Desplegable base de biotina de ensayo a validar mRNA miRNAs objetivos de celular

Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave en el campo de la biología del ARNm, como por ejemplo, si el objetivo de ARNm predicho in silico puede interactuar directamente con un microARN celular en particular. La principal ventaja de este método es que utiliza imitadores biotinilados para reducir el ARNm objetivo. Y estos imitadores biotinilados tienen ácidos nucleicos bloqueados o química mímica basada en LNA que ayuda en la formación de oligonucleótidos muy estables con una afinidad muy alta que puede mejorar la especificidad de la reacción.

Las implicaciones de esta metodología es que puede ir desde la comprensión de la biología del microARN hasta la terapéutica basada en microARN. Esto se debe principalmente a que todos sabemos que los microARN desempeñan un papel fundamental en todos los aspectos de la biología celular. Por lo tanto, al identificar los objetivos de los microARN, que son los ARNm, sin duda podemos proporcionar conocimientos críticos que serían importantes para el descubrimiento y la terapéutica.

La demostración del protocolo estará a cargo de Sabyasachi Dash, un estudiante graduado de nuestro laboratorio. Para recubrir las perlas magnéticas con estreptavidina, primero, vórtelas a fondo para volver a suspenderlas. Luego, transfiera 30 microlitros de las perlas resuspendidas en un tubo de microfuga libre de nucleasa de dos milímetros.

Deje el tubo lleno con la suspensión magnética de perlas en el imán durante dos minutos. Pasados dos minutos, retire el sobrenadante con la ayuda de una micropipeta cuando las perlas se atraigan hacia el lado del tubo en contacto con el imán. Luego, agregue 100 microlitros de tampón de lavado a las perlas.

Después de agregar el tampón de lavado, retire el tubo del imán. Luego, agita las cuentas durante 15 segundos para lavarlas. A continuación, transfiera el tubo que contiene las perlas magnéticas al imán durante dos minutos.

Una vez finalizada la incubación, pipetea el sobrenadante y deséchalo. A continuación, añada 100 microlitros de solución liberadora de RNasa a las perlas. Agite las perlas durante 15 segundos para mezclar la solución de RNasa.

Luego, incuba las perlas a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de cinco minutos de incubación, transfiera el tubo que contiene las perlas magnéticas al imán durante dos minutos. Después de la incubación, pipetear el sobrenadante y desecharlo.

A continuación, agregue 100 microlitros de solución de resuspensión a las perlas y agite el vórtice durante 15 segundos. Después del vórtice, incube el tubo a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de cinco minutos, transfiera el tubo con las perlas magnéticas en el imán durante dos minutos.

Después de dos minutos, pipetee el sobrenadante y deséchelo. A continuación, agregue 200 microlitros de solución bloqueadora de cuentas a las cuentas. Para volver a suspender las perlas en la solución de bloqueo, póngala completamente a temperatura ambiente durante 15 segundos.

Luego, deje el tubo en un rotador multitubo a cuatro grados centígrados durante 16 horas. Para preparar el lisado, use un raspador de células y raspe las células HEK293T transfectadas debajo de la cubierta laminar. Luego, transfiera la suspensión celular a un tubo de microfuga de dos mililitros.

A continuación, someta la suspensión celular a centrifugación a 1.500 g durante cinco minutos. Después de la centrifugación, disuelva el pellet de la célula en 1x solución salina tamponada con fosfato mantenida a pH 7,2. Repita el proceso de centrifugación, para obtener un pellet residual libre de medio.

Una vez finalizada la centrifugación, transfiera rápidamente el pellet al hielo. A continuación, prepare un tampón de lisis celular fresco. Después de preparar el tampón, agregue 260 microlitros de tampón de lisis celular completo a la muestra en el tubo de microfuga.

Pipetear el pellet de la célula varias veces para obtener una suspensión homogénea. Para lisar las células, incube los tubos a 80 grados centígrados durante 10 a 15 minutos. Luego, deja las celdas en hielo.

Repita el proceso de centrifugación a 16.000 g durante cinco minutos en una centrífuga de sobremesa a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, transfiera el sobrenadante que contiene lisado en un tubo de microfuga estéril de 1,7 mililitros sobre hielo y expulse el pellet. Al sobrenadante, agregue cloruro de sodio de cinco molares para lograr una concentración final de un molar.

Primero, prepare el tampón de lavado desplegable. Después de la incubación durante la noche después del bloqueo de las perlas, transfiera el tubo que contiene las perlas magnéticas al imán durante dos minutos. Deseche el sobrenadante después del período de incubación.

A las perlas, agregue 150 microlitros de tampón de lavado desplegable helado. Luego, agita las cuentas a temperatura ambiente durante 15 segundos. E incubar inmediatamente a temperatura ambiente durante 30 a 60 segundos.

Después de un minuto, transfiera el tubo que contiene las perlas magnéticas en el imán durante dos minutos. Deseche el sobrenadante después del período de incubación. Luego, vuelva a suspender las perlas en 300 microlitros de tampón de lavado desplegable completo.

Después de agregar cloruro de sodio, transfiera 300 microlitros del lisado celular a un tubo de microfuga lleno de 300 microlitros de perlas. Luego, deje la mezcla en la batidora de nutrientes durante una hora a temperatura ambiente. Después de una hora, transfiera el tubo en el imán durante cinco minutos.

Deseche el sobrenadante después del período de incubación. A continuación, agregue 300 microlitros de tampón de lavado desplegable completo helado a las perlas. Después de agregar el tampón, agite las cuentas durante 15 segundos a temperatura ambiente.

Luego, coloque el tubo en el imán durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante después del período de incubación. Luego, disuelva las perlas en 100 microlitros de agua sin nucleasas y guárdelas en hielo.

Aísla el ARN total de las perlas. A continuación, disuelva el ARN aislado en 25 microlitros de agua libre de nucleasas. A continuación, mida la concentración de ARN en el espectrofotómetro.

Finalmente, prepare la solución madre de trabajo de ARN a 50 nanogramos por microlitro. A continuación, utilice 50 nanogramos del ARN aislado total para sintetizar ADN complementario siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación, añade cebadores oligo hasta un volumen final de 20 microlitros.

Coloque el tubo de PCR en el termociclador e inicie la carrera. Una vez completada la qPCR, transfiera nueve microlitros de la mezcla de reacción de PCR en cada pocillo de la placa. A cada pocillo, agregue un microlitro de ADN complementario para lograr un volumen final de 10 microlitros.

A continuación, use un sellador de placa PCR resistente al calor para sellar la placa PCR y cargarla en el termociclador. A continuación, inicie el programa en el termociclador. Con el fin de validar las dianas de miR-125b, se estudian los niveles de expresión de los ARNm diana de PARP-1 y p53.

Curiosamente, los niveles de expresión de los ARNm de PARP-1 y p53 son comparativamente más altos que los del ARNm de actina, que es el control negativo. Otros controles negativos utilizados en el experimento son la ausencia de plantilla, y tres secuencias primarias biotiniladas codificadas. Además, las tres regiones principales no traducidas de PARP-1 y p53 cuantificadas, también muestran diferentes niveles de amplificación.

Esto es en comparación con los controles negativos, como la actina, sin plantilla y tres secuencias revueltas biotiniladas principales. Esta amplificación de PARP-1 y p53 indica que estos son objetivos fuertes de miR-125b celular. Una vez dominada, esta técnica, desde la siembra de las células, hasta la transfección de los mímicos de LNA marcados con biotina y concluyendo con el análisis de PCR, se puede realizar en una semana, si se realiza correctamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo validar los objetivos putativos de ARNm en células de mamíferos. Esto se puede lograr con una alta especificidad a una relación de bajo ruido mediante la introducción de la transfección basada en imitaciones de ácido nucleico bloqueado marcadas con biotina principal en las células de mamíferos. No hay que olvidar que trabajar con ARN, especialmente con ARN pequeño, como los micro ARN, puede ser muy sensible y propenso a la degradación.

Por lo tanto, se deben tomar las precauciones necesarias al realizar este ensayo, como el uso de agua sin nucleasas, tubos de microfuga sin nucleasas y tampones estériles, y se deben considerar tampones y reactivos recién preparados al realizar este ensayo para obtener una mejor sensibilidad y mejores resultados.