La rueda: Protocolo de entrenamiento de intervalo para suavemente inducida por ejercicio en Drosophila melanogaster

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación metabólica, como determinar si determinadas intervenciones en el estilo de vida, como el ejercicio, pueden beneficiar a individuos específicos. A menudo, los individuos nuevos en este método tendrán dificultades para identificar las larvas en la primera etapa de estadio. La clave es recolectar larvas casi del mismo tamaño que los huevos.

La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para evaluar el impacto del ejercicio en muchas condiciones experimentales y genotipos. Primero, ensamble las cámaras de puesta para cada grupo experimental. Aplique una cucharada de pasta de levadura en un plato de agar jugo de manzana y asegure el plato a una botella de plástico de seis onzas.

Las placas de agar jugo de manzana se elaboran haciendo una solución de agar al 3% en jugo de manzana comprado en la tienda. Y luego llenando platos de 35 por 10 milímetros a 3/4 de la pared. La pasta de levadura se elabora mezclando levadura seca activa comprada en la tienda con agua en una proporción de aproximadamente dos mililitros de agua destilada por gramo de levadura.

Mantenga la pasta cubierta sin apretar para permitir la desgasificación y aplique cucharadas de aproximadamente tres milímetros a cada placa. La botella, fabricada en polipropileno, debe estar preparada con pequeños orificios para la ventilación. Después de preparar los componentes para la cámara, proceda a cargar los adultos.

Una vez que los adultos del genotipo deseado estén todos en la botella, tape la botella con la placa y asegure el conjunto con bandas elásticas. Asegurar un número suficiente de moscas adultas para las cámaras de puesta probablemente requiere que uno comience a construir números de población varias generaciones antes del experimento planeado. Ahora, cambie los platos de agar de jugo de manzana dos veces al día, una vez por la mañana y otra por la noche.

Luego, deje que los huevos se desarrollen en las placas recolectadas durante 12 a 24 horas hasta convertirse en larvas de primer estadio. Para recolectar estas larvas, use un pincel delgado o un pico hecho con una aguja delgada flexible y un mango. Para cada grupo experimental, transfiera 50 larvas del primer estadio a un vial de alimento fresco y deje que se desarrollen hasta la edad adulta.

Para asegurarse de que puede recolectar suficientes larvas para cada una de sus réplicas, asegúrese de que haya investigadores disponibles que sean eficientes en la recolección de larvas para obtener las cantidades que necesita. Después de la pupa, recoja las pupas humedeciéndolas primero con un pincel pequeño y húmedo. Luego, saque suavemente las pupas de los lados de los viales con una espátula.

Cargue las pupas en viales vacíos. Luego, tras la eclosión, transfiera a los adultos a viales de alimentos estándar. De uno a cinco días después de la eclosión, separar las moscas según el sexo y dividir cada sexo en dos grupos, experimental y controlado.

Mantenga los adultos a 50 moscas por vial. Dale a las moscas frascos frescos con levadura viva cada dos días. Si bien es posible mantener a los adultos sin suplementos de levadura viva, hemos descubierto que los adultos se desempeñan mejor con el suplemento.

La suplementación con levadura viva es una variable que los investigadores pueden modificar para adaptarla a sus objetivos específicos de investigación. El dispositivo de ejercicio utiliza un simple sistema de correa y polea accionado por un motor de velocidad variable. Antes de usar el dispositivo de ejercicio, retire los viales conectados a él y calibre la velocidad del motor usando la fuente de alimentación de modo que un período de rotación completo sea de 15 segundos.

Para cronometrar la velocidad de rotación, coloque un pincel pequeño en la cubierta del motor y coloque el cepillo de modo que toque uno de los soportes giratorios. A continuación, cronometra el número de rotaciones realizadas contando los contactos del cepillo y el soporte por minuto. Usando una máquina calibrada, proceda con el primer día de ejercicio, generalmente un lunes.

Introduzca los tapones de los viales en los viales. Deje a las moscas un centímetro de espacio en los viales de control y seis centímetros de espacio en los viales de ejercicio. Ahora coloque los viales en las pinzas y con 10 minutos para que las moscas se aclimaten.

El dispositivo de ejercicio puede contener hasta 48 viales. La temperatura ambiente debe permanecer constante durante todo el procedimiento de varios días o el dispositivo de ejercicio puede caber en una incubadora, si lo desea. El diseño experimental consiste en cinco días consecutivos de ejercicio por semana.

Cada día de ejercicio contiene períodos alternos de ejercicio y descanso. Cada día, se agregan cinco minutos a uno de los períodos de ejercicio para que durante una semana laboral de cinco días, los cuatro períodos de ejercicio aumenten en cinco minutos. Una vez que las moscas estén aclimatadas, comience el primer período de ejercicio.

Haga funcionar la máquina durante 15 minutos. Durante el descanso de cinco minutos entre períodos, deje los viales en las pinzas. Después de completar el cuarto ciclo de ejercicio, regrese los tapones de los viales de comida a sus posiciones normales y devuelva las moscas a su incubadora.

Para establecer si el ejercicio en la rueda influía en los rasgos metabólicos, se midió y normalizó el almacenamiento de triglicéridos en moscas R y amarillas blancas y en comparación con la concentración de proteínas de las moscas. El análisis estadístico reveló una interacción significativa entre el genotipo y el ejercicio que afecta el almacenamiento de triglicéridos. También hubo un efecto significativamente dimórfico sexual, ya que los machos almacenaron más triglicéridos que las hembras.

Las moscas hembras que hacían ejercicio tenían niveles de triglicéridos significativamente más bajos que sus contrapartes que no hacían ejercicio. Esto no se observó en los varones. A continuación, las moscas se criaron con dietas variables, se sometieron a un régimen de ejercicio y luego se probaron en un ensayo de geotaxis negativo similar a RING.

Las hembras subieron significativamente más cuando se criaron con una dieta alta en grasas que con cualquiera de los otros tratamientos. Para los hombres, el ejercicio solo mejoró la escalada cuando se criaron con una dieta normal. Una dieta alta en grasas no tuvo ningún efecto.

Curiosamente, hubo una disminución en el rendimiento de la escalada después del ejercicio para las mujeres de la línea DGRP 153 cuando se criaron con una dieta normal. Por lo tanto, el ejercicio puede no ser una intervención uniformemente positiva para todos los genotipos. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como los ensayos de glucosa en hemolinfa o los análisis de esperanza de vida, para evaluar el efecto del ejercicio sobre la diabetes tipo II o la longevidad.

Esta técnica permite a los investigadores en los campos de la genética y el metabolismo explorar el papel del ejercicio en el mantenimiento de la salud metabólica en el organismo modelo, Drosophila.