Name: Rebanadas de cerebro-pituitaria sanas para las investigaciones electrofisiológicas de las células hipofisarias en peces teleósteos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Aprende a preparar rebanadas viables de cerebro-hipófisis en medaka (Oryzias latipes) para estudios electrofisiológicos con técnica de patch-clamp perforado. Este método permite analizar la actividad eléctrica de células hipofisarias en un contexto fisiológicamente relevante.

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Agradecemos a la Sra. LourdesCarreon G Tan por su ayuda en el mantenimiento de las instalaciones de medaka y Anthony Peltier para las Figuras ilustrativas. Este trabajo fue financiado por NMBU y por el Consejo de investigación de Noruega, números de concesión 244461 (programa de acuicultura) y 248828 (programa de Noruega vida Digital).

Manejo de los animales se realizan según las recomendaciones para el cuidado y bienestar de los animales de investigación en la Universidad Noruega de Ciencias de la vida y bajo la supervisión de investigadores autorizados.
1. preparación de instrumentos y soluciones
Nota: Todas las soluciones deben ser estériles. Debe prestarse atención cuidadosa para el pH y la osmolalidad (osmol/kg agua) de todas las soluciones, que debe ser cuidadosamente adaptada al ambiente extracelular de las especies estudiadas. pH y la osmolalidad deben ajustarse con precisión equipos electrónicos tales como medidor de pH y punto de congelación osmómetro respectivamente.
<ol><li>
Tomar 500 mL de la solución extracelular sin Ca2 + (Ca2 + CE libre): 150 mM NaCl, KCl, 1,3 mM MgCl2, de 5 mM glucosa de 4 mM, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>Disolver 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, a 61,89 mg de MgCl2, 360,32 mg de glucosa y 1,19 g de HEPES en 450 mL de alta pureza (0,055 uS / cm a 25 ° C, la resistividad de 18,2 megaohmios) H2O en un vaso de vidrio utilizando un agitador magnético.</li>
		<li>Ajustar el pH a 7.75 con NaOH.</li>
		<li>Transferir la solución a un matraz aforado de 500 mL. Llene el matraz aforado con ultrapura de H2O hasta 500 mL.</li>
		<li>Mezclar la solución antes de medir la osmolalidad. Ajuste a 290-300 mOsm con manitol. Filtro de esterilizar la solución mediante sistema de vacío de agua y filtro de 0,2 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tomar 500 mL de la solución extracelular (EC): 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, glucosa de 4 mM, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>Disolver 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, 147,01 mg de CaCl2, 61,89 mg de MgCl2, 360,32 mg de glucosa y 1,19 g de HEPES en 450 mL de ultrapura de H2O en un vaso de vidrio utilizando un agitador magnético.</li>
		<li>Ajustar el pH a 7.75 con NaOH.</li>
		<li>Transferir la solución a un matraz aforado de 500 mL. Llene el matraz aforado con ultrapura de H2O hasta 500 mL.</li>
		<li>Mezclar la solución antes de medir la osmolalidad. Ajuste a 290-300 mOsm con manitol. Filtro de esterilizar la solución mediante sistema de vacío de agua y filtro de 0,2 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tomar 500 mL de la solución extracelular con 0,1% de seroalbúmina bovina (CE-BSA): 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, glucosa de 4 mM, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>Disolver 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, 147,01 mg de CaCl2, 61,89 mg de MgCl2, 360,32 mg de glucosa y 1,19 g de HEPES en 450 mL de ultrapura de H2O en un vaso de vidrio utilizando un agitador magnético.</li>
		<li>Ajustar el pH a 7.75 con NaOH.</li>
		<li>Transferir la solución a un matraz aforado de 500 mL. Llene el matraz aforado con ultrapura de H2O hasta 500 mL.</li>
		<li>Mezclar la solución antes de medir la osmolalidad. Ajuste a 290-300 mOsm con manitol. Filtro de esterilizar la solución mediante sistema de vacío de agua y filtro de 0,2 μm. Agregar 50 mg de BSA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tomar 250 mL de solución intracelular (IC): 110 mM KOH, 20 mM KCl, 10 mM Hepes, sacarosa 20 mM.
	<ol>
<li>Disolver 1,54 g KOH, 327,75 mg de KCl, 595,75 mg de HEPES y 1,712 g de sacarosa en 450 mL de ultrapura de H2O en un vaso de vidrio utilizando un agitador magnético.</li>
		<li>Ajustar el pH a 7,2 con ácido sulfónico de (MES) (N-morfolino) etano.</li>
		<li>Transferir la solución a un matraz aforado de 250 mL. Llene el matraz aforado con ultrapura de H2O hasta 250 mL.</li>
		<li>Mezclar la solución antes de medir la osmolalidad. Ajuste a 280-290 mOsm (10 mOsm inferior CE) con sacarosa. Filtro de esterilizar la solución mediante sistema de vacío de agua y filtro de 0,2 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hacer 100 mL de solución de agarosa de fusión baja de 2% de BSA libre CE y Ca2 + (2 g de agarosa baja fusión en 100 mL de Ca2 + libre CE). Disolver usando el microondas y colocar la agarosa fundida en un baño de agua a 40 ° C. Deje que se enfríe hasta 40 ° C antes de su uso en los tejidos. Nota: EC, Ca2 + CE libre puede ser almacenada a 4 ° C durante varias semanas si estériles y soluciones IC a-20 ° C, durante varios meses. Agarosa se puede conservar durante una semana a 4 ° C y puede ser reutilizada 3 a 5 veces por microondas brevemente. Reutilización excesiva dará lugar a la evaporación y la alteración de la agarosa y la concentración de la sal y la calidad.</li>
	<li>
Hacen puente de agar:
	<ol>
<li>Calor de Capillares de vidrio de borosilicato largo de 7,5 mm con diámetro exterior (D.E.) de 2 mm y diámetro (I.D.) 1,16 mm utilizando un mechero Bunsen en un focal interior punto aproximadamente 1/3 de un extremo hasta que el cristal comienza a doblar. Retire el vaso de la llama y deje que el vidrio doblar con un ángulo de 120 grados (figura 2A).</li>
		<li>Derretir 2% agar en CE normal sin glucosa usando un microondas, y mientras la agarosa es líquido llenar el capilar mediante capilaridad de vidrio hecha de antemano las fuerzas por poner uno de los extremos del vidrio en el líquido y a la espera de algunos minutos. Tienda puentes hasta su uso a 4 ° C en CE sin glucosa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar vidrio de borosilicate con pipetas de parche de filamento utilizando un extractor de la pipeta adecuada. Consulte el manual de tirador de la pipeta para obtener la resistencia deseada del electrodo. Nota: La forma cónica de la pipeta debe ser tan corta como sea posible. Forma cónica corta pipeta se logra tirando pasos de 4 – 6. La resistencia del electrodo debe ser entre 2 y 6 MΩ dependiendo del tamaño de la célula.</li>
	<li>
Para evitar el movimiento del tejido durante los experimentos de patch-clamp cubra la superficie de la sala de grabación con 0.1% de polietilenimina (PEI) en solución tampón de borato.
	<ol>
<li>Preparar 500 mL de tampón de borato (25 mM):<ol>
<li>Disolver 4,768 g de Na2B4O710 H2O en 450 mL de ultrapura de H2O en un vaso de vidrio utilizando un agitador magnético.</li>
			<li>Ajustar el pH a 8.4 con HCl.</li>
			<li>Transferir la solución a un matraz aforado de 500 mL. Llene el matraz aforado con ultrapura de H2O hasta 500 mL y 0,2 μm filtro esterilización la solución mediante sistema de vacío de agua.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparar una solución stock de 1% de PEI (PEI de 50% 1 mL de tampón de borato de 25 mM mL 49) y una dilución de 0,1% PEI diluyendo 10 μl de solución stock de 1% en 100 μl de tampón de borato para uso final.</li>
		<li>Añadir 2 mL de 0.1% de PEI en el cristal del titular del sector y dejar la capa incubar durante 1 minuto. Luego brevemente lavar el vidrio dos veces con 5 mL de la poste-limpieza de H2O y deje secar hasta el uso al aire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparar soluciones de anfotericina B.
	<ol>
<li>Hacen 60 mg/mL solución stock disolviendo 3 mg de anfotericina B polvo en 50 μl dimetil sulfóxido (DMSO), en un tubo de 1 mL protegido de la luz. Vortex a máxima velocidad durante 30 s y someter a ultrasonidos durante 15 minutos homogeneizar. Guardar alícuotas en tubos de 3 a 5 a-20 ° C y utilizar una alícuota por día. Nota: Si la solución madre de anfotericina B no es claro y amarillo color pero lechoso (amarillo todavía) después de la sonicación de 15 – 20 minutos hace una nueva solución.</li>
		<li>Hacer solución de IC con la anfotericina B pipetear 2 mL de la IC en un vaso limpio de vidrio con más de 10 mL de capacidad. Añadir 8 μl de la solución madre de anfotericina B en la solución de la pipeta y mezclar mediante pipeteo. Envuelva el vaso con papel de aluminio y coloque en hielo hasta su utilización y renovarlo cada 3 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. disección y corte con Vibratome
<ol><li>Preparar las herramientas de disección antes de disección, incluyendo una fuerte y una pinza fuerte con unas tijeras. Limpiar las herramientas (soporte para papel higiénico, cepillo, pinzas) con etanol y asegúrese de que se utilizan solamente para los propósitos de la disección y nunca en contacto con los tejidos fijos. Guárdalos en una caja separada para evitar la contaminación.</li>
	<li>Eutanasia a los peces de agua fría de hielo durante 1 minuto.</li>
	<li>
Siga los pasos siguientes para disecar rápidamente el medaka cerebro y la hipófisis con pinzas afiladas (uso no más de 3 minutos).
	<ol>
<li>Mientras que sostiene el pescado con el fórceps fuerte severa los dos nervios ópticos detrás de los ojos con unas tijeras o pinzas de sharp.</li>
		<li>Abra la parte dorsal del cráneo desde la parte posterior hacia el anterior rompiendo los huesos del cráneo paso a paso con fuertes pinzas.</li>
		<li>Pele el cráneo por un lado con pinzas fuertes.</li>
		<li>Severa de la médula espinal con tijeras o pinzas afiladas.</li>
		<li>Suavemente, agarrar la médula espinal con el fórceps, voltear el cerebro de posterior a anterior y coloque en un plato con la helada Ca2 + gratis CE.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Llenar un molde de metal de 1,5 – 2 cm3 con agarosa líquida y coloque en el hielo.</li>
	<li>Justo antes de que la agarosa se solidifica (en alrededor de 25 – 30 ° C), suavemente agarra el cerebro por la médula espinal con el fórceps, secar las pinzas con un pedazo de papel fino y poner el tejido en la agarosa. Mezclar rápidamente la agarosa para diluir los rastros de la CE a la izquierda alrededor del tejido y orientar el tejido y dejar el molde en hielo durante unos segundos hasta que la agarosa se endurezca. Nota: Es esencial para este paso a ser rápido. La agarosa se solidifica rápidamente como el molde de metal es enfriado por el hielo.</li>
	<li>Recortar un bloque cuadrado de agarosa que contiene el tejido con una hoja de bisturí y goma en el soporte de espécimen de vibratome con pegamento (no tóxico) de la cirugía.</li>
	<li>Llene la cubeta de vibratome recibiendo las mordazas (cerebro-pituitaria) con helado Ca2 + libre EC.</li>
	<li>Coloque el soporte del espécimen en el vibratome y corte el bloque de agarosa para hacer secciones de parasagittal de 150 μm, usando alta frecuencia y la velocidad baja para el seccionamiento. Recopilar las secciones seleccionadas y colocarlas en la cámara de grabación de patch-clamp con 3 mL de helado Ca2 + gratis CE.</li>
	<li>Coloque el arpa de rejilla (figura 2B) en la sección del tejido. Nota: El arpa junto con la capa estabilizarán el tejido y evitar que se mueva durante las grabaciones de patch-clamp.</li>
	<li>Después de que el arpa está en su lugar, cambie el Ca2 + CE medio libre a la CE normal con Ca2 + y BSA. Deje que el resto de tejido por 10 min.</li>
</ol>3. perforado de Patch-clamp y las grabaciones electrofisiológicas
<ol><li>Antes de comenzar el experimento, de cloruro de plata alambre electrodos por los siguientes pasos: en primer lugar, utilice un papel de lija fino (p180) para limpiar los electrodos de alambre de plata. En segundo lugar, lave con 2 mL, etanol al 70%. En tercer lugar, sumergir los cables en 2 mL, 2 – 5% de cloro durante 10 minutos. Por último, lave con 2 mL, ultrapura H2O.</li>
	<li>La sala de grabación con la rebanada del cerebro-pituitaria en la platina del microscopio y localizar la zona de destino (pituitaria) con objetivo de 10 X e Inspeccione las células utilizando el objetivo 40 X. Nota: Si la preparación es correcta, muy pocas células redondas deben ser visibles. Estas células redondas son células generalmente dañadas que son desprendimiento del tejido.</li>
	<li>Coloque el electrodo de puesta a tierra a través del puente de agar al 2% en el baño de la EC.</li>
	<li>Localizar una célula sana utilizando el objetivo 40 X. Nota: Una célula sana debe ser firmemente unida a la rodaja de tejido y no redondeada y separada de la rebanada.</li>
	<li>Ajuste el amplificador en tensión-abrazadera (VC; Modo de punto 1 de la Figura 4A ). Abierto el sello prueba ventana y pulse Configuración de la bañera (Figura 4B los puntos 1 y 2. Utilizar un pulso de 5-mV para supervisar pipeta resistencia (punto 3 dela Figura 4B ).</li>
	<li>Rellene la punta de la pipeta de parche con el antimicótica solución gratuita de IC antes de agregar la solución de la IC con la anfotericina B utilizando una jeringa de micro relleno (ver figura 3).</li>
	<li>Añadir una presión ligeramente positiva en la pipeta patch usando jeringa de 1 mL. Nota: Esto hace que un pequeño flujo de líquido de la pipeta de parche que evite la contaminación de la punta.</li>
	<li>Una vez en el baño, evaluar la resistencia de la pipeta de parche y asegúrese de que ninguna partícula se une a la punta de la pipeta (figura 4). Nota: Se adjunta un pequeño trozo de cinta en el monitor mostrando la forma de grabación de vídeo del campo de visión. Esto hace que la colocación de la pipeta del parche en relación con la célula más fácil cuando el objetivo no se centra en la célula.</li>
	<li>Guía de la pipeta del parche hacia la célula utilizando micromanipuladores. Nota: Asegúrese de que la pipeta esté limpia buscando pequeñas partículas que puedan haber conectado a la punta de la pipeta. Cambios bruscos en la resistencia también pueden ser el resultado de partículas en la punta de la pipeta.</li>
	<li>Reajustar la pipeta cuando unos pocos micrones sobre la célula para que la punta de la pipeta toque la celda 1/3 desde el centro de la célula, como se muestra en la figura 5. Al tocar la celda, libere la presión y aplica una succión suave para hacer un sello. Nota: El tiempo de la pipeta de parche entra en el baño a un acertado sello debe ser lo más corto posible. No más de 1 – 1,5 min para evitar llegar a la punta de la pipeta y fugas en el baño de la anfotericina B.</li>
	<li>Inmediatamente cambie a la ventana de parche en el software de patch-clamp (punto 1 de lafigura 4 D ) y tienen un potencial de explotación entre-50 y -60 mV (punto 2 de lafigura 4 ). Cero fuera la capacitancia rápida hecho por la pipeta de vidrio (punto 3 de lafigura 4 ).</li>
	<li>Cambiar a la ventana de la celda en software de patch-clamp (figura 4E los puntos 1 y 2) y comenzar el monitoreo de la resistencia de acceso, Ra, aparece en la ventana. Cero a la capacitancia de la membrana en el software de amplificador (figura 4E punto 3) acceso suficiente. Nota: Acceso suficiente puede tomar de 10 a 30 min (figura 4E punto 2). Un buen acceso para las grabaciones de abrazadera actual debe estar por debajo de 20 M.</li>
	<li>Cambiar a mordaza corriente, IC, en la ventana del software amplificador (figura 4F punto 1). Ajustar las corrientes de rápido-capacitivo en la ventana - abrazadera del software amplificador (figura 4F puntos 2 y 3) con el mismo valor como en 3.12. Comprobar el potencial de la membrana (figura 4F punto 1). Nota: Lo importante es que, si el potencial de membrana es poco profunda (típicos por encima de -35 mV) el celular se ha dañado. Cancelar el registro y encontrar una nueva célula.</li>
	<li>Después de encontrar una célula sana (unida firmemente al tejido con membrana potencial por debajo de -40 mV), comenzar las grabaciones experimentales como se detalla en protocolo 33,34 el fabricante.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

Las grabaciones electrofisiológicas mediante la técnica de patch-clamp en rebanadas de cerebro-pituitaria requieren cuidadosa optimización. Protocolos bien optimizados para llevar a cabo las investigaciones de células vivas en teleósteos se limitan, con la mayoría de publicaciones utilizando protocolos basados en sistemas mamíferos. En este sentido, es importante ser consciente del hecho de que varios parámetros fisiológicos como pH y la osmolalidad son no sólo las especies dependientes, pero también mucho depende de si ...

La hipófisis es un órgano endocrino clave en vertebrados situados debajo del hipotálamo y posteriores al quiasma óptico. Produce y secreta hormonas de seis a ocho de los tipos celulares específicos. Hormonas hipofisarias constituyen un intermedio entre el cerebro y los órganos periféricos y manejar una amplia gama de procesos fisiológicos esenciales, incluyendo el crecimiento, la reproducción y la regulación de la homeostasis. Similar a las neuronas, las células endocrinas de la hipófisis son eléctricamente excitables con capacidad para disparar potenciales de acción espontáneamente 1. El papel de estos potenciales de acción es dependiente de la célula. En varios tipos celulares de la hipófisis mamífero, potenciales de acción pueden elevar el Ca intracelular2 + suficientemente para una liberación sostenida de hormonas 2. Además, la hipófisis recibe información tanto estimulante como inhibitoria en el cerebro que afecta el potencial de membrana de las células 3,4,5,6. Por lo general, entrada estimulante aumenta la excitabilidad y a menudo implica la liberación de Ca2 + de los almacenes intracelulares así como mayor frecuencia 7de disparo. Entendimiento de cómo la célula utiliza la composición de la canal de ion y se adapta a estas señales de entrada en el cerebro es clave para la síntesis de la hormona de comprensión y liberación.
La técnica de patch-clamp fue desarrollada a finales de 1970 por Sakmann y Neher 8,9,10 y mejorada por Hamill 11y permite investigaciones detalladas de las propiedades electrofisiológicas de las células hasta canales de iones individuales. Por otra parte, la técnica puede utilizarse para el estudio de corriente y voltaje. Hoy en día, parche-es el estándar de oro para la medición de las propiedades electrofisiológicas de la célula. Cuatro configuraciones principales de la técnica de patch-clamp de cierre hermético han sido desarrollado 11; la célula adjunta, dentro, la exterior y el parche de células completas. Las tres primeras configuraciones se utilizan típicamente para las investigaciones de canal de iones individuales. Para el cuarto, después de la configuración de conexión de celda, un agujero en la membrana celular se realiza mediante presión sub-atmosférica. Esta configuración también permite que las investigaciones de la composición de la canal de ion de la célula entera 12. Sin embargo, una limitación de esta técnica es que moléculas citoplásmicas se diluyen por el parche pipeta solución 13 (figura 1A), pues afecta las respuestas eléctricas y fisiológicas de las células estudiadas. De hecho, algunas de esas moléculas pueden jugar papeles importantes en la transducción de la señal o en la regulación de canales iónicos diferentes. Para evitar esto, Lindau y Fernandez 14 desarrolló un método donde se agrega un compuesto formando poros a la pipeta del parche. Tras la configuración de conexión de celular, el compuesto se incorporan en la membrana de plasma bajo el parche y lentamente perfore la membrana creando contacto eléctrico con el citosol (figura 1B). Pueden utilizar varios diferentes antifúngicos como la nistatina y la anfotericina B 15 16o surfactantes como la saponina beta-escina 17,18 . Estos compuestos crean poros lo suficientemente grandes como para permitir que los cationes monovalentes y Cl– difusión entre el citosol y la pipeta patch conservando los niveles citosólicas de macromoléculas y los iones más grandes como Ca2 + 15, 16.
El reto de usar parche perforado es la resistencia serie potencialmente alto. Resistencia en serie (Rs) o acceso de resistencia es la resistencia combinada sobre la pipeta patch concerniente a la tierra. Durante las grabaciones de la abrazadera del remiendo, Rs estará en paralelo con la resistencia de la membrana (Rm). Rm y Rs en trabajo paralelo como un divisor de tensión. Con la alta Rs, la tensión caerá sobre la Rs dando errores en las grabaciones. El error será mayor con las corrientes más grandes registradas. Además, el divisor del voltaje también es frecuencia dependiente creando un filtro de paso bajo, afectando así a la resolución temporal. En efecto, el parche perforado no siempre permiten grabaciones de grandes y rápidas corrientes como el voltaje bloqueado las corrientes Na+ (para lecturas detalladas ver referencia 19). También, Rs puede variar durante la grabaciones de la abrazadera del remiendo, otra vez conduce a cambios en la corriente registrada. Así, pueden ocurrir falsos positivos en situaciones donde Rs cambia durante el uso de la droga.
La electrofisiología en el tejido en rodajas se introdujo por el laboratorio de Andersen para estudiar características electrofisiológicas de las neuronas en el cerebro de 20. La técnica allanó el camino para investigaciones detalladas de las células así como circuitos comunicaciones y celular de la célula en un ambiente más intacto. Una técnica similar para hacer rebanadas de hipófisis fue introducida en 1998 por Guérineau et al. 21. sin embargo, no fue antes de 2005, que la preparación de corte de cerebro-pituitaria fue utilizada con éxito para estudios de patch-clamp en teleósteos 22. En este estudio, los autores también informaron el uso de grabaciones de la abrazadera del remiendo perforada. Sin embargo, en gran medida, la mayoría de las investigaciones electrofisiológicas de las células hipofisarias se han realizado en mamíferos y sólo un puñado de otros vertebrados, incluyendo peces teleósteos 1,2,22,23 . En teleósteos, casi todos los estudios fueron realizados en las células disociadas primarias 24,25,26,27,28,29,30 .
En el presente artículo, esbozamos un protocolo optimizado para la preparación de saludables rebanadas de cerebro-pituitaria de la medaka de pescado modelo. El enfoque representa varias ventajas en comparación con cultivos primarios de células disociadas. En primer lugar, las células se guardan en un medio ambiente relativamente preservado frente a disociarse de las condiciones de cultivo celular. En segundo lugar, preparaciones de corte nos permiten estudiar vías indirectas mediadas por célula comunicación 22, que no es posible en condiciones de cultivo de células disociadas. Además, demostramos cómo llevar a cabo las grabaciones electrofisiológicas en los cortes de tejido obtenidos usando la técnica del perforado celulares-abrazadera del remiendo con la anfotericina B como agente de formación de poro.
Medaka es un pequeño pez de agua dulce originario de Asia, se encuentran principalmente en Japón. La fisiología, la embriología y la genética de medaka se ha estudiado ampliamente por más de 100 años 31, y es un modelo de investigación utilizado en muchos laboratorios. De particular importancia para este trabajo es la distinta organización morfológica del complejo hipotálamo-hipofisario en los peces teleósteos: mientras que en mamíferos y aves las neuronas hipotalámicas suelte sus neuro-las hormonas que regulan las células endocrinas hipófisis en el sistema del portal de la eminencia media, hay una directa proyección nerviosa de las neuronas hipotalámicas en las células endocrinas de la hipófisis en los peces teleósteos 32. Así, cortar cuidadosamente realizados de cerebro-pituitaria es de particular importancia en los peces, lo que nos permite investigar características electrofisiológicas de las células hipofisarias en una bien conservada red de cerebro-pituitaria y las células de la pituitarias en particular cómo control de la excitabilidad y de tal modo homeostasis de Ca2 + .

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td> Pegamento quirúrgico WPI VETBOND 3M Vetbond Adhesivo para tejidos Cuchillas de acero inoxidable Campden Instruments 752-1-SS moldes <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>metálicos</td><td>SAKURA</td><td>4122</td><td></td></tr><tr><td>arpa de acero</td><td>Warner instruments</td><td>64-1417</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> PBS SIGMA D8537 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de parche ultrapuras LMP</td><td>agarosa invitrogen</td><td>166520-100</td><td></td></tr><tr><td>Sutter</td><td>Instrument</td><td>BF150-110-10HP</td><td>Borosilicato con filamento Diámetro exterior:1,5 mm, diámetro interior:1,10 mm</td></tr><tr><td>Microscopio Slicescope Scientifica</td><td></td><td>pro6000</td><td></td></tr><tr><td>P-Clamp10</td><td>Molecular Devices</td><td>#1-2500-0180</td><td></td></tr><tr><td>software Digitalizador Digidata 1550A1</td><td>Molecular Devices</td><td>DD1550</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador Multiclap 700B Headstage CV-7B</td><td>Molecular Devices</td><td>1-CV-7B</td><td></td></tr><tr><td></td><td>GnRH Bachem</td><td>4108604</td><td>H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH Sal de trifluoroacetato&nbsp;</td></tr><tr><td>extractor de pipetas</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>anfotericina B</td><td>SIGMA</td><td>A9528</td><td>antibiótico formador de poros</td></tr><tr><td>polietilenimina&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>P3143</td> Jeringa de microfilete en <td>solución 50% PEI</td></tr><tr><td></td><td></td><td>WPI MF28/g67-5</td><td></td></tr><tr><td>vidrio para el puente de agar</td><td>Instrumento</td><td>Sutter BF200-116-15</td><td>Borosilicato con filamento Diámetro exterior: 2,0 mm, diámetro interior: 1,16 mm Pulido al fuego</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td> Micro-Manager <td>Software de microscopía de código abierto</td></tr><tr><td>Cámara optiMOS sCMOS</td><td>Qimaging</td><td>&nbsp; 01-OPTIMOS-R-M-16-C</td><td></td></tr><tr><td>sonicador</td><td>Elma</td><td>D-7700 singen</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SiGMA</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SiGMA</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>SiGMA</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosa</td><td>SiGMA</td><td>G5400</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>SiGMA</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SiGMA</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>SiGMA</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>D-manitol</td><td>SiGMA</td><td>63565</td><td></td></tr><tr><td>MES-ácido</td><td>SIGMA</td><td>M0895</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA</td><td>A2153</td><td></td></tr></tbody></table>

rebanadas de cerebro-pituitaria sanas para las investigaciones electrofisiológicas de las células hipofisarias en peces teleósteos

Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

Se han realizado investigaciones electrofisiológicas de las células hipofisarias en numerosas especies de vertebrados, pero muy pocos en peces teleósteos. Entre éstos, la mayoría clara se han realizado en células disociadas de primarias. Para mejorar nuestra comprensión de las células hipofisarias como teleósteos, se comportan en un medio ambiente biológicamente más relevante, este protocolo muestra cómo preparar rebanadas de cerebro-pituitaria viables utilizando el medaka (Oryzias latipes) de pequeños peces de agua dulce. Hacer las rebanadas de cerebro-pituitaria, pH y la osmolalidad de las soluciones se ajustaron a valores que se encuentran en los fluidos corporales de peces de agua dulce viven en 25 a 28 ° C. Tras la preparación de la rebanada, el protocolo muestra cómo llevar a cabo las grabaciones electrofisiológicas usando la técnica del perforado celulares-abrazadera del remiendo. La técnica de patch-clamp es una potente herramienta con resolución temporal sin precedentes y la sensibilidad, permitiendo la investigación de las propiedades eléctricas de las células intactas todo hasta canales de iones individuales. Parche perforado es el único que mantiene el medio intracelular intacto impide elementos reguladores en el citosol se diluye por la solución de electrodo pipeta patch. En cambio, cuando se realizan grabaciones de celulares tradicionales, se observó que las células pituitarias medaka pierden rápidamente su capacidad para disparar potenciales de acción. Entre las diferentes técnicas de perforación disponibles, este protocolo muestra cómo lograr la perforación de la membrana parcheada con el fungicida anfotericina B.

Este protocolo muestra un protocolo paso a paso de cómo lograr confiables grabaciones electrofisiológicas de las células de la pituitaria (gonadotrope), utilizando una línea transgénica de medaka [Tg (lhb- hrGfpII)] donde el objetivo de las células (productoras de Lh gonadotropes) están marcados con proteína verde fluorescente (GFP).
Inicialmente, se llevaron a cabo las investigaciones electrofisiológicas con configurac...

El artículo describe un protocolo optimizado para hacer rebanadas de tejido viable del cerebro-pituitaria, mediante el medaka (Oryzias latipes), de peces teleósteos y después las grabaciones electrofisiológicas de las células hipofisarias mediante la técnica de patch-clamp con la configuración de parche perforado.

Rebanadas de cerebro-pituitaria sanas para las investigaciones electrofisiológicas de las células hipofisarias en peces teleósteos

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neuroendocrinología. Por ejemplo, ¿cómo se comunican las células pituitarias y responden al factor de liberación del cerebro? La principal ventaja de esta técnica es que, en comparación con este primer cultivo celular primario, este procedimiento permite la investigación de células en un entorno más intacto.Aunque este método puede proporcionar información sobre las propiedades eléctricas de las células productoras de hormona luteinizante en Medaka. Con solo pequeños ajustes, también se puede usar para otros tipos de células o para otras especies de peces. Mientras sostiene un pez teleósteo sacrificado con pinzas fuertes esterilizadas con etanol bajo un microscopio de disección, corte los dos nervios ópticos detrás de los ojos con pinzas afiladas y rompa los huesos del cráneo desde el lado posterior hasta el anterior.Use las pinzas para despegar el cráneo y cortar la médula espinal. Agarrando suavemente la médula espinal con las pinzas, voltee el cerebro de la orientación posterior a la anterior y coloque el órgano en un plato lleno de medio extra celular helado, libre de calcio. A continuación, llene un soporte de metal de un punto cinco a dos centímetros cúbicos con agarosa líquida y coloque el molde en hielo.Justo antes de que la agarosa se solidifique, use las pinzas para levantar suavemente el cerebro por la médula espinal, seque las pinzas con un pedazo de papel de laboratorio y coloque el cerebro en la agarosa. A continuación, mezcle rápidamente la agarosa para diluir cualquier rastro de medio extracelular que quede en el tejido y ajuste la orientación del cerebro dentro del molde según sea necesario. Cuando la agarosa se haya solidificado, use una hoja de bisturí para recortar un bloque cuadrado de agarosa alrededor del tejido y use pegamento quirúrgico para unir la muestra a un soporte de muestra de vibratomo.Llene la cubeta del soporte del vibrátomo con medio extracelular helado y libre de calcio y coloque el soporte en el vibrátomo. Usando una alta frecuencia y una velocidad baja, corte el bloque de agarosa para hacer secciones parasagitales de 150 micrómetros, colocando la sección seleccionada en las cámaras de registro de patch-clamp que contienen tres mililitros de solución extracelular helada y libre de calcio. Es importante moverse rápidamente una vez que el cerebro se ha agregado a la agarosa, ya que el tejido se secará si se deja en la agarosa moldeada durante demasiado tiempo y tiene un acceso limitado al aire antes de seccionarla.Cuando se hayan obtenido todas las secciones, coloque un arpa de rejilla en la sección de tejido y reemplace el medio extracelular libre de calcio con medio extracelular que contenga calcio suplementado con albúmina sérica bovina. A continuación, deje reposar el pañuelo durante 10 minutos. Para configurar la pinza de parche, coloque la cámara de registro con el corte de la hipófisis cerebral en la platina del microscopio de registro de pinza de parche y use el objetivo 10X para ubicar la glándula pituitaria.Coloque el electrodo de puesta a tierra a través del puente de agar al 2% en el baño de medio extra celular y use el objetivo 40X para localizar una célula sana. Configure el amplificador en modo de pinza de voltaje y abra la ventana de prueba de sello. Seleccione la configuración del baño y utilice un pulso de cinco milivoltios para controlar la resistencia de la pipeta.Rellene la punta de la pipeta de parche con medio intracelular libre de antifúngicos antes de usar una jeringa de microrelleno para agregar solución intracelular suplementada con anfotericina B a la sección posterior de la pipeta de parche. Utilice una jeringa de un mililitro para añadir una presión de aire ligeramente positiva en la pipeta de parche para evitar la contaminación de la punta de la pipeta y evaluar la resistencia de la pipeta de parche. Si no hay partículas adheridas a la punta de la pipeta, utilice los micromanipuladores para guiar la pipeta de parche hasta la célula.Reajuste la pipeta cuando esté unas pocas micras por encima de la célula para que la punta de la pipeta toque la célula a un tercio de la distancia del centro de la célula. Para tocar la celda, libere la presión y aplique una succión suave para hacer un sello. Es esencial aplicar el gigaseal rápidamente, ya que la presión positiva dentro de la pipeta de parche provocará una fuga de solución antifúngica después de aproximadamente un minuto, dañando las células.Cuando el sello esté en su lugar, cambie inmediatamente a la ventana de parche en el software de fijación de parche y ajuste el potencial de retención entre menos 50 y menos 60 milivoltios. Ponga a cero la capacitancia rápida compuesta por la pipeta de vidrio y cambie a la ventana de la celda para comenzar a monitorear la resistencia de acceso, poniendo a cero la capacitancia de la membrana en el software del amplificador después de un acceso suficiente. Cambie a la pinza amperimétrica y ajuste el valor correcto de las corrientes capacitivas rápidas de la pipeta en la ventana I-Clamp, y compruebe el potencial de membrana resultante.Luego, con la celda firmemente unida a un tejido con un potencial de membrana inferior a 40 milivoltios negativos, comience las grabaciones experimentales de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los potenciales de acción pueden desencadenarse en un subconjunto de células pituitarias utilizando inyecciones de corriente de cinco a nueve picoamperios a partir de un potencial en reposo entre 50 y 60 milivoltios negativos. Estos potenciales de acción tienen una rápida disminución y después de unos cuatro a seis minutos, los potenciales de acción activados ya no son alcanzables.Al cambiar a la configuración de parche perforado con anfotericina B, se pueden observar potenciales de acción espontáneos en aproximadamente el 50% de las células registradas y los potenciales de acción se pueden activar en el 95% de estas células sin que se observe una disminución, incluso después de hasta una hora de registros. La hormona liberadora de gonadotropina uno, la inhalación expulsada sobre las células en la configuración de parche perforado revela una respuesta bifásica, durante la cual las células están hiperpolarizadas en la primera fase de la respuesta, lo que resulta en la liberación de calcio de las reservas internas seguida de la despolarización de las células y un aumento de la frecuencia de disparo del potencial de acción de uno a dos hercios a tres hercios en la segunda fase. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que todas las soluciones deben adaptarse a la fisiología del organismo experimental que está utilizando, en este caso, Medaka, y debe prestar especial atención al pH, ya que este valor varía entre las especies que viven a diferentes temperaturas.

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Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

Utilizamos la técnica de patch-clamp para medir GABA-activa de un solo canal corrientes (GABAA canales, los receptores GABA A) y las corrientes sinápticas y tónico que generan en las neuronas. La activación de los canales disminuye la excitabilidad neuronal en la salud y la...

GABA corrientes activadas de un solo canal y Tonic en rodajas de cerebro de rata

A continuación se describe un protocolo para la preparación de agar-incrustados trozos de retina que son adecuados para la electrofisiología y la Ca2 + imágenes. Este método permite estudiar la cinta del tipo de sinapsis en la retina utilizando microcircuitos directa patch-clamp grabaciones de una sola terminales nerviosas presinápticas.

Patch-clamp mediciones de capacitancia y Ca 2 + Imágenes en las terminaciones nerviosas individuales en rebanadas de retina

En este video, vamos a demostrar cómo registrar la actividad eléctrica de las neuronas individuales identificadas en una preparación de todo el cerebro, que preserva los circuitos neuronales complejas. Utilizamos los peces transgénicos en los que las neuronas de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) etiquetados genéticamente con una proteína fluorescente para la identificación en la preparación cerebro intacto.

Registro de la actividad eléctrica de las neuronas identificadas en el cerebro intacto de peces transgénicos

Se describen procedimientos para realizar registros simultáneos del potencial o corriente de membrana y los cambios en la concentración de calcio intracelular. Las neuronas del núcleo supraquiasmático se llenan con el indicador de calcio bis-fura-2 mediante un electrodo de pinza de parche en la configuración de pinza de parche de toda la célula.

Registro electrofisiológico simultáneo e imágenes de calcio de neuronas del núcleo supraquiasmático

Este artículo describe cómo un pez cebra adulto se puede inmovilizar, intubado, y se utiliza para in vivo experimentos electrofisiológicos para permitir grabaciones y la manipulación de la actividad neuronal en un animal intacto.

Registro electrofisiológico en el cerebro del pez cebra adultos Intacto

Aquí se describe un protocolo para preparar y mantener cultivos primarios de células hipofisarias de medaka (Oryzias latipes). Las condiciones optimizadas en este protocolo consideren parámetros importantes como la temperatura, osmolaridad y pH imitando las condiciones fisiológicas de los peces, permitiendo resultados fisiológico más significativos.

Preparación de un cultivo de alta calidad primaria celular de peces Pituitaries

Aquí, presentamos protocolos para la preparación de rebanadas cerebrales agudas que contienen el núcleo de geniculado lateral y la investigación electrofisiológica de la función de sinapsis retinogénica y corticogénica. Este protocolo proporciona una manera eficiente de estudiar las sinapsis con la probabilidad de alta y baja liberación en las mismas rebanadas cerebrales agudas.

Investigaciones electrofisiológicas de la función de sinapsis de retinogeniculato y corticogeniculato

El artículo describe un protocolo rápido para etiquetar los vasos sanguíneos en un pez teleósteo por perfusión cardíaca de DII diluido en fijador, usando medaka (Oryzias latipes) como modelo y centrándose en el cerebro y el tejido pituitario.

Etiquetado de los vasos sanguíneos en el cerebro Teleost y la hipófisis usando perfusión cardíaca con un-fijador DiI

Se presenta una novedosa técnica inalámbrica para registrar señales neuronales extracelulares del cerebro de la natación libre de peces dorados. El dispositivo de grabación se compone de dos tetrodes, un microdrive, un registrador de datos neuronales y una caja impermeable. Todas las piezas están hechas a medida, excepto el registrador de datos y su conector.

Grabación electrofisiológica inalámbrica de las neuronas por tetrodes móviles en la natación libre de peces

El protocolo presentado describe el transporte y la preparación del tejido hipocampal humano resecado con el objetivo final de utilizar las rebanadas cerebrales vitales como una herramienta de evaluación preclínica para posibles sustancias antiepilépticas.

Preparación de rebanadas agudas de hipocampo humano para grabaciones electrofisiológicas

Aprende a preparar rebanadas viables de cerebro-hipófisis en medaka (Oryzias latipes) para estudios electrofisiológicos con técnica de patch-clamp perforado. Este método permite analizar la actividad eléctrica de células hipofisarias en un contexto fisiológicamente relevante.

Rebanadas de cerebro-pituitaria sanas para las investigaciones electrofisiológicas de las células hipofisarias en peces teleósteos (Video) | JoVE Journal

Rebanadas de cerebro-pituitaria sanas para las investigaciones electrofisiológicas de las células hipofisarias en peces teleósteos

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