Remodelación de membrana de vesículas gigantes en respuesta a gradientes del Ion de calcio localizada

Presentamos una técnica para la manipulación de vesículas gigantes utilizando gradientes iónicos de calcio localizados. La principal ventaja de esta técnica es la estimulación totalmente sin contacto de la superficie de la vesícula y la visualización directa de la remodelación de la membrana lipídica tras la interacción con los iones de calcio. Nuestro enfoque introduce un medio para abordar los detalles de las interacciones de la membrana de iones de calcio, proporcionando nuevos lugares para estudiar los mecanismos de remodelación de la membrana celular tras cambios en el microambiente celular.

Para comenzar este procedimiento, prepare una solución de lípidos en cloroformo. La concentración final de lípidos en el cloroformo es de un miligramo por mililitro y la masa final es de 0,6 miligramos. Envuelva el frasco de vidrio que contiene la mezcla de lípidos con papel de aluminio para proteger el contenido de la luz ambiental.

Coloque el vial de muestra envuelto en papel de aluminio dentro de un vaso de precipitados de vidrio. Para eliminar el cloroformo, evapore el solvente en un evaporador rotativo durante tres horas con una presión que alcance los siete kilopascales de vacío a 80 rpm. Se forma una película lipídica seca en el fondo del vial de vidrio después de la evaporación.

Agregue lentamente 600 microlitros de solución salina tamponada con fosfato sobre la película lipídica seca. Después de la adición del tampón, agregue suavemente seis microlitros de glicerol para proteger la muestra de la deshidratación completa durante la formación de una vesícula unilamelar gigante conectada a una vesícula multilaminar, o GUV-MLV. Selle el frasco de vidrio con Parafilm.

Y cúbralo con papel de aluminio para protegerlo de la luz ambiental. Guarde el vial a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, sonicar el vial de vidrio que contiene la solución durante un minuto mediante un baño de ultrasonidos a temperatura ambiente.

Retire el Parafilm y pipetee hasta que se forme una solución visualmente uniforme de pequeñas vesículas lipídicas. Alícuota 30 microlitros de la pequeña solución de vesícula lipídica obtenida en tubos individuales de plástico de 0,5 mililitros. Descongele un tubo de plástico que contiene una alícuota de la suspensión congelada de pequeñas vesículas lipídicas a temperatura ambiente.

Agite el tubo cuatro veces durante uno o dos segundos usando un mezclador de vórtice a máxima velocidad. Coloque cinco microlitros de la pequeña suspensión de vesícula lipídica sobre la superficie de un cubreobjetos de vidrio para formar una gota pequeña y redonda. Utilice un cubreobjetos de vidrio sin ningún paso de limpieza previa.

Ahora, coloque el cubreobjetos de vidrio en un desecador al vacío durante 20 minutos. Guarde la película lipídica seca a temperatura ambiente durante cuatro minutos. A continuación, pipetee lentamente 50 microlitros de tampón HEPES de 10 milimolares sobre la película lipídica seca para la rehidratación.

Espere cinco minutos para realizar los complejos GUV-MLV. Centre un cubreobjetos de vidrio en la platina del microscopio. A continuación, pipetea 300 microlitros de tampón HEPES y coloca el centro de la gota por encima del objetivo.

Transfiera los 50 microlitros de la solución GUV-MLV preformada a la solución HEPES. Espere 25 minutos para permitir que los complejos GUV-MLV escasamente formados se adhieran firmemente a la superficie del cubreobjetos de vidrio. Redondee los bordes de los capilares de vidrio de borosilicato colocando suavemente los extremos capilares en la llama de una vela para evitar que la micropipeta se rompa mientras se conecta al soporte de la micropipeta.

Extraiga al menos tres capilares de vidrio con un extractor láser automático. Utilice los capilares de vidrio de borosilicato a los que se hace referencia en el texto para lograr una micropipeta con una abertura de punta de aproximadamente 0,3 micras de diámetro. Para evitar la obstrucción de la punta de la pipeta, filtre una solución de cloruro de calcio de cinco milimolares en una solución tampón HEPES utilizando un filtro de jeringa de 0,2 a 0,5 micras antes de usar.

A continuación, rellene cada micropipeta con ocho microlitros de la solución de cloruro de calcio utilizando un microcargador. Conecte un soporte de micropipeta a un micromanipulador. Monte la micropipeta en el soporte de la micropipeta de forma hermética.

A continuación, conecte la bomba de inyección y el soporte capilar mediante el tubo de alimentación. Después de poner en marcha la bomba de inyección, ajuste la configuración de la bomba de inyección a una presión de inyección de 20 hectopascales. También establezca una presión de compensación de cinco hectopascales.

Configure el microscopio en modo de campo claro. Configúrelo para el contraste de interferencia diferencial. Utilice el micromanipulador grueso para colocar la micropipeta sobre la gota que contiene los complejos GUV-MLV.

Coloque la punta de la micropipeta por encima del objetivo y baje la pipeta hasta la gota con el micromanipulador grueso. Ponga el microscopio en modo de fluorescencia. Coloque la punta de la micropipeta a una distancia de tres micras de la superficie de la membrana mientras inyecta la solución de cloruro de calcio de la micropipeta para permitir que se formen MTP.

Para trasladar el MTPS a lo largo de la superficie GUV, mueva lentamente la punta de la pipeta alrededor de la superficie GUV con el micromanipulador fino. Mantenga aproximadamente la misma distancia entre la superficie del GUV y la punta de la micropipeta mientras continúa con la inyección de iones de calcio. Para detener la microinyección, apague la bomba de inyección.

Aquí se muestra una imagen representativa de microscopía fluorescente de un complejo GUV-MLV inmovilizado en la superficie de un cubreobjetos de vidrio. En estas imágenes se pueden ver las protuberancias tubulares de la membrana generadas tras la inyección localizada de iones de calcio en la superficie del GUV. La traslación de la punta de la micropipeta alrededor de la superficie de la membrana, como lo indica la flecha, desencadena el movimiento de las protuberancias tubulares de la membrana en la dirección de la fuente de iones de calcio.

En resumen, proponemos una técnica que permite la remodelación sin contacto de vesículas lipídicas gigantes que resulta en la formación de protuberancias tubulares en la membrana tras la estimulación localizada con iones de calcio. Las aplicaciones futuras de este método incluyen la transición de vesículas lipídicas sintéticas a membranas biológicas nativas o la aplicación de este enfoque a sistemas poliméricos con el propósito de desarrollar plataformas de micromanipulación sin contacto.