Diferenciación, mantenimiento y análisis de células del epitelio pigmentario de la retina humana: un modelo de enfermedad en un plato para las mutaciones BEST1

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades de la retina relacionadas con los canales iónicos sobre los mecanismos moleculares de las mutaciones de BEST1 y la patología de las bestrofinopatías. La principal ventaja de esta técnica es que evita la dificultad de obtener directamente células EPR de humanos. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de las bestrofinopatías, incluida la enfermedad de Best, ya que las células EPR se pueden utilizar tanto con fines de investigación como para terapias de reemplazo celular.

Cuando el cultivo de hPSC alcance la confluencia, reemplace el medio de cultivo con cuatro mililitros de medio de diferenciación por pocillo de una placa de seis pocillos. Después de dos semanas de cultivo, suplementar el medio de diferenciación con 100 nanogramos por mililitro de activina-A humana, cambiando el medio suplementado tres veces por semana durante otros 14 días. El día 29, cambie a un medio de diferenciación no suplementado durante otras ocho a 10 semanas hasta que aparezcan grupos de células RPE pigmentadas.

Para aislar las células pigmentadas del EPR, primero sostenga las pipetas Pasteur de vidrio individuales de nueve pulgadas horizontalmente sobre la llama de un mechero Bunsen, aproximadamente dos tercios a lo largo de la parte delgada de la pipeta. Cuando el vidrio calentado se ablande, separe rápidamente los dos extremos para formar una punta similar a un microraspador en el nuevo extremo de la pipeta. Rocíe las pipetas extraídas con etanol al 70% y déjelas secar al aire en una campana de cultivo celular.

Cuando las pipetas estén listas, lavar cada pocillo del cultivo de diferenciación con PBS y añadir un mililitro de tripsina al 0,05% suplementado con una unidad por microlitro de colagenasa a cada pocillo. Después de 20 a 30 minutos a 37 grados Celsius, detenga la digestión con dos mililitros de medio RPE de 37 grados Celsius por pocillo de una placa de seis pocillos y coloque la placa en una platina de microscopio. Con una pipeta extraída, golpee suavemente los grupos de EPR pigmentados.

Tan pronto como las células se desprendan del fondo del pocillo, utilice una micropipeta de 20 microlitros para transferir las células disociadas a pocillos individuales de una nueva placa de cultivo celular que contenga medio EPR. Cuando se hayan añadido aproximadamente 5.000 células de EPR a cada pocillo de una placa de 12 pocillos, se debe elevar el volumen final a dos mililitros con medio de EPR fresco y cultivar las células de EPR-HPE-aisladas durante otras seis a ocho semanas hasta que se observe una monocapa de células EPR maduras pigmentadas y en forma de adoquín. De 24 a 72 horas antes de la pinza del parche, lave las células monocapa pigmentadas con dos mililitros de PBS, luego, después de eliminar el PBS, agregue un mililitro de tripsina al 0,05% más una unidad por microlitro de colagenasa a las células en cada pocillo de una placa de 12 pocillos durante un período de incubación de ocho minutos a 37 grados Celsius.

Cuando las células comiencen a desprenderse, use una micropipeta de un mililitro para lavar suavemente las células del fondo del pocillo y agrupar la suspensión celular en un tubo cónico de 15 mililitros. Agregue un mililitro de solución de tripsina-colagenasa a 37 grados centígrados al pozo. Incube durante otros ocho minutos a 37 grados centígrados, luego lave las células restantes del fondo del pocillo y combine la suspensión celular en el mismo tubo cónico de 15 mililitros.

Incube las células dentro de un baño seco a 37 grados centígrados durante ocho minutos, luego use una micropipeta de un mililitro para triturar suavemente las células de 10 a 15 veces. Después de incubar y triturar las células dos veces más, agregue cinco mililitros de medio RPE de 37 grados Celsius a la suspensión unicelular y granule las células por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en el volumen adecuado para la siembra en placas prerrevestidas con cubreobjetos de 10 a 20% de confluencia y realice la fijación de parches de celda completa de acuerdo con los protocolos estándar.

Después de un aislamiento exitoso, más del 90% de las células en la población de pasaje cero deben madurar para mostrar la morfología celular RPE característica. Con el enfoque de enfermedad en placa basado en hPSC-RPE, cada mutación BEST1 específica del paciente se puede caracterizar de manera integral por su expresión de proteínas, tráfico de membrana y función de canal iónico para obtener información crítica para dilucidar los mecanismos patológicos del EPR. Hay que tener en cuenta que algunas mutaciones de BEST1 podrían afectar a su expresión proteica, por lo que también se deben comprobar otros marcadores de EPR bien establecidos.

La diferenciación de las células madre pluripotentes humanas del EPR tarda de tres a seis meses, dependiendo de la línea de células madre pluripotentes humanas y del tipo de mutación, y el aislamiento de las células pluripotentes humanas diferenciadas puede completarse en dos horas si se realiza correctamente. Al intentar dividir las células para la pinza de parche, es importante recordar triturar las células muy suavemente para evitar la muerte celular excesiva. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el cultivo celular de EPR en 3D, para responder preguntas adicionales sobre cómo el transporte de iones en las membranas apical y basal de las células EPR se ve afectado por las mutaciones de BEST1.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las enfermedades degenerativas de la retina exploraran los fenotipos fisiológicos y los mecanismos patológicos de las células EPR derivadas de los pacientes. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo diferenciar las células madre pluripotentes en células del epitelio pigmentario de la retina y preparar las células del EPR para la pinza del parche de células completas.