Montaje rápido, escalable y la carga de proteínas bioactivas y los inmunoestimulantes en diversos Nanocarriers sintético vía Flash Nanoprecipitation

Creemos que el uso de la nanoprecipitación flash para ensamblar nanoestructuras complejas permitirá a los investigadores que no tienen una amplia experiencia en química, ingeniería o ciencia de nanomateriales fabricar sistemas avanzados de administración de fármacos de forma independiente para sus propias aplicaciones y necesidades específicas. La principal ventaja de esta técnica es la generación de grandes volúmenes de diversas nanoestructuras a alta concentración, baja polidispersidad y cargadas con moléculas bioactivas, incluyendo fármacos de moléculas pequeñas y proteínas, todas ellas formadas en condiciones estériles. En general, las personas nuevas en la síntesis de polímeros pueden tener dificultades porque el componente de sulfuro de polipropileno es muy sensible a la oxidación por exposición al aire.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los múltiples pasos de pinzamiento son difíciles de aprender porque deben realizarse muy rápidamente en sucesión. Para esterilizar los chorros de impacto confinados, o mezclador CIJ, trabaje dentro de un gabinete de seguridad biológica para sumergir el mezclador con todas las partes desmontadas en hidróxido de sodio molar de punto cero durante la noche. Vuelva a montar el mezclador CIJ y haga fluir agua libre de endotoxinas a través del mezclador con jeringas Luerlock, pruebe el pH del agua y continúe fluyendo agua hasta que el ph se registre como neutro.

Para preparar la solución de impacto uno, primero pese 20 miligramos del polímero sintetizado en un tubo de un punto cinco mililitros. Luego, agregue tintes hidrofóbicos, medicamentos u otra carga. Finalmente, agregue 500 microlitros de tetrahidrofurano al 100% al polímero y la carga, vórtice vigorosamente para disolver.

Para preparar la solución de impacto dos, disuelva la carga hidrofílica que se cargará dentro de las vesículas de polímero en 500 microlitros de un tampón acuoso. Añada 2,5 mililitros de un tampón acuoso de su elección a un depósito de tamaño adecuado. Ahora, coloque el depósito debajo del mezclador CIJ de modo que el flujo de salida del mezclador ingrese directamente al depósito.

Cargue las soluciones de impacto en jeringas desechables de plástico separadas de un mililitro, haga chocar las soluciones entre sí para formar simultáneamente nanoestructuras insertando jeringas en los adaptadores luerlock en la parte superior del mezclador CIJ. Con un solo movimiento, suave y rápido, presione ambas jeringas simultáneamente y con la misma fuerza. Si se van a realizar múltiples impactos, es fundamental que se realicen lo más rápido posible para reducir la pérdida de disolvente orgánico de Valtower.

Para realizar múltiples impactos, divida la solución de nanoestructura naciente entre dos jeringas y repita este paso hasta cuatro veces más. Recoja el flujo de salida en el depósito lleno de tampón acuoso y revuelva suavemente para asegurar la mezcla. Hay varias opciones para retirar la carga descargada y el disolvente orgánico.

La formulación de nanoportadores se puede eliminar a través de la exclusión de impuestos especiales o la columna de desalinización, a través de un sistema de filtración de flujo tangencial, a través de la desecación al vacío o mediante diálisis como se demuestra aquí. Diálisis la formulación de nanoportadores en el mismo tampón acuoso y depósito utilizado para el pinzamiento. Utilice tubos de un límite de peso molecular adecuado durante al menos 24 horas, con al menos dos cambios de tampón.

Una vez que la carga descargada se haya retirado del solvente orgánico, concentre la formulación de nanoportadores utilizando un sistema concentrador de espín siguiendo las instrucciones del fabricante. Los nanoportadores pueden almacenarse a cuatro grados centígrados durante semanas o meses. Antes de su uso después del almacenamiento, las formulaciones de nanoportadores deben ser brevemente vertiginosas.

Realizar la fabricación de una bomba de jeringa de alta velocidad como se describe en el protocolo de texto. Para usar el modo de ejecución automática, seleccione ejecución automática en el menú principal. El sistema solicitará a los usuarios que permitan que el motor posicione automáticamente la plataforma de expulsión de la jeringa al comienzo de la corredera de precisión.

Asegúrese de que el camino delante y detrás de la placa metálica esté despejado antes de continuar. Cargue el mezclador CIJ en la abertura rectangular del carro de expulsión trasero. Luego, cargue jeringas de plástico de un mililitro como antes y monte las jeringas en los conectores de señuelo hembra del mezclador CIJ.

Antes de hacer funcionar el instrumento, configure la velocidad deseada del motor y verifique que el sistema esté despejado como se describe en el protocolo de texto. Para expulsar los reactivos de las jeringas y llevarlos al mezclador CIJ, presione el botón ejecutar en la interfaz del software. Micrografías electrónicas de transmisión criogénicas representativas muestran polimerosomas más pequeños y monodispersos después de repetidos impactos.

El análisis dinámico de dispersión de luz confirmó un desplazamiento hacia la izquierda de la distribución de tamaño de los polimerosomas después de repetidos impactos. Después de cinco impactos repetidos, el diámetro promedio y la polidispersidad de los polimerosomas coinciden con los de las muestras extruidas formadas por rehidratación de película delgada. La nanoprecipitación flash se puede utilizar para cargar una variedad de pequeñas moléculas y macromoléculas hidrofóbicas e hidrofílicas en polimerosomas.

Aunque este método puede proporcionar información sobre cómo funcionan las inmunoterapias y las vacunas, también se puede aplicar al estudio de cómo los polímeros se autoensamblan en nanoestructuras intrincadas. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la administración intravenosa o subcutánea a modelos animales, con el fin de determinar qué subconjuntos de células internalizan las nanopartículas o cuál es la ruta de aclaramiento para las diferentes nanoestructuras. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de enfermedades cardíacas y cáncer, así como el desarrollo de vacunas para enfermedades infecciosas, ya que estos nanotransportadores pueden dirigir múltiples fármacos a células inmunitarias muy específicas.