &deg; C en alícuotas después de la reconstitución en agua.</td></tr><tr><td>Tubos de baja adherencia</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2600</td><td>Conservar a temperatura ambiente.</td></tr></tbody></table>

sola molécula fluorescencia in situ hibridación (smfish) análisis de florecimiento levadura crecimiento vegetativo y la meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Sola molécula en situ hibridación de la fluorescencia (smFISH) es una técnica poderosa para el estudio de expresión génica en las células debido a su capacidad para detectar y contar las moléculas de ARN individuales. Complementaria a métodos basados en la secuenciación profunda, smFISH proporciona información sobre la variación de célula a célula en abundancia de la transcripción y la localización subcelular de un determinado RNA. Recientemente, hemos utilizado smFISH para estudiar la expresión del gene de NDC80 durante meiosis en levadura de florecimiento, en que dos transcripción existen isoformas y la isoforma corta transcripción tiene su secuencia todo comparte con la isoforma larga. Para identificar con confianza cada isoforma de transcripción, conocido smFISH protocolos optimizados y obtuvo alta consistencia y calidad de los datos smFISH para las muestras que se adquirieron durante el florecimiento levadura meiosis. Aquí, describimos este protocolo optimizado, los criterios que utilizamos para determinar si se obtiene alta calidad de los datos de smFISH y algunos consejos para la aplicación de este protocolo en otras cepas de levadura y las condiciones de crecimiento.

Esta sola molécula fluorescencia en situ hibridación protocolo está optimizado para cuantificar el número de moléculas de ARN en levadura de florecimiento durante la meiosis y crecimiento vegetativo.

Sola molécula fluorescencia In Situ hibridación (smFISH) análisis de florecimiento levadura crecimiento vegetativo y la Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

El objetivo general de esta hibridación in situ de ARN de molécula única optimizada, o smFISH, es detectar y cuantificar moléculas de ARN individuales por célula durante el crecimiento vegetativo y la meiosis de la levadura en ciernes. Este método revela la variabilidad de célula a célula en la expresión génica en la localización del ARN subcelular y, por lo tanto, es una técnica poderosa para estudiar la regulación génica. Aparte de la información única que puede revelar smFISH, la principal ventaja de la técnica es que, una vez optimizada, es robusta y altamente reproducible.Se utilizará una cultura meiótica para la demostración de este protocolo. Para fijar el cultivo en formaldehído al 3%, agregue 1840 microlitros del cultivo a 160 microlitros de formaldehído al 37% en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros. Invierta unas cinco veces para mezclar.Coloque el tubo en un tambor de rodillo a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después de 20 minutos, continúe fijando a cuatro grados centígrados con rotación durante la noche. Al día siguiente, prepárese para la digestión descongelando primero 200 complejos de ribonucleósidos de vanadil milimolares, o VRC, a 65 grados centígrados durante al menos 10 minutos.Para preparar la mezcla maestra de digestión, primero pipetee 2125 microlitros de tampón B en un tubo de 15 mililitros. A continuación, agite el VRC caliente durante cinco segundos para volver a suspenderlo por completo y añadir 200 microlitros de VRC al tubo de 15 mililitros. La mezcla debe tener un color verde parduzco claro.Centrifugar la muestra meiótica a 21.000 x g durante un minuto y medio a temperatura ambiente. Aspire el sobrenadante con cuidado, colocando la punta del vacío en el lado opuesto del pellet para evitar perturbar el pellet. Vuelva a suspender las células en un mililitro y medio de tampón frío B pipeteando hacia arriba y hacia abajo para mezclar.Centrifugar a 21.000 x g durante un minuto y medio. Retire la mayor parte del líquido por aspiración al vacío, dejando unos 100 microlitros. Vuelva a suspender las células en un mililitro y medio de tampón frío B. Centrifugue las muestras, retire el líquido y vuelva a suspender las células en un mililitro y medio de tampón frío B nuevamente.Centrifugar a 21.000 x g durante un minuto y medio. Aspire el líquido completamente mediante pipeteo. Resuspenda las células en 425 microlitros de mezcla maestra de digestión y vórtice brevemente.Agregue cinco microlitros de zimolyase al tubo y al vórtice durante dos o tres segundos para mezclar. Coloque el tubo en un tambor de rodillo y digiera a 30 grados centígrados durante 15 a 30 minutos. Después de 15 minutos, revise las células por microscopía cada cinco minutos y detenga la digestión cuando aproximadamente el 80% de las células parezcan no transparentes y no refractivas.Centrifugar el tubo a 376 x g durante tres minutos. Retire el sobrenadante por completo. Vuelva a suspender suavemente las células con un mililitro de tampón B pipeteando hacia arriba y hacia abajo una o dos veces para mezclar.Centrifugar el tubo y retirar el tampón. Vuelva a suspender suavemente las células en un mililitro de etanol al 70% e incube a temperatura ambiente durante tres horas y media o cuatro horas. Para comenzar el procedimiento de hibridación, centrifugar el tubo de células a 376 x g durante tres minutos.Retire 500 microlitros de etanol al 70% del tubo. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para resuspender las células restantes y transferir las células a un tubo de baja adherencia. La transferencia de la muestra a un tubo de baja adherencia es fundamental para evitar la pérdida excesiva de células durante los lavados posteriores con formamida.Centrifugar el tubo de baja adherencia y eliminar todo el etanol. Agregue un mililitro de tampón de lavado al 10% de formamida al tubo y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces para resuspender las células. Deje que las celdas se asienten a temperatura ambiente durante unos 20 minutos mientras prepara las soluciones de hibridación, como se describe en el protocolo de texto.Centrifugar la muestra y eliminar el sobrenadante en residuos peligrosos. Agregue al menos 50 microlitros de cada solución de hibridación al tubo y agite el tubo para mezclar. Incubar a 30 grados centígrados en un tambor de rodillo durante al menos 16 horas en la oscuridad.Cuando se complete la hibridación, coloque el tubo de células en una caja cubierta con papel de aluminio para protegerlo de la luz. Centrifugar la muestra a 376 x g durante tres minutos. Elimine el sobrenadante en los residuos peligrosos mediante pipeteo.Vuelva a suspender la muestra en un mililitro de tampón de lavado de formamida al 10% pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces. Vuelva a colocar el tubo de células en una caja cubierta con papel de aluminio para protegerlo de la luz e incube a 30 grados centígrados durante 30 minutos. Después de 30 minutos, centrifugar la muestra.Retire el sobrenadante a los residuos peligrosos mediante pipeteo, dejando unos 50 microlitros. Vuelva a suspender la muestra en un mililitro de solución de DAPI pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces. Una vez más, coloque el tubo de células en la caja cubierta con papel de aluminio e incube a 30 grados centígrados durante 30 minutos.Centrifugar la muestra y eliminar completamente el sobrenadante mediante pipeteo. Para las muestras que no se tomarán imágenes inmediatamente, vuelva a suspender el pellet en 50 microlitros de tampón GLOX sin enzimas. Pipetea hacia arriba y hacia abajo tres o cuatro veces para mezclar.Manténgalo en la caja cubierta con papel de aluminio a cuatro grados centígrados hasta que esté listo para tomar la imagen. Para las muestras que se obtienen de inmediato, agregue de 15 a 20 microlitros de tampón GLOX con enzimas. Pipetee cinco microlitros en un cubreobjetos y coloque el cubreobjetos en un portaobjetos.Coloque una toallita de laboratorio encima del portaobjetos donde se coloca el cubreobjetos. Presione suavemente la toallita para colocar la corredera. Coloque el portaobjetos en una caja cubierta con papel de aluminio para transferirlo a la sala del microscopio.Este protocolo se utilizó para examinar la expresión del gen NDC80, que expresa dos isoformas de ARNm. La isoforma de transcripción larga sin decodificar tiene una extensión de 400 pares de bases y cinco primos en comparación con la isoforma corta. Se diseñaron dos conjuntos de sondas.El conjunto CF 590 se une a la única región de cinco primos de la isoforma larga, y el conjunto Q 670 se une a la región común de ambas isoformas. En condiciones optimizadas, se identificaron claramente distintos puntos smFISH para ambos conjuntos de sondas. Los dos juegos de sondas se utilizaron para estudiar la expresión de NDC80 durante el crecimiento vegetativo y la meiosis.En las células vegetativas, se detectó una señal robusta del conjunto de sondas Q 670, pero no del conjunto de sondas CF 590. Por el contrario, se detectó una señal robusta de ambos conjuntos de sondas en la profase meiótica, y la mayoría de los puntos tenían señal colocalizada. El análisis de Northern blot confirmó que la isoforma larga se expresaba específicamente en la meiosis.Se encontró que las células vegetativas tenían una mediana de cinco transcripciones de isoformas cortas por célula, mientras que en las células de profase meiótica, la mediana se redujo significativamente a cuatro transcripciones por célula. En la profase meiótica, la mediana del número de transcritos de isoformas largas por célula fue del 21 y el 100% de las células expresaron el transcrito. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 72 horas si se realiza correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante optimizar primero la duración de la digestión y la concentración de sondas smFISH necesarias para lograr la relación señal-ruido óptima. Además, recuerde agregar VRC durante la digestión y la hibridación durante la noche para prevenir la actividad de la nucleasa. Con este desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores exploraran la regulación dinámica de genes y la localización del ARN subcelular.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar FISH de ARN molecular único en la meiosis de levadura en ciernes.

single-molecule-fluorescence-situ-hybridization-smfish-analysis

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Una técnica rápida para la visualización de crecimiento de las células de levadura inmovilizada, aquí se aplica a los reporteros fluorescentes en el silencio de apareamiento loci HML y...

Una técnica rápida para la visualización en vivo de las células de levadura inmovilizada

Cuantitativa de células vivas por fluorescencia microscopia análisis de la levadura de fisión

Este protocolo describe un procedimiento experimental para la realización de...

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proporcionamos un método básico reproducible para la microscopía a largo plazo del ciclo de vida sexual de la levadura de fisión. Con los pequeños ajustes descritos, el protocolo presentado permite que la investigación se centre en diferentes etapas del proceso reproductivo.

Microscopía de la levadura de fisión del ciclo de vida sexual

Este manuscrito describe un método para etiquetar las transcripciones de los ARN mensajero (ARNm) con sonda de ADN marcada con fluorescencia, para el uso en experimentos de fluorescencia de una sola molécula en situ hibridación (smFISH) en e. coli. smFISH es un método de visualización que permite la detección simultánea, localización y cuantificación de moléculas individuales de ARNm en células individuales fijas.

Método para el etiquetado de las transcripciones en los Escherichia coli las células para una sola molécula de la fluorescencia In Situ hibridación experimentos

Este manuscrito presenta un detallado método para la generación X-cromosoma brazo sondas y rendimiento en situ hibridación de la fluorescencia (pescado) para examinar el estado de la hermana cohesión de cromátidas hermanas en Prometafase y metafase detenido  Drosophila ovocitos. Este protocolo es adecuado para determinar si cohesión brazo meiótica es intacta o interrumpida en diferentes genotipos.

Con fluorescencia In Situ hibridación (pescado) para supervisar el estado de la cohesión de brazo en Prometafase y metafase I ovocitos de Drosophila

Aquí, presentamos imágenes de células vivas que es un método de microscopía no tóxico que permite a los investigadores estudiar el comportamiento de las proteínas y la dinámica nuclear en las células de levadura de fisión viva durante la mitosis y la meiosis.

Examen de la dinámica nuclear de levadura de ficción mitotica y meiótica por microscopía de células vivas de fluorescencia

Este protocolo describe una aplicación de hibridación in situ de fluorescencia de una sola molécula (smFISH) para medir la cinética in vivo de la síntesis y degradación del ARNm.

Sondeo de mRNA cinética en el espacio y el tiempo en Escherichia coli usando hibridación de fluorescencia de una sola molécula de dos colores

La hibridación in situ de fluorescencia de ARN de molécula única (smFISH) es un método para cuantificar con precisión los niveles y la localización de ARN específicos a nivel de una sola célula. Aquí, informamos nuestros protocolos de laboratorio validados para el procesamiento de bancos húmedos, imágenes y análisis de imágenes para la cuantificación de células individuales de ARN específicos.

Análisis unicelular de alelos transcripcionalmente activos por FISH de molécula única

La microscopía de lapso de tiempo es una herramienta valiosa para estudiar la meiosis en levaduras en ciernes. Este protocolo describe un método que combina la sincronización del ciclo celular, la microscopía de lapso de tiempo y el agotamiento condicional de una proteína diana para demostrar cómo estudiar la función de una proteína específica durante la segregación cromosómica meiótica.

Uso de microscopía de lapso de tiempo y agotamiento nuclear de proteínas en etapa específica para estudiar la meiosis en S. cerevisiae

Este protocolo detalla dos métodos de detención del ciclo celular de levadura y liberación opcional, y elabora el uso de microscopía de fluorescencia para estudiar los procesos dependientes del ciclo celular en S. cerevisiae.

Manipulación y análisis de procesos dependientes del ciclo celular en levaduras en ciernes

Aprende a detectar y cuantificar moléculas de ARN individuales mediante smFISH en levadura de gemación durante el crecimiento vegetativo y la meiosis. Este método robusto revela la variabilidad en la expresión génica y la localización subcelular del ARN.

Sola molécula fluorescencia In Situ hibridación (smFISH) análisis de florecimiento levadura crecimiento vegetativo y la Meiosis

Explorar más videos