Optogenetics identificación de un tipo Neuronal con un vidrio Optrode en ratones despiertos

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como las funciones de diferentes tipos de neuronas. La principal ventaja de esta técnica es que permite identificar de forma fiable los diferentes tipos de neuronas in vivo con materiales baratos y accesibles. Voy a demostrar el procedimiento junto con Shinji Muramoto, nuestro técnico, y Lanlan Ma, nuestro profesor asistente de nuestro laboratorio.

Para comenzar este procedimiento, extraiga suavemente el tubo de acero para controlar la presión del barril del soporte. Amplíe el orificio del lado del asiento del pasador en el cañón del soporte perforando. Luego, coloque un tubo de acero inoxidable en el orificio.

A continuación, inserte un manguito de acoplamiento dividido de cerámica para férula de 2,5 milímetros de diámetro en el orificio. Haga un agujero en un conejo en forma de L y fije el cilindro del portaelectrodos al conejo con adhesivo epoxi. Posteriormente, fíjelo a un manipulador con tornillos.

Prepare un poste de cabeza hecho a medida haciendo el espaciador de la placa de circuito de columna en forma de cuboidal con una fresa y córtelo en dos postes de cabeza con una sierra. Luego, aplana la parte inferior del poste principal con una fresa. Antes de la cirugía, esterilice todo el instrumental quirúrgico y un poste de cabeza con un autoclave.

Limpie el marco estereotáxico y la almohadilla térmica con alcohol al 70 por ciento. A continuación, anestesia el ratón y colócalo en el marco estereotáxico sobre una almohadilla térmica. En este experimento se utiliza un ratón transgénico en el que las neuronas inhibidoras expresan canalrodopsina-II.

Coloque los dientes en el orificio de la barra de mordida y apriete ligeramente la pinza nasal. Posteriormente, fije ambos lados de la cabeza con barras para las orejas. Cuando la cabeza esté correctamente fijada por las barras de la oreja, apriete la pinza nasal.

Aplique un ungüento oftálmico en los ojos. Recorta el cabello sobre la cabeza con unas tijeras pequeñas y limpia el cuero cabelludo con un hisopo de algodón de gluconato de clorhexidina. Luego, corta el cuero cabelludo a lo largo de la línea media y empújalo a un lado.

Retire el periostio con un hisopo de algodón humedecido en alcohol al 70 por ciento y deje que el cráneo se seque. A continuación, fije el poste de la cabeza al manipulador. Coloque el poste de la cabeza plano en el cráneo alrededor del bregma con el manipulador.

Mezcle cuatro gotas del monómero, una gota de catalizador y una cucharada pequeña de polímero en un plato pequeño que se enfríe en el refrigerador. Aplique cemento dental en el hueso frontal y parietal y fije el poste de la cabeza al cráneo. Después de que el cemento dental se haya endurecido, retire el ratón del marco estereotáxico.

Aplique una pomada antibiótica sobre la piel expuesta e inyecte un cóctel de antagonista de la medetomidina y antibiótico. Luego, coloque el mouse en la almohadilla térmica en una jaula hasta que se despierte y devuélvalo a una jaula de alojamiento con enriquecimientos. Para realizar una craneotomía sobre la región cerebral objetivo para el registro, limpie el cráneo con un hisopo de algodón empapado con gluconato de clorhexidina y alcohol al 70 por ciento.

Raspe cuidadosamente el cráneo sobre el sitio de grabación con un taladro dental. Cuando el hueso esté lo suficientemente fino, córtalo con la punta del bisturí y retíralo. A continuación, aplique cemento dental alrededor de la región expuesta para fortalecer el cráneo.

Cubra el área expuesta del cerebro con adhesivo de silicona después de que el cemento dental se haya endurecido. Luego, coloque al animal en la almohadilla térmica en una jaula hasta que se despierte y devuélvalo a una jaula de alojamiento. Permitir que el animal se recupere durante al menos un día después de la craneotomía, antes de realizar el registro electrofisiológico.

Antes de realizar el registro electrofisiológico, haga algunas pipetas de vidrio a partir de capilares de vidrio de borosilicato utilizando un extractor de electrodos. Llene las pipetas con 10 milimolares de PBS. En algunas grabaciones, se añade un dos por ciento de neurobiotina a los 10 milimolares de PBS.

A continuación, coloque el animal en la cámara de registro. Coloque una pipeta de vidrio llena en el soporte optrode hecho a medida. Inserte un alambre recubierto de cloruro de plata en la pipeta de vidrio.

A continuación, conecte el pin a la etapa principal del amplificador de grabación. A continuación, conecte el cable de conexión de fibra óptica con una férula de circonio al manguito de acoplamiento dividido en el soporte optrode. Empuje el cable de conexión en el manguito hasta que la punta de la férula entre en contacto con la parte posterior de la pipeta de vidrio.

El cable de conexión emite la luz desde el LED, que está controlado por un controlador LED de un solo canal. Después, retire el adhesivo de silicona sobre la craneotomía. Aplique solución salina tibia en la superficie del cerebro periódicamente para evitar que la superficie del cerebro se seque durante la sesión de grabación.

Si es necesario, retire la duramadre con pinzas afiladas. Aquí, las respuestas de la espícula se registraron en el colículo inferior de los ratones VGAT canalrodopsina-II despiertos. En el colículo inferior de los ratones VGAT canalrodopsina-II, las neuronas GABAérgicas expresan específicamente la canalrodopsina-II.

En los ratones despiertos, tanto las neuronas GABAérgicas como las glutamatérgicas se excitaron o suprimieron respectivamente cuando se les dieron estímulos ligeros. Cuando el estímulo luminoso se administra a través del electrodo de vidrio, evoca respuestas de pico en algunas neuronas. Por el contrario, en otras neuronas, los estímulos luminosos suprimieron las respuestas de pico evocadas por los estímulos sonoros.

Estos resultados muestran que un optrodo de vidrio puede registrar la actividad de una sola unidad bien aislada y estimular de manera confiable las neuronas registradas por la luz. Después del desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran cómo funcionan los diferentes tipos de neuronas en la cuenca neural de varias regiones del cerebro.