Name: Montaje rápido, escalable y la carga de proteínas bioactivas y los inmunoestimulantes en diversos Nanocarriers sintético vía Flash Nanoprecipitation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Aprende a fabricar sistemas avanzados de liberación de fármacos mediante nanoprecipitación flash, una técnica escalable que permite cargar proteínas bioactivas e inmunoestimulantes en nanocarriers sintéticos con baja polidispersidad.

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Reconocemos instrumentación y personal de apoyan de la instalación de biología estructural en la Universidad de Northwestern. Se reconoce el apoyo de la derecha Lurie integral cáncer centro de la Universidad Northwestern y la instalaciones de la Universidad noroeste de biología estructural. El detector de electrones directo de Gatan K2 fue comprado con fondos proporcionados por el consorcio biomédico de Chicago con el apoyo de los fondos de Searle en el Chicago Community Trust. También agradecemos a las siguientes instalaciones en Universidad del noroeste: el centro de ciencia de superficie interdisciplinario Keck, la instalación de biología estructural, la instalación de la proyección de imagen biológica, centro de imagen Molecular avanzada y el análisis Bionanomedicina equipo núcleo. Esta investigación fue apoyada por la beca de la Fundación Nacional de Ciencias 1453576, Director de los institutos de salud nacional Premio innovador nuevo 1DP2HL132390-01, centro para la concesión de catalizador de nanomedicina regenerativa y el 2014 McCormick catalizador premio. SDA fue apoyado en parte por NIH predoctoral biotecnología formación Grant T32GM008449.

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<li>Gindy, M. E., Panagiotopoulos, A. Z., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composite+block+copolymer+stabilized+nanoparticles%3A+simultaneous+encapsulation+of+organic+actives+and+inorganic+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Composite block copolymer stabilized nanoparticles: simultaneous encapsulation of organic actives and inorganic nanostructures.</a> Langmuir. 24 (1), 83-90 (2008).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Hemos incluido instrucciones detalladas para la fabricación rápida de polymersomes usando PEG17-bl- PPS35-SH como el copolímero del diblock. Polymersomes vesiculares son la morfología total primaria montada en esta relación de PEG hidrofílica e hidrofóbico PPS bloque molecular peso. Cuando afectado varias veces, tienen un diámetro y polidispersidad que polymersomes sacada a través de una membrana nm 200 después de ser formado por hidratación de película delgada. Este protocolo elim...

Nanocarriers permiten la liberación controlada de carga pequeña y macromolecular, incluya entidades activas, que si no encapsulado, sería altamente degradable o demasiado hidrofóbico para administración en vivo. De las morfologías nanocarrier regularmente fabricadas, vesículas poliméricas análogas a liposomas (también llamados polymersomes) ofrecen la posibilidad de cargar simultáneamente hidrofílicos e hidrofóbicos carga1,2. A pesar de sus ventajas prometedoras polymersomes son todavía raros en aplicaciones clínicas debido, en parte, a varios retos en su fabricación. Para uso clínico, polymersome formulaciones deben ser en lotes a gran escala, estériles y consistentes.
Un número de técnicas puede utilizarse para forma polymersomes de un copolímero del diblock, tales como poly(ethylene glycol) -bloque-poli (sulfuro de propileno) (PEG -bl- PPS), que incluyen dispersión solvente3, película delgada rehidratación1 , 4, 5,de microfluídica6e hidratación directa7. Solvente dispersión implica tiempos de incubación en presencia de solventes orgánicos, que puedan desnaturalizar algunas cargas bioactivos, como las proteínas. Rehidratación de película delgada no ofrece control sobre la polidispersidad de la polymersomes formado, a menudo requiere técnicas de extrusión costoso y desperdiciador de tiempo para lograr monodispersity aceptable. Además, microfluids e hidratación directa son difíciles de escala para grandes volúmenes de producción. De los métodos de fabricación diferentes nanocarrier, flash nanoprecipitation (FNP) ofrece la posibilidad de hacer formulaciones a gran escala y reproducible8,9,10. Mientras que la FNP estaba reservado previamente para la formulación de nanopartículas de núcleo macizo, nuestro laboratorio ha ampliado recientemente el uso de FNP para incluir la formación constante de diversos PEG -bl- PPS nanoestructura morfologías11, 12, incluyendo polymersomes11 y bicontinuas nanoesferas12. Se encontró que la FNP fue capaz de formar monodispersa formulaciones de polymersomes sin necesidad de extrusión, resultando en valores de índice de polidispersidad superior comparados con no sacó polymersomes formado por dispersión de rehidratación y solvente de película delgada 11. bicontinuas nanoesferas, con sus grandes dominios hidrofóbicos, no fueron capaces de formar por rehidratación de película delgada, a pesar de formar un número de condiciones solvente con FNP12.
Aquí, ofrecemos una descripción detallada para la síntesis de la PEG - copolímero de diblockbl- PPS usado en la formación de polymersome, el mezclador de jets (CIJ) de choque confinado utilizado para la FNP, el FNP protocolo sí mismo y la implementación de un sistema automatizado para reducir la variabilidad del usuario. Información sobre cómo esterilizar el sistema lo suficiente como para producir formulaciones libres de endotoxinas para uso en vivoy datos representativos acerca de la caracterización de polymersomes formado por FNP está incluida. Con esta información, los lectores con interés en utilizar polymersomes para trabajo in vitro e in vivo podrán fabricar sus propias formulaciones monodispersa estéril. Lectores con experiencia en formulaciones nanocarrier y con conocimientos de síntesis del polímero será capaces de probar rápidamente sus propios sistemas de polímero mediante FNP como una alternativa posible a sus actuales técnicas de formulación. Además, los protocolos descritos pueden utilizarse como herramientas educativas para la formulación de nanocarriers en los cursos de laboratorio de nanotecnología.

<table><tbody><tr><td>CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit - Edición de 32 GB</td><td>CanaKit</td><td>UPC 682710991511</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma de Rodamiento Lineal (Pequeña) - 8 mm de diámetro</td><td>Adafruit</td><td>1179</td><td></td></tr><tr><td>Movimiento lineal Eje de 8 mm, 330 mm de longitud, cromado, cementado, métrico</td><td>VXB</td><td>kit11868</td><td></td></tr><tr><td>Guía/soporte de eje de riel lineal - 8 mm de diámetro</td><td>Adafruit</td><td>1182</td><td></td></tr><tr><td>Corredera de precisión de posición manual Carrera de 4.5", capacidad de carga de 15 lb</td><td>McMaster-Carr</td><td>5236A16</td><td></td></tr><tr><td>MTPM-P10-1JK43 Motor de CC Iron</td><td>Horse Iron Horse</td><td>MTPM-P10-1JK43</td><td></td></tr><tr><td>Pantalla LCD con pantalla táctil oficial de 7" de Raspberry Pi</td> Foundation <td>Raspberry Pi</td><td>B0153R2A9I (ASIN)</td><td></td></tr><tr><td>PicoBorg Reverse - Control de motor avanzado para Raspberry Pi</td><td>PiBorg</td><td>BURN-0011</td><td></td></tr><tr><td>Portador Pololu con sensor de distancia digital de GP2Y0D810Z0F agudo de 10 cm</td><td>Pololu</td><td>1134</td><td></td></tr><tr><td>Ruland PSR16-5-4-A Acoplamiento de viga de tornillo de fijación, aluminio pulido, pulgada, diámetro de 5/16" A, diámetro de diámetro B de 1/4", diámetro exterior de 1/4", longitud de 1-1/4", par nominal de 44 lb-in</td><td>Ruland</td><td>PSR16-5-4-A</td><td></td></tr><tr><td>Éter monometílico de polietilenglicol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>202495</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de metanosulfonilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>471259</td><td></td></tr><tr><td>Tolueno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>179418</td><td></td></tr><tr><td>Tolueno, anhidro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>Trietilamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>Celite 545 (Tierra de diatomeas)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>419931</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>320269</tr><tr><td>Éter dietílico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetilformamida, anhidro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de potasio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>791776</td><td></td></tr><tr><td>Ácido tioacético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T30805</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360589</td><td></td></tr><tr><td>Aluminio óxido, neutro, activado, Brockmann I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>199974</td><td></td></tr><tr><td>Solución de metóxido de sodio, 0,5 M en metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>403067</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuro de propileno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P53209</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320390</td><td></td></tr><tr><td>Solución de hidróxido de sodio 1,0 N</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de endotoxinas</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30529.01</td><td></td></tr><tr><td>Tiras de papel</td><td>pH Fisher Scientific</td><td>13-640-508</td><td></td></tr><tr><td>Libre de endotoxinas Dulbecco's PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TMS-012</td><td></td>Viales de</tr><tr><td>centelleo de vidrio de borosilicato</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-4</td><td></td></tr><tr><td>1 mL jeringa totalmente de plástico</td><td>Thermo Scientific</td><td>S75101</td><td></td></tr><tr><td>Sepharose CL-6B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CL6B200</td><td></td></tr><tr><td>Columna de cromatografía líquida</td><td>Sigma</td><td>Aldrich C4169</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador CIJ, HDPE</td><td>Custom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Solución de peróxido de hidrógeno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>HEK-Blue hTLR4</td><td>InvivoGen</td><td>hkb-htlr4</td><td></td></tr><tr><td>RAW-Blue Cells</td><td>InvivoGen</td><td>raw-sp</td><td></td></tr><tr><td>QUANTI-Blue</td><td>InvivoGen</td><td>rep-qb1</td><td></td></tr><tr><td>PYROGENT Gel Clot LAL Assays</td><td>Lonza</td><td>N183-125</td><td></td></tr></tbody></table>

montaje rápido, escalable y la carga de proteínas bioactivas y los inmunoestimulantes en diversos nanocarriers sintético vía flash nanoprecipitation

Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthetic Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

Nanomateriales presentan una amplia gama de opciones para personalizar la entrega controlada de cargas moleculares individuales y combinados para aplicaciones terapéuticas y proyección de imagen. Esta especificidad creciente puede tener importantes implicaciones clínicas, incluyendo la disminución de efectos secundarios y dosis más bajas con mayor potencia. Además, el en situ dirigidos a modulación controlada de subconjuntos específicos de la célula puede mejorar las investigaciones in vitro e in vivo de fenómenos biológicos básicos y sonda en función de la célula. Por desgracia, los conocimientos requeridos en ciencia de la nanoescala, la química y la ingeniería a menudo prohíben laboratorios sin experiencia en estos campos de fabricación y personalización de nanomateriales como herramientas para sus investigaciones o vehículos para su estrategias terapéuticas. Aquí, le ofrecemos protocolos para la síntesis y ensamblaje escalable de un sistema de copolímero de bloque no tóxico versátil susceptible a la fácil formación y carga de los vehículos de escala nanométrica para aplicaciones biomédicas. Nanoprecipitation flash se presenta como una metodología para la fabricación rápida de diversas nanocarriers de poly(ethylene glycol) -bl-copolímeros de poli (sulfuro de propileno). Estos protocolos permitirá laboratorios con una amplia gama de conocimientos y recursos para fácil y reproducible fabricar nanocarrier avanzados sistemas para sus aplicaciones. Procesan de diseño y construcción de un instrumento automatizado que emplea una bomba de jeringa de alta velocidad para facilitar el nanoprecipitation flash y para permitir mayor control sobre la homogeneidad, tamaño, morfología y carga de nanocarriers de polymersome es se describe.

Aquí, hemos presentado un protocolo simple para la formulación de nanocarriers capaz de cargar carga hidrofílico e hidrofóbico que son seguros para el en vivo de ratón y primates no humanos administración11,13. También hemos incluido un protocolo detallado para la síntesis del polímero utilizado en nuestros resultados representativos, junto con una descripción para la fabricación de un instrumento personalizado para el ch...

Nanomateriales ofrecen versátiles mecanismos de entrega terapéutica controlada para aplicaciones aplicadas y ciencia básica, pero su fabricación a menudo requiere conocimientos que no está disponible en laboratorios biomédicos más. Aquí, presentamos protocolos de fabricación escalable y carga terapéutica de diversos nanocarriers uno mismo-montado usando flash nanoprecipitation.

Montaje rápido, escalable y la carga de proteínas bioactivas y los inmunoestimulantes en diversos Nanocarriers sintético vía Flash Nanoprecipitation

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging ...

Creemos que el uso de la nanoprecipitación flash para ensamblar nanoestructuras complejas permitirá a los investigadores que no tienen una amplia experiencia en química, ingeniería o ciencia de nanomateriales fabricar sistemas avanzados de administración de fármacos de forma independiente para sus propias aplicaciones y necesidades específicas. La principal ventaja de esta técnica es la generación de grandes volúmenes de diversas nanoestructuras a alta concentración, baja polidispersidad y cargadas con moléculas bioactivas, incluyendo fármacos de moléculas pequeñas y proteínas, todas ellas formadas en condiciones estériles. En general, las personas nuevas en la síntesis de polímeros pueden tener dificultades porque el componente de sulfuro de polipropileno es muy sensible a la oxidación por exposición al aire.La demostración visual de este método es fundamental, ya que los múltiples pasos de pinzamiento son difíciles de aprender porque deben realizarse muy rápidamente en sucesión. Para esterilizar los chorros de impacto confinados, o mezclador CIJ, trabaje dentro de un gabinete de seguridad biológica para sumergir el mezclador con todas las partes desmontadas en hidróxido de sodio

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En este artículo se describe un método para sintetizar nanoprecipitation a base de polímeros con nanopartículas de copolímeros de bloque doble. Vamos a discutir la síntesis de copolímeros de bloque doble, la técnica nanoprecipitation, y sus posibles aplicaciones.

Formulación de nanopartículas poliméricas mediante la técnica de dibloque Nanoprecipitation

En este artículo, un método de alto rendimiento se presenta para la síntesis de oligosacáridos y su fijación a la superficie de las nanopartículas polianhídrido para su uso posterior en la orientación de receptores específicos en las células presentadoras de antígenos.

De alto rendimiento de síntesis de carbohidratos y funcionalización de nanopartículas polianhidrido

Describimos técnicas basadas en imágenes de animales enteros y citometría de flujo para monitorear la expansión de las células T CD8+ específicas de antígeno en respuesta a la inmunización con nanopartículas en un modelo murino de vacunación.

Imaging Whole-animal y de citometría de flujo Las técnicas para T CD8 + respuestas celulares Análisis de antígeno-específicos después de nanopartículas Vacunación

Informamos sobre una aplicación inteligente de nanotubos de carbono para la estabilización cinética de partículas lipídicas que contienen nanoestructuras autoensambladas en sus núcleos. La preparación de partículas lipídicas requiere concentraciones bastante bajas de nanotubos de carbono, lo que permite su uso en aplicaciones biomédicas, como la administración de fármacos.

Preparación fácil del ensamblado autónomos Internamente Lípidos Las partículas estabilizadas por nanotubos de carbono

Se utilizó una homogeneización simple para preparar nanopartículas nuevas, de alta densidad, que imitan las lipoproteínas para encapsular el factor de crecimiento nervioso. En este artículo se describen los desafíos, los protocolos detallados para la preparación de nanopartículas, la caracterización in vitro y los estudios in vivo .

Preparación y caracterización de nuevas nanopartículas que imitan las HDL para la encapsulación del factor de crecimiento nervioso

Flash NanoPrecipitation (FNP) es un enfoque escalable para producir nanopartículas poliméricas de core-shell. Se describen formulaciones de escala de laboratorio para la encapsulación de la terapéutica hidrofóbica o hidrofílica.

Flash NanoPrecipitation para la encapsulación de compuestos hidrofóbicos e hidrofílicos en nanopartículas poliméricas

En la interfaz de disolventes orgánicos y acuosos, las proteínas anfifílicas a medida similares a la elastina se ensamblan en estructuras supramoleculares complejas como vesículas, fibras y coacervados desencadenados por parámetros ambientales. Los protocolos de montaje descritos producen compartimentos basados en membranas de proteínas (PMBC) con propiedades ajustables, lo que permite la encapsulación de varias cargas.

Montaje dirigido de proteínas similares a la elastina en estructuras supramoleculares definidas y encapsulación de carga in Vitro

Las nanopartículas lipídicas se desarrollan utilizando un enfoque de plataforma de mezcla microfluídica para la encapsulación de ARNm y ADN.

Formulación y caracterización de nanopartículas lipídicas para la administración de genes utilizando una plataforma de mezcla microfluídica

Aquí, se presenta un protocolo simple para producir nanopartículas de ARNm basadas en polímeros de poli(beta aminoéster), fáciles de adaptar cambiando el ARNm encapsulado. También se describe el flujo de trabajo para sintetizar los polímeros, las nanopartículas y su caracterización esencial in vitro. También se agrega una prueba de concepto con respecto a la inmunización.

Síntesis y caracterización de nanopartículas de poli(beta aminoésteres) cargadas de ARNm con fines de vacunación

Los nanogeles son una plataforma de nanopartículas excelente y versátil para la administración de productos biológicos. Los nanogeles poliméricos basados en poli(etilenglicol) que responden a los estímulos, capaces de encapsular cargas útiles basadas en proteínas, se sintetizaron utilizando una estrategia de conanopolimerización reticulada de un solo paso en condiciones acuosas. Aquí se presenta la fabricación y caracterización óptimas de estas nuevas nanopartículas.

Síntesis de nanogeles sensibles a estímulos mediante reticulación acuosa en un solo paso y co-nanopolimerización

Se demuestra un protocolo detallado para sintetizar nanopartículas lipídicas (LNPs) utilizando tecnologías de mezcladores de chorro de impacto confinado (CIJ), incluyendo un CIJ de dos chorros y un mezclador de vórtice de entrada múltiple de cuatro chorros (μMIVM). Los mezcladores CIJ generan entornos de micromezcla turbulentos y reproducibles, lo que da como resultado la producción de LNP monodispersos.

Síntesis de nanopartículas lipídicas por flujo turbulento en mezcladores de chorro de impacto confinados

Aprende a fabricar sistemas avanzados de liberación de fármacos mediante nanoprecipitación flash, una técnica escalable que permite cargar proteínas bioactivas e inmunoestimulantes en nanocarriers sintéticos con baja polidispersidad.

Montaje rápido, escalable y la carga de proteínas bioactivas y los inmunoestimulantes en diversos Nanocarriers sintético vía Flash Nanoprecipitation (Video) | JoVE Journal

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