Name: Optogenetics identificación de un tipo Neuronal con un vidrio Optrode en ratones despiertos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Aprende optogenética para identificar tipos neuronales en ratones despiertos usando un optrodo de vidrio personalizado. Esta técnica permite registrar unidades individuales y estimular neuronas GABAérgicas y glutamatérgicas de forma confiable.

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Los autores fueron apoyados por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia KAKENHI Grant JP16K11200 y 17H 02223 y la subvención para la investigación de Kanazawa médica Universidad S2016-8 y C2017-3. Damos las gracias por su apoyo en la toma de las fotos Yuhichi Kuda.

Todos los procedimientos se realizan con arreglo a los principios rectores de la sociedad fisiológica de Japón y con la aprobación de la Animal cuidado Comité de Kanazawa Universidad médica.
1. construcción del vidrio Optrode titular
Nota: Para construir un soporte de optrode de vidrio, se utiliza un soporte de electrodo comercial (figura 1A).
<ol><li>Extraiga con cuidado el tubo de acero para control de la presión del barril del titular.</li>
	<li>Por perforación, ampliar el agujero del lado del asiento de pin en el cañón del titular. Hacer el agujero 3 mm de diámetro y 12 mm de profundidad.</li>
	<li>Poner un tubo de acero inoxidable (3 mm de diámetro, 0,5 mm de espesor y 8 mm de longitud; Figura 1A 2) en el agujero.</li>
	<li>Inserte el partido manga de acoplamiento para virolas de ⌀2.5 mm (figura 1A1) en el orificio de cerámica.</li>
	<li>Fijar el cilindro de la pinza portaelectrodos para una barbilla en forma de L con adhesivo epoxi.</li>
	<li>Hacer los agujeros (3 mm de diámetro) en la barbilla y adjuntarlo a un manipulador con tornillos.</li>
</ol>2. cabeza Post instalación
<ol><li>Preparar un post de cabeza a la medida de un separador de circuitos. Hacer el espaciador cilíndrico de circuitos en forma cuboidal con una fresa y cortar en 2 puestos de cabeza con una sierra (figura 1B). Aplanar la parte inferior del post principal con una fresa.</li>
	<li>Preparar el animal transgénico en el que un opsin de sensibles a la luz se expresa en un tipo de neurona específica para el estudio. En este trabajo, se utiliza el ratón transgénico (ChR2 VGAT ratones) en el cual las neuronas inhibitorias expresan channelrhodopsin-2 (ChR2)11 .</li>
	<li>Anestesiar al animal con una mezcla de 0,3 mg/kg de medetomidina, 4,0 mg/kg de midazolam y 5,0 mg/kg de butorfanol por administración intraperitoneal. Para confirmar que el animal está completamente anestesiado, prueba sus reacciones para pellizcar la cola.</li>
	<li>Coloque el ratón en un marco estereotáctica en un cojín de calefacción. Limpiar el marco estereotáctica y la calefacción almohadilla con alcohol al 70% por adelantado. Colocar los dientes en el agujero de la barra de bocado y apriete ligeramente la abrazadera de la nariz. Fijar ambos lados de la cabeza por medio de barras de oído. Cuando la cabeza se fija correctamente por las barras de oído, apriete la abrazadera de la nariz. Aplicar una pomada oftálmica en los ojos.</li>
	<li>Afeitarse la piel cabeza con pequeñas tijeras y limpiar el cuero cabelludo con un algodón de gluconato de clorhexidina. Antes de la cirugía, esterilizar todos que los instrumentos quirúrgicos y una cabeza de correos con un autoclave (121 ° C, 15 min).</li>
	<li>Corte el cuero cabelludo a lo largo de la línea media con unas tijeras y empuje a un lado. Hacer la incisión de la parte posterior de la cabeza a los ojos (aproximadamente 20 milímetros). Retirar el periostio con un hisopo de algodón humedecido en alcohol al 70% y secar el cráneo.</li>
	<li>Coloque el poste principal en el manipulador. Coloque el post cabeza plana sobre el cráneo en el vértice con el manipulador.</li>
	<li>Mezcla el monómero (4 gotas), catalizador (1 gota) y polímero (1 cuchara pequeña) de cemento dental sobre un pequeño plato que se enfría en la nevera con antelación. Poner el cemento dental (por debajo de 1 g) en el frontal y el hueso parietal del cráneo para fijar el perno de cabeza en el cráneo.</li>
	<li>Después de que el cemento dental se convierte en duro, quitar el ratón en la estructura estereotáxicas. Pongo un ungüento antibiótico en la piel expuesta. Inyecte el antagonista de la medetomidina (0,3 mg/kg) y los antibióticos (oxitetraciclina; 20 mg/kg). Y controlar el mouse sobre el cojín del calor en una jaula hasta que despierta y volver a una jaula cubierta.</li>
	<li>Casa el animal en una jaula de vivienda individual con algún dispositivo de enriquecimiento. Cambiar el papel animal ropa de cama todos los días para mantener la jaula limpia y prevenir infecciones. Controle cuidadosamente si el animal muestra signos de malestar. Se aplica lidocaína a la herida si se sospecha de cualquier dolor. Administrar meloxicam o el carprofeno una vez cada 24 h durante 48 h después de la cabeza de tanto post cirugías instalación y craneotomía. La lidocaína local se puede dar además si el AINE no es adecuada.
</li>
</ol>3. aclimatación
<ol><li>(Mínimo) dos días después de la recuperación de la anestesia, aclimatar a los animales para el estado de cabeza fija en la cámara de grabación. Realizar las sesiones de aclimatación durante al menos 5 días.</li>
	<li>Durante las sesiones de aclimatación, coloque el animal en la sala de grabación con el post principal fijado a una mordaza a la medida. Durante la sesión, con el fin de limitar el movimiento, tapa el cuerpo con un tubo de medio de resina por encargo (figura 1), hecho con una impresora 3D. Nota: El día 1, la sesión de aclimatación debe ser 5 minutos de largo. Es entonces aumentado diariamente a 10, 20, 40 y 60 min para los días 2, 3, 4 y 5, respectivamente.</li>
	<li>Al final de cada sesión, dar al animal una recompensa de comida. Si el animal se esfuerza continuamente durante la aclimatación, detener la sesión.</li>
</ol>4. craneotomía
Nota: Después de la aclimatación, se realiza una craneotomía sobre la región del cerebro para la grabación. La craneotomía se realiza en el marco estereotáctica bajo anestesia, como con la cabeza post instalación. El procedimiento posterior a la operación es el mismo como la cabeza post instalación.
<ol><li>Antes de la craneotomía, limpiar el cráneo con un hisopo de algodón con clorhexidina gluconato y el 70% de alcohol.</li>
	<li>Raspar cuidadosamente el cráneo en el sitio de grabación con un taladro dental. Cuando el hueso se convierte en lo suficientemente delgado, cortar con la punta del bisturí y retírela.</li>
	<li>Poner cemento dental alrededor de la región expuesta a fin de fortalecer el cráneo.</li>
	<li>Cubra el área expuesta del cerebro con adhesivo de silicona después de que el cemento dental se convierte en duro. El procedimiento después de la cirugía es como se describe en el paso 2.8.</li>
</ol>5. grabación electrofisiológico
<ol><li>Permitir que el animal recuperar al menos 1 día después de la craneotomía antes de realizar la grabación electrofisiológica. Colocar el animal en la cámara de grabación de la misma manera que se ha hecho durante las sesiones de aclimatación cuando se inicie la grabación.</li>
	<li>Hacer pipetas de vidrio de Capillares de vidrio de borosilicato (OD = 1,5 mm, ID = 0,9 mm, largo 90,0 mm) tirado en un tirador de electrodo. El diámetro de su punta es 2 – 3 μm, y su resistencia es de 4 a 6 MΩ cuando están llenas de 10 mM PBS. La longitud del electrodo es de 40-50 mm. En algunas grabaciones, neurobiotin 2% se agrega a lo 10 mM PBS.</li>
	<li>Coloque la pipeta de cristal llenado al titular de la optrode por encargo.</li>
	<li>Poner el alambre de plata revestido de Ag-Cl (0,2 mm de diámetro) con la pipeta de cristal. Conecte el alambre de plata a un pin a través de un alambre eléctrico revestido fino. Conectar la clavija en el headstage del amplificador de grabación.</li>
	<li>Conecte el cable de fibra óptica parche (núcleo = 960 μm, revestimiento = 1.000 μm, NA = 0,63) con una virola de zirconia (OD = 2,5 mm) a la división de manga en el soporte de optrode de acoplamiento. Introduzca el cable de parche en la manga hasta la parte posterior de la pipeta de vidrio en contacto con la punta de la virola. Entrega de la cuerda de remiendo de la luz (longitud de onda = 465 nm) del LED. La luz LED es controlada por un controlador de LED de canal único.</li>
	<li>Remover el pegamento de silicona sobre la craneotomía. Poner caliente solución salina (38 ° C) en la superficie del cerebro periódicamente para evitar que la superficie del cerebro se seque durante la sesión de grabación. Si es necesario, retire la duramadre con pinzas afiladas.</li>
	<li>Insertar el electrodo de vidrio en el tejido cerebral con un manipulador. Monitorear la resistencia del electrodo cuando se inserta. Vuelva a colocar el electrodo cuando la resistencia es menor de lo esperado porque la punta del electrodo puede dañarse. En la profundidad de interés, buscar y aislar las puntas de la unidad de ajuste de la profundidad en pasos de 2 a 5 μm.</li>
	<li>Después de que la unidad está aislada, entregar la luz y observar la respuesta a los estímulos de luz.</li>
	<li>Registrar las actividades neuronales después de la identificación de los tipos de células. Realizar las grabaciones para 2-3 h. Si la grabación se realiza en días consecutivos (máxima de 2 días), cubrir la craneotomía con adhesivo de silicona. Cuando la grabación está terminada, y el animal es sacrificado, recuperar el post principal y ponerlo en acetona para lavar y reutilícelo.</li>
</ol>

<ol><li>Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting neural circuits.</a> Cell. 165 (3), 524-534 (2016).</li>
<li>Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+neural+activity+in+physiologically+classified+neurons%3A+triumphs+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216(2015).</li>
<li>Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identified+GABAergic+and+glutamatergic+neurons+in+the+mouse+inferior+colliculus+share+similar+response+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identified GABAergic and glutamatergic neurons in the mouse inferior colliculus share similar response properties.</a> Journal of Neuroscience. 37 (37), 8952-8964 (2017).</li>
<li>Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+sound-evoked+afterdischarge+in+the+auditory+midbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-lasting sound-evoked afterdischarge in the auditory midbrain.</a> Scientific Reports. 6, 20757(2016).</li>
<li>Munoz, W., Tremblay, R., Rudy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-assisted+patching%3A+in+vivo+recording+of+genetically+and+morphologically+identified+neurons+throughout+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-assisted patching: in vivo recording of genetically and morphologically identified neurons throughout the brain.</a> Cell Reports. 9 (6), 2304-2316 (2014).</li>
<li>Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINP%3A+a+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4 (7), e6099(2009).</li>
<li>Kuwada, S., Batra, R., Stanford, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monaural+and+binaural+response+properties+of+neurons+in+the+inferior+colliculus+of+the+rabbit%3A+effects+of+sodium+pentobarbital%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Monaural and binaural response properties of neurons in the inferior colliculus of the rabbit: effects of sodium pentobarbital.</a> Journal of Neurophysiology. 61 (2), 269-282 (1989).</li>
<li>Populin, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetics+change+the+excitation%2Finhibition+balance+that+governs+sensory+processing+in+the+cat+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 25 (25), 5903-5914 (2005).</li>
<li>Duque, D., Malmierca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-specific+adaptation+in+the+inferior+colliculus+of+the+mouse%3A+anesthesia+and+spontaneous+activity+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects.</a> Brain Structure and Function. 220 (6), 3385-3398 (2015).</li>
<li>Cai, R., Richardson, B. D., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+to+predictable+versus+random+temporally+complex+stimuli+from+single+units+in+auditory+thalamus%3A+impact+of+aging+and+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Responses to predictable versus random temporally complex stimuli from single units in auditory thalamus: impact of aging and anesthesia.</a> Journal of Neuroscience. 36 (41), 10696-10706 (2016).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).</li>
<li>Ito, T., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+classes+of+GABAergic+neurons+in+the+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two classes of GABAergic neurons in the inferior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 29 (44), 13860-13869 (2009).</li>
<li>Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+in+inferior+colliculus+of+the+GAD67-GFP+knock-in+mouse%3A+electrophysiological+and+morphological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties.</a> Neuroscience Research. 51 (4), 475-492 (2005).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+using+Thy1-GCaMP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice.</a> Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).</li>
<li>Hirai, Y., Nishino, E., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+recording+of+fluorescence+and+electrical+signals+by+photometric+patch+electrode+in+deep+brain+regions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous recording of fluorescence and electrical signals by photometric patch electrode in deep brain regions in vivo.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (10), 3930-3942 (2015).</li>
<li>LeChasseur, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microprobe+for+parallel+optical+and+electrical+recordings+from+single+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microprobe for parallel optical and electrical recordings from single neurons in vivo.</a> Nature Methods. 8 (4), 319-325 (2011).</li>
<li>Abaya, T. V., Blair, S., Tathireddy, P., Rieth, L., Solzbacher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+glass+optrode+array+for+optical+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">A 3D glass optrode array for optical neural stimulation.</a> Biomedical Optics Express. 3 (12), 3087-3104 (2012).</li>
<li>Bittner, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjunctive+input+processing+drives+feature+selectivity+in+hippocampal+CA1+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Conjunctive input processing drives feature selectivity in hippocampal CA1 neurons.</a> Nature Neuroscience. 18 (8), 1133-1142 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Optogenetics se ha convertido en una herramienta poderosa en la neurociencia. Se ha utilizado para identificar tipos específicos neuronas en vivo así como manipular las actividades de vías neuronales específicas. La clarificación de las actividades neuronales de diferentes tipos neuronales promueve la comprensión del mecanismo de los circuitos neuronales. Aquí, hemos demostrado un método para proporcionar la luz en el sitio de grabación a través de un electrodo de vidrio en el IC de despiertas ratones VGAT ChR2....

El sistema nervioso central consta de varios tipos de neuronas, que tienen diferentes funciones. Cómo funcionan estos tipos de neuronas dentro del circuito neural es una de las preocupaciones principales de la neurociencia. Sin embargo, en muchas regiones del cerebro, ha sido imposible distinguir los tipos neuronales en grabaciones en vivo de actividades eléctricas porque no hay clara diferencia en la señal de punto eléctrico, con algunas excepciones. Los avances recientes en optogenetics han hecho un gran avance1,2. Uso de animales transgénicos que sensibles a la luz opsina (p. ej., channelrhodopsin-2) se expresa en tipos neuronales específicos, llegó a ser posible distinguir los tipos neuronales eficientemente en vivo grabaciones3, 4,5,6. En estos animales se excitan las neuronas con sensibles a la luz opsina dando estímulos de luz durante las grabaciones eléctricas, pero otras neuronas no son. Las neuronas de la opsina-positivo, por lo tanto, se distinguen fácilmente de otros tipos de neurona por sus respuestas a la luz.
En experimentos de optogenetics, es fundamental para entregar la luz en el sitio de grabación. Como un método no invasivo, la luz es dirigida a menudo de la superficie del cerebro. Sin embargo, porque la fuerza de la luz reduce ya que pasa a través de tejido fino del cerebro, es difícil estimular las regiones profundas del cerebro de la superficie del cerebro. Sobre todo, es difícil para la luz de estimulación llegar a las regiones profundas del cerebro cuando la transparencia óptica de la superficie del cerebro es baja, como sucede a menudo con grabaciones de animales despiertos. Experimentos electrofisiológicos a menudo se han realizado en animales anestesiados ya que el movimiento del cuerpo hace ruido en las grabaciones. Como está bien documentado, sin embargo, la anestesia es conocida por cambiar las respuestas neuronales7,8,9,10. Por lo tanto, es necesario utilizar animales despiertos para estudiar las respuestas neuronales sin el efecto artificial de la anestesia. A diferencia de los experimentos con animales anestesiados, las grabaciones electrofisiológicas se realizan después de la recuperación de la cirugía en los experimentos con animales despiertos. Durante el intervalo entre la cirugía y las grabaciones, el exudado del tejido a menudo se acumula en la superficie del cerebro y hace poco la transparencia óptica de la superficie del cerebro.
Aquí, describimos un método para registrar grabaciones de una sola unidad de un ratón despierto utilizando un optrode de cristal a medida. En este método, la luz se proporciona mediante el electrodo de cristal de la grabación para que sea posible estimular confiablemente la neurona grabada con luz en regiones profundas del cerebro. Este sistema de optrode por encargo consiste en materiales accesibles y de bajo costo y es fácil de montar.

<table><tbody><tr><td>Portaelectrodos</td><td>Molecular Device</td><td>1-HL-U</td><td>Soporte de pipeta para amplificador de microelectrodos</td></tr><tr><td>Manguito de acoplamiento dividido cerámico</td><td>Férula Thorlabs</td><td>ADAF1</td><td>f2.5 mm</td></tr><tr><td>Espaciador de placa de circuito</td><td>Teishin Denki</td><td>SPA-320</td><td>f8.0 mm, 20.0 mm de largo</td></tr><tr><td>Marco estereotáxico para ratones</td><td>Narishige</td><td>SR-6M-HT</td><td>Instrumentos estereotáxicos para ratones</td></tr><tr><td>Manipulador</td><td>Narishige</td><td>NA</td><td>Manipulador manual</td></tr><tr><td>Superbond</td><td>Sun Medical</td><td>M: 204610557</td><td>Adhesivo dental cemento de resina</td></tr><tr><td>Form2</td><td>Impresora 3D</td><td>Formlabs</td><td>NA</td></tr><tr><td>Kwik-Sil</td><td>WPI</td><td>KWIK-SIL</td><td>Adhesivo de silicona de baja toxicidad</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de borosilicato</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td>OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 90.0 mm de largo</td></tr><tr><td>Latiguillo de fibra óptica</td><td>Lentes Doric</td><td>MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5</td><td>Latiguillo monofibra óptica, diámetro exterior, 2,5 mm, núcleo = 960 mm, revestimiento = 1000 mm, NA = 0,63</td></tr><tr><td>Lentes dóricas</td><td>LED conectadas</td><td>LEDC-1B_FC Longitud de</td><td>onda central = 465 nm, potencia de salida = 45 mW (Core 960 mm 0,63 NA )</td></tr><tr><td>Controlador LED</td><td>Lentes Doric LEDRV_1CH_1000</td><td></td><td>1 canal Controlador LED, salida máxima = 1000 mA</td></tr><tr><td>Extractor de electrodos</td><td>Narishige</td><td>PB-7</td><td>Extractor de micropipetas de vidrio de doble etapa</td></tr><tr><td>Capilar de vidrio de borosilicato</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td>Capilar de vidrio de bolosilicato, OD, 1,5 mm, ID, 0,9 mm, 90,0 mm de largo</td></tr><tr><td>GENTACIN</td><td>MSD CO., Ltd</td><td>185711173</td><td>Pomada antibiótica</td></tr><tr><td>Terramycin&reg;-LA</td><td>Zoetis</td><td>G 333</td><td>Oxytetraciclina</td></tr><tr><td>Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J</td><td>Jackson Labs</td><td>#14548</td><td>VGAT-ChR2 ratones</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B</td><td>Molecular Devices</td><td>2500-0157</td><td>Amplificador de microelectrodo</td></tr></tbody></table>

optogenetics identificación de un tipo neuronal con un vidrio optrode en ratones despiertos

Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

Es una preocupación importante en Neurociencia cómo diferente tipos de neuronas funcionan en circuitos neurales. Los avances recientes en optogenetics han permitido la identificación del tipo neuronal en vivo experimentos electrofisiológicos en regiones amplias del cerebro. En experimentos de optogenetics, es fundamental para entregar la luz en el sitio de grabación. Sin embargo, a menudo es difícil entregar la luz del estímulo a las regiones profundas del cerebro de la superficie del cerebro. Sobre todo, es difícil para la luz de estimulación llegar a las regiones profundas del cerebro cuando la transparencia óptica de la superficie del cerebro es baja, como sucede a menudo con grabaciones de animales despiertos. Aquí, describimos un método para registrar respuestas de espiga a la luz de un ratón despierto utilizando un optrode de cristal a medida. En este método, la luz se proporciona mediante el electrodo de cristal de la grabación para que sea posible estimular confiablemente la neurona grabada con luz en las regiones profundas del cerebro. Este sistema de optrode por encargo consiste en materiales accesibles y de bajo costo y es fácil de montar.

En la figura 2, se analizaron los efectos del tamaño de la punta y la longitud de las pipetas de vidrio en la potencia de luz en la punta de las pipetas (figura 2A-B). La potencia de luz fue medida por un medidor de potencia óptica a 1 mm de la punta. La longitud total se estableció en 50 ± 2 mm cuando el tamaño de la punta varía, mientras que el tamaño de la punta fue a 2.5 μm cuando la longitud total varió. El ...

Este trabajo presenta un método para realizar un optogenetic de una sola unidad grabación fiable desde un ratón despierto utilizando un optrode de cristal a medida.

Optogenetics identificación de un tipo Neuronal con un vidrio Optrode en ratones despiertos

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como las funciones de diferentes tipos de neuronas. La principal ventaja de esta técnica es que permite identificar de forma fiable los diferentes tipos de neuronas in vivo con materiales baratos y accesibles. Voy a demostrar el procedimiento junto con Shinji Muramoto, nuestro técnico, y Lanlan Ma, nuestro profesor asistente de nuestro laboratorio.Para comenzar este procedimiento, extraiga suavemente el tubo de acero para controlar la presión del barril del soporte. Amplíe el orificio del lado del asiento del pasador en el cañón del soporte perforando. Luego, coloque un tubo de acero inoxidable en el orificio.A continuación, inserte un manguito de acoplamiento dividido de cerámica para férula de 2,5 milímetros de diámetro en el orificio. Haga un agujero en un conejo en forma de L y fije el cilindro del portaelectrodos al conejo con adhesivo epoxi. Posteriormente, fíjelo a un manipulador con tornillos.Prepare un poste de cabeza hecho a medida haciendo el espaciador de la placa de circuito de columna en forma de cuboidal con una fresa y córtelo en dos postes de cabeza con una sierra. Luego, aplana la parte inferior del poste principal con una fresa. Antes de la cirugía, esterilice todo el instrumental quirúrgico y un poste de cabeza con un autoclave.Limpie el marco estereotáxico y la almohadilla térmica con alcohol al 70 por ciento. A continuación, anestesia el ratón y colócalo en el marco estereotáxico sobre una almohadilla térmica. En este experimento se utiliza un ratón transgénico en el que las neuronas inhibidoras expresan canalrodopsina-II.Coloque los dientes en el orificio de la barra de mordida y apriete ligeramente la pinza nasal. Posteriormente, fije ambos lados de la cabeza con barras para las orejas. Cuando la cabeza esté correctamente fijada por las barras de la oreja, apriete la pinza nasal.Aplique un ungüento oftálmico en los ojos. Recorta el cabello sobre la cabeza con unas tijeras pequeñas y limpia el cuero cabelludo con un hisopo de algodón de gluconato de clorhexidina. Luego, corta el cuero cabelludo a lo largo de la línea media y empújalo a un lado.Retire el periostio con un hisopo de algodón humedecido en alcohol al 70 por ciento y deje que el cráneo se seque. A continuación, fije el poste de la cabeza al manipulador. Coloque el poste de la cabeza plano en el cráneo alrededor del bregma con el manipulador.Mezcle cuatro gotas del monómero, una gota de catalizador y una cucharada pequeña de polímero en un plato pequeño que se enfríe en el refrigerador. Aplique cemento dental en el hueso frontal y parietal y fije el poste de la cabeza al cráneo. Después de que el cemento dental se haya endurecido, retire el ratón del marco estereotáxico.Aplique una pomada antibiótica sobre la piel expuesta e inyecte un cóctel de antagonista de la medetomidina y antibiótico. Luego, coloque el mouse en la almohadilla térmica en una jaula hasta que se despierte y devuélvalo a una jaula de alojamiento con enriquecimientos. Para realizar una craneotomía sobre la región cerebral objetivo para el registro, limpie el cráneo con un hisopo de algodón empapado con gluconato de clorhexidina y alcohol al 70 por ciento.Raspe cuidadosamente el cráneo sobre el sitio de grabación con un taladro dental. Cuando el hueso esté lo suficientemente fino, córtalo con la punta del bisturí y retíralo. A continuación, aplique cemento dental alrededor de la región expuesta para fortalecer el cráneo.Cubra el área expuesta del cerebro con adhesivo de silicona después de que el cemento dental se haya endurecido. Luego, coloque al animal en la almohadilla térmica en una jaula hasta que se despierte y devuélvalo a una jaula de alojamiento. Permitir que el animal se recupere durante al menos un día después de la craneotomía, antes de realizar el registro electrofisiológico.Antes de realizar el registro electrofisiológico, haga algunas pipetas de vidrio a partir de capilares de vidrio de borosilicato utilizando un extractor de electrodos. Llene las pipetas con 10 milimolares de PBS. En algunas grabaciones, se añade un dos por ciento de neurobiotina a los 10 milimolares de PBS.A continuación, coloque el animal en la cámara de registro. Coloque una pipeta de vidrio llena en el soporte optrode hecho a medida. Inserte un alambre recubierto de cloruro de plata en la pipeta de vidrio.A continuación, conecte el pin a la etapa principal del amplificador de grabación. A continuación, conecte el cable de conexión de fibra óptica con una férula de circonio al manguito de acoplamiento dividido en el soporte optrode. Empuje el cable de conexión en el manguito hasta que la punta de la férula entre en contacto con la parte posterior de la pipeta de vidrio.El cable de conexión emite la luz desde el LED, que está controlado por un controlador LED de un solo canal. Después, retire el adhesivo de silicona sobre la craneotomía. Aplique solución salina tibia en la superficie del cerebro periódicamente para evitar que la superficie del cerebro se seque durante la sesión de grabación.Si es necesario, retire la duramadre con pinzas afiladas. Aquí, las respuestas de la espícula se registraron en el colículo inferior de los ratones VGAT canalrodopsina-II despiertos. En el colículo inferior de los ratones VGAT canalrodopsina-II, las neuronas GABAérgicas expresan específicamente la canalrodopsina-II.En los ratones despiertos, tanto las neuronas GABAérgicas como las glutamatérgicas se excitaron o suprimieron respectivamente cuando se les dieron estímulos ligeros. Cuando el estímulo luminoso se administra a través del electrodo de vidrio, evoca respuestas de pico en algunas neuronas. Por el contrario, en otras neuronas, los estímulos luminosos suprimieron las respuestas de pico evocadas por los estímulos sonoros.Estos resultados muestran que un optrodo de vidrio puede registrar la actividad de una sola unidad bien aislada y estimular de manera confiable las neuronas registradas por la luz. Después del desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran cómo funcionan los diferentes tipos de neuronas en la cuenca neural de varias regiones del cerebro.

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Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

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