Name: Purificación y reconstitución de TRPV1 para análisis espectroscópico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Aprende a purificar y reconstituir TRPV1 para análisis espectroscópico mediante resonancia paramagnética electrónica. Este protocolo permite obtener cantidades miligramo de canal iónico funcional para estudiar cambios conformacionales.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Estamos muy agradecidos al Dr. H. Mchaourab para dar acceso a los espectrómetros de EPR y los ciervos y el Dr. T. Rosenbaum para proporcionar el plásmido de TRPV1 cisteína-menos completo.

<ol><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504, 107-112 (2013).</li>
<li>Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+distinct+conformations+reveal+activation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms.</a> Nature. 504, 113-118 (2013).</li>
<li>Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+nanodiscs+reveal+mechanisms+of+ligand+and+lipid+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action.</a> Nature. , (2016).</li>
<li>Yang, F., Xiao, X., Cheng, W., Yang, W., Yu, P., Song, Z., Yarov-Yarovoy, V., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+underlying+capsaicin+binding+and+activation+of+the+TRPV1+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel.</a> Nat Chem Biol. 11, 518-524 (2015).</li>
<li>Bae, C., Anselmi, C., Kalia, J., Jara-Oseguera, A., Schwieters, C. D., Krepkiy, D., Won Lee, C., Kim, E. H., Kim, J. I., Faraldo-Gomez, J. D., Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+mechanism+of+activation+of+the+TRPV1+channel+by+a+membrane-bound+tarantula+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the mechanism of activation of the TRPV1 channel by a membrane-bound tarantula toxin.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+KvAP+voltage-dependent+K%2B+channel+in+a+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer.</a> Science. 306, 491-495 (2004).</li>
<li>Cordero-Morales, J. F., Jogini, V., Lewis, A., Vasquez, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+driving+forces+determining+potassium+channel+slow+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular driving forces determining potassium channel slow inactivation.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 1062-1069 (2007).</li>
<li>Cordero-Morales, J. F., Cuello, L. G., Zhao, Y., Jogini, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+gating+at+the+potassium-channel+selectivity+filter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of gating at the potassium-channel selectivity filter.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 311-318 (2006).</li>
<li>Basak, S., Schmandt, N., Gicheru, Y., Chakrapani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+and+dynamics+of+a+lipid-induced+potential+desensitized-state+of+a+pentameric+ligand-gated+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Crystal structure and dynamics of a lipid-induced potential desensitized-state of a pentameric ligand-gated channel.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+mechanism+for+MscS+gating+in+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers.</a> Science. 321, 1210-1214 (2008).</li>
<li>Perozo, E., Kloda, A., Cortes, D. M., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+principles+underlying+the+transduction+of+bilayer+deformation+forces+during+mechanosensitive+channel+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating.</a> Nat Struct Biol. 9, 696-703 (2002).</li>
<li>Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+channel+structure+of+MscL+and+the+gating+mechanism+of+mechanosensitive+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels.</a> Nature. 418, 942-948 (2002).</li>
<li>Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+rearrangements+underlying+K%2B-channel+activation+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating.</a> Science. 285, 73-78 (1999).</li>
<li>Goehring, A., Lee, C. H., Wang, K. H., Michel, J. C., Claxton, D. P., Baconguis, I., Althoff, T., Fischer, S., Garcia, K. C., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nat Protoc. 9, 2574-2585 (2014).</li>
<li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20, 1293-1299 (2012).</li>
<li>Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pore+architecture+and+ion+sites+in+acid-sensing+ion+channels+and+P2X+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors.</a> Nature. 460, 599-604 (2009).</li>
<li>McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motion+of+spin-labeled+side+chains+in+T4+lysozyme.+Correlation+with+protein+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics.</a> Biochemistry. 35, 7692-7704 (1996).</li>
<li>Columbus, L., Kalai, T., Jeko, J., Hideg, K., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motion+of+spin+labeled+side+chains+in+alpha-helices%3A+analysis+by+variation+of+side+chain+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular motion of spin labeled side chains in alpha-helices: analysis by variation of side chain structure.</a> Biochemistry. 40, 3828-3846 (2001).</li>
<li>Zou, P., McHaourab, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+sensitivity+and+extended+range+of+distance+measurements+in+spin-labeled+membrane+proteins%3A+Q-band+double+electron-electron+resonance+and+nanoscale+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers.</a> Biophys J. 98, L18-L20 (2010).</li>
<li>Vasquez, V., Sotomayor, M., Cortes, D. M., Roux, B., Schulten, K., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+membrane-embedded+MscS+in+the+closed+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of membrane-embedded MscS in the closed conformation.</a> J Mol Biol. 378, 55-70 (2008).</li>
<li>Autzen, H. E., Myasnikov, A. G., Campbell, M. G., Asarnow, D., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+TRPM4+ion+channel+in+a+lipid+nanodisc%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc.</a> Science. 359, 228-232 (2018).</li>
<li>Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Nanodiscs+as+a+Tool+for+High-Resolution+Structure+Determination+of+Membrane+Proteins+by+Single-Particle+Cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Lipid Nanodiscs as a Tool for High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins by Single-Particle Cryo-EM.</a> Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).</li>
<li>Guo, J., She, J., Zeng, W., Chen, Q., Bai, X. C., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+calcium-activated%2C+non-selective+cation+channel+TRPM4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4.</a> Nature. 552, 205-209 (2017).</li>
<li>McGoldrick, L. L., Singh, A. K., Saotome, K., Yelshanskaya, M. V., Twomey, E. C., Grassucci, R. A., Sobolevsky, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opening+of+the+human+epithelial+calcium+channel+TRPV6%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Opening of the human epithelial calcium channel TRPV6.</a> Nature. 553, 233-237 (2018).</li>
<li>Dang, S., Feng, S., Tien, J., Peters, C. J., Bulkley, D., Lolicato, M., Zhao, J., Zuberbuhler, K., Ye, W., Qi, L., Chen, T., Craik, C. S., Nung Jan, Y., Minor, D. L. Jr, Cheng, Y., Yeh Jan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+of+the+TMEM16A+calcium-activated+chloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures of the TMEM16A calcium-activated chloride channel.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Velisetty, P., Stein, R. A., Sierra-Valdez, F. J., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Purification+of+the+Pain+Receptor+TRPV1+for+Spectroscopic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Expression and Purification of the Pain Receptor TRPV1 for Spectroscopic Analysis.</a> Sci Rep. 7, 9861(2017).</li>
<li>Salazar, H., Llorente, I., Jara-Oseguera, A., Garcia-Villegas, R., Munari, M., Gordon, S. E., Islas, L. D., Rosenbaum, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+N-terminal+cysteine+in+TRPV1+determines+activation+by+pungent+compounds+from+onion+and+garlic%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic.</a> Nat Neurosci. 11, 255-261 (2008).</li>
<li>Cao, E., Cordero-Morales, J. F., Liu, B., Qin, F., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+channels+are+intrinsically+heat+sensitive+and+negatively+regulated+by+phosphoinositide+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids.</a> Neuron. 77, 667-679 (2013).</li>
<li>Braman, J., Papworth, C., Greener, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+using+double-stranded+plasmid+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis using double-stranded plasmid DNA templates.</a> Methods Mol Biol. 57, 31-44 (1996).</li>
<li>Gracheva, E. O., Cordero-Morales, J. F., Gonzalez-Carcacia, J. A., Ingolia, N. T., Manno, C., Aranguren, C. I., Weissman, J. S., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglion-specific+splicing+of+TRPV1+underlies+infrared+sensation+in+vampire+bats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ganglion-specific splicing of TRPV1 underlies infrared sensation in vampire bats.</a> Nature. 476, 88-91 (2011).</li>
<li>Guan, B., Chen, X., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-electrode+voltage+clamp%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-electrode voltage clamp.</a> Methods Mol Biol. 998, 79-89 (2013).</li>
<li>Jarecki, B. W., Makino, S., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+Shaker+potassium+channels+produced+by+cell-free+translation+upon+injection+into+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Function of Shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into Xenopus oocytes.</a> Sci Rep. 3, 1040(2013).</li>
<li>Jeschke, G., Polyhach, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurements+on+spin-labelled+biomacromolecules+by+pulsed+electron+paramagnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance.</a> Phys Chem Chem Phys. 9, 1895-1910 (2007).</li>
<li>Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dead-time+free+measurement+of+dipole-dipole+interactions+between+electron+spins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins.</a> J Magn Reson. 142, 331-340 (2000).</li>
<li>Mishra, S., Verhalen, B., Stein, R. A., Wen, P. C., Tajkhorshid, E., McHaourab, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+dynamics+of+the+nucleotide+binding+domains+and+the+power+stroke+of+a+heterodimeric+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Conformational dynamics of the nucleotide binding domains and the power stroke of a heterodimeric ABC transporter.</a> Elife. 3, e02740(2014).</li>
<li>Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+labeled+cysteines+as+sensors+for+protein-lipid+interaction+and+conformation+in+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin.</a> Photochem Photobiol. 56, 1019-1033 (1992).</li>
<li>Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+capsaicin+receptor%3A+a+heat-activated+ion+channel+in+the+pain+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway.</a> Nature. 389, 816-824 (1997).</li>
<li>McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+fourth+dimension+of+membrane+protein+structure%3A+insight+into+dynamics+from+spin-labeling+EPR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy.</a> Structure. 19, 1549-1561 (2011).</li>
<li>Jeschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEER+distance+measurements+on+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">DEER distance measurements on proteins.</a> Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).</li>
<li>Jeschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurements+in+the+nanometer+range+by+pulse+EPR%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR.</a> Chemphyschem. 3, 927-932 (2002).</li>
<li>Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+of+pair+distance+distributions+by+pulsed+ESR+using+Tikhonov+regularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization.</a> J Magn Reson. 172, 279-295 (2005).</li>
<li>He, Y., Wang, K., Yan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recombinant+expression+systems+for+structure+determination+of+eukaryotic+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins.</a> Protein Cell. 5, 658-672 (2014).</li>
<li>Ghimire, H., McCarrick, R. M., Budil, D. E., Lorigan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significantly+improved+sensitivity+of+Q-band+PELDOR%2FDEER+experiments+relative+to+X-band+is+observed+in+measuring+the+intercoil+distance+of+a+leucine+zipper+motif+peptide+%28GCN4-LZ%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Significantly improved sensitivity of Q-band PELDOR/DEER experiments relative to X-band is observed in measuring the intercoil distance of a leucine zipper motif peptide (GCN4-LZ).</a> Biochemistry. 48, 5782-5784 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las tecnologías actuales para la expresión y purificación de proteínas de membrana mamíferos han hecho posible obtener una cantidad suficiente de proteína para estudios espectroscópicos14,15,16,42. Aquí, hemos adaptado estas tecnologías para expresar, purificar, reconstituir y realizar análisis espectroscópico en el TRPV1.
Entre los pasos críticos en el protocolo, a ...

Con los recientes avances en microscopia del cryo-electrón de solo-partícula (cryo-EM), estructuras de canal del ion mamíferos han sido obtenidas a un ritmo extraordinario. Particularmente, los estudios estructurales de los canales iónicos de Polimodal, como los vaniloides potencial transitorio del receptor 1 (TRPV1), han proporcionado mayor comprensión de su activación mecanismos1,2,3, 4 , 5. sin embargo, información dinámica sobre canales del ion encajado en un ambiente de membrana se requiere para entender sus mecanismos Polimodal bloquea y atascamiento de la droga.
Resonancia paramagnética electrónica (EPR) y espectroscopías de resonancia (ciervos) doble electrón-electrón han proporcionado algunos de los modelos mecanicistas más definitivos para ion canales6,7,8,9 , 10 , 11 , 12 , 13. estos enfoques se han limitado principalmente a la examinación de procariotas y ion archeal canales que producen una gran cantidad de proteínas purificadas de detergente cuando overexpressed en bacterias. Con el desarrollo de la producción de proteínas de membrana eucariota en insectos y células de mamíferos para la caracterización funcional y estructural14,15,16, ahora es posible obtener bioquímico cantidades de proteínas purificadas de detergente para estudios espectroscópicos.
Las señales de EPR y ciervos surgen de una etiqueta de paramagneticspin (SL) (es decir, methanethiosulfonate) unida a un residuo de cisteína solo en la proteína. Las etiquetas de vuelta informan tres tipos de información estructural: movimiento, accesibilidad y distancias. Esta información permite determinar si los residuos se entierran dentro de la proteína o se exponen a la membrana o ambiente acuoso en la apo y Estados de la ligand-limite13,17,18,19. En el contexto de una estructura de alta resolución (cuando esté disponible), el EPR y los ciervos los datos proporcionan una colección de restricciones para derivar modelos dinámicos en su medio natural manteniéndose en transición bloquea reversible (es decir, cerrado, abierto, sensibilizados y desensibilizar). Por otra parte, las regiones flexibles que podrían ser difíciles de determinar por cristalografía de rayos x o cryo-EM podían obtenerse mediante el uso de estos conjuntos de datos ambientales para asignar estructuras secundarias, así como la ubicación dentro de la proteína20. Estructuras de Cryo-EM obtenidas en nanodiscs de lípidos proporcionan información valiosa sobre la compuerta del ion de canales3,21,22,23,24, 25; sin embargo, métodos espectroscópicos podrían proporcionar información dinámica de Estados conformacionales (p. ej., cambios térmicos) que podría ser difícil de determinar utilizando cryo-EM.
Hay que superar muchas dificultades para implementar EPR y los ciervos, como la falta de función de la proteína al quitar todos los residuos de cisteína (especialmente abundantes en mamíferos canales), rendimiento de proteína baja, inestabilidad de la proteína durante la purificación y después centrifugado etiquetado y la agregación de la proteína en detergente o liposomas. Aquí, hemos diseñado protocolos para superar estas barreras críticas y han obtenido información de ciervos y EPR espectros para un receptor sensorial mamífero. El objetivo aquí es describir metodologías para construyen la expresión, la purificación, el etiquetado y la reconstitución de una rata menos cisteína mínimo funcional TRPV1 (eTRPV1) para análisis espectroscópico. Esta metodología es apropiada para las proteínas de la membrana que mantienen su función a pesar de la eliminación de residuos de cisteína o que contienen cisteína formando enlaces disulfuro. Esta colección de protocolos podría adaptarse para el análisis espectroscópico de los otros canales iónicos mamíferos.

<table><tbody><tr><td>Kit de mutagénesis dirigido al sitio QuikChange Lightning</td><td>Agilent Technologies</td><td>210519-5</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol (Isopropanol)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina Suero bovino (BSA)</td><td>GoldBio.com</td><td>A-420-10</td><td></td></tr><tr><td>Resina de amilosa</td><td>NEB</td><td>E8021L</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>GoldBio.com</td><td>A-655-25</td><td></td></tr><tr><td>Asolectina de soja</td><td>Sigma</td><td>11145</td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Sistema de expresión de baculovirus</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10359016</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads SM-2 Adsorbentes&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de vidrio de borosilicato (3.5'') (inyección de ovocitos)</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203 G/X</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de vidrio de borosilicato (grabaciones de ovocitos)</td><td>Sutter Instrument</td><td>B150-110-10HP</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillina (disodio)</td><td>GoldBio.com</td><td>C-103-5</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de celfectina</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10362-010</td><td></td></tr><tr><td>cellSens</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606SK</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa Tipo 1</td><td>Worthington-Biochem</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>Critiseal</td><td>VWR</td><td>18000-299</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Maltosa Monohidrato</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP684</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Docecil-B-D-Maltopyranoside)</td><td>Anatrace</td><td>D310S Medio</td><td></td></tr><tr><td>de alto contenido glucémico (Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio)</td><td>Sigma</td><td>D0572&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Columnas desalinizadoras desechables PD-10 GE</td><td>Healthcare</td><td>45-000-148</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>O2783</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch Plus Mini-Prep Kit de preparación de ADN plasmídico</td><td>Epoch Life Science, Inc</td><td>2160250</td><td></td></tr><tr><td>Kit de limpieza de PCR GenCatch</td><td>Epoch Life Science, Inc</td><td>2360050</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de gentamicina</td><td>Lonza</td><td>17-518Z</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidrio (25 &micro; l)</td><td>VWR</td><td>53432-761</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de vidrio 2800 mL</td><td>Pyrex USA</td><td>4423-2XL</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher BioReactivos</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>HEK293S GnTl-ATCC</td><td></td> <td>CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (isopropil-tio-B-galactósido)</td><td>GoldBio.com</td><td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de kanamicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth, Miller</td><td>Fisher bioReactivos</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Hemisulfato de leupeptina</td><td>GoldBio.com</td><td>L-010-5</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MOPS Fisher bioReactivos</td><td>BP2936</td><td></td></tr><tr><td>MTSL (1-oxil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidin-3-il) Metilo Metanetiosulfonato</td><td>Toronto Research Chemicals, Inc</td><td>O873900</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatina A</td><td>GoldBio.com</td><td>P-020-5</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Plurónico F-127 (20%)</td><td>PromoKine&nbsp; &nbsp;</td><td>CA707-59004</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>GoldBio.com</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Solución de poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Capilar sellado</td><td>Pedido</td><td></td>especial <td>VitroCom</td></tr><tr><td>SF-900 II SFM (medio celular de insecto)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>10902-088</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 Células (adaptadas a SFM)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11496-015</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de lípidos polares de soja</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc</td><td>541602C</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25590</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>29091596</td><td></td></tr><tr><td>TCEP HCl</td><td>GoldBio.com</td> CLORHIDRATO de tetraciclina <td>TCEP1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Base Fisher BioReactivos</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Difco</td><td>0123-01</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>GoldBio.com</td><td>X4281C</td><td></td></tr><tr><td>Ovocitos de Xenopus</td><td>Nasco LM00935M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XL1 - Células Competentes Azules</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>200249</td><td></td></tr><tr><td>Levadura Extracto</td><td>Difco</td><td>0127-01-7</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pack columna de cromatografía</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Geles prefabricados sin manchas</td><td>Bio-Rad</td><td>17000436</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac1 Vector de expresión</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10360-014</td><td></td></tr><tr><td>DH10Bac Células competentes</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>Sellador de tubos capilares Critiseal</td><td>Leica Microsystems</td><td>02-676-20</td><td></td></tr><tr><td>ABI Modelo 3130XL Analizadores genéticos</td><td>Applied Biosystems</td><td>4359571</td><td></td></tr><tr><td>pipeta de transferencia</td><td>Fishebrand</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr></tbody></table>

purificación y reconstitución de trpv1 para análisis espectroscópico

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Canales del ion del polimodal transducen múltiples estímulos de diversa índole en cambios alostéricos; Estas conformaciones dinámicas son desafiantes para determinar y siguen siendo en gran parte desconocidos. Con los avances recientes en vertiendo luz de solo-partícula cryo-Electrón microscopia (cryo-EM) en las características estructurales de los sitios de unión del agonista y el mecanismo de activación de varios canales del ion, el escenario está preparado para un análisis profundo de la dinámico de su gating mecanismos mediante métodos espectroscópicos. Técnicas espectroscópicas como resonancia paramagnética electrónica (EPR) y la resonancia doble electrón-electrón (ciervos) se han limitado principalmente al estudio de los canales iónicos procariotas que pueden ser purificados en grandes cantidades. La necesidad de grandes cantidades de proteínas de membrana funcional y estable ha dificultado el estudio de los canales del ion mamíferos utilizando estos enfoques. EPR y los ciervos ofrecen muchas ventajas, incluyendo la determinación de la estructura y los cambios dinámicos de las regiones de la proteína móvil, aunque a baja resolución, que podría ser difícil de obtener por cristalografía de rayos x o cryo-EM, y monitoreo que bloquean reversible transición (es decir, cerrado, abierto, sensibilizados y desensibilizar). Aquí, le ofrecemos protocolos para obtener miligramos de receptor transitorio detergente solubilizado funcional potencial catión subfamilia V miembro del canal 1 (TRPV1) que pueden ser etiquetados para espectroscopia EPR y ciervos.

Caracterización funcional de mínimo menos cisteína TRPV1 construir (eTRPV1) los mutantes solo-cisteína
El primer paso para estudios espectroscópicos es Ingeniero y caracterizar construcciones cisteína-menos proteína (figura 2A) que son funcionales y rendimiento bioquímicos cantidades de proteínas. eTRPV1 es funcional determinado por la proyección de imagen de Ca2 + y TEVC (<strong class="xfi...

Este artículo describe métodos específicos para obtener cantidades bioquímicas de detergente solubilizado TRPV1 para análisis espectroscópico. Los protocolos combinados proporcionan herramientas bioquímicas y biofísicas que se pueden adaptar para facilitar los estudios estructurales y funcionales de canales del ion mamíferos en un ambiente controlado por membrana.

Purificación y reconstitución de TRPV1 para análisis espectroscópico

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Aquí en el laboratorio, creemos que el uso de un enfoque espectroscópico puede ayudar a responder preguntas clave en la familia de canales iónicos de potencial receptor transitorio. Por ejemplo, la determinación de los cambios dinámicos de información asociados con la activación polimodal. La principal ventaja de este protocolo es que permite miligramos de canal iónico restante puro y funcional para la resonancia paramagnética electrónica y la epitroscopia de resonancia electrónica doble.Este método puede proporcionar información sobre los cambios conformacionales compatibles con la compuerta independiente térmica y luminosa de 3B1. También se puede aplicar a otros canales de viaje, como el 3B2, por ejemplo. Comience este procedimiento con el diseño de cebadores de mutagénesis con herramientas en línea.Prepare la reacción de PCR como se describe en el protocolo de texto y centrifugue la mezcla. Coloque los tubos en el termociclador y realice la mutagénesis de PCR utilizando los parámetros de PCR enumerados en el protocolo de texto. A continuación, añada dos microlitros de la enzima DPN1 a la reacción y mezcle.Incubar las reacciones a 37 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, realice la transformación añadiendo 75 microlitros de células competentes de E. Coli descongeladas y 10 microlitros de mezcla de PCR tratada con DPN1 a un tubo estéril de 14 mililitros preenfriado. Después de mezclar suavemente, incube la reacción en hielo durante 30 minutos.Mantenga el tubo a 42 grados centígrados durante 45 segundos y luego colóquelo inmediatamente en hielo durante dos minutos. Coloque la mezcla en una placa de agar LB que contenga carbenicilina e incube durante la noche a 37 grados centígrados. Después de cosechar colonias individuales y preparar durante la noche como se describe en el protocolo de texto, centrifuga los cultivos durante la noche a 8000 veces G durante 10 minutos.Luego, extraiga el ADN siguiendo las instrucciones de los mini kits de preparación disponibles en el mercado. Para generar el bacmid recombinante, transforme 100 microlitros de células competentes para E. Coli DH10bac con 7,5 nanogramos del vector donante recombinante. Los vectores contienen el TRPV1 de rata sin cisteína funcional mínimo, el abreviado eTRPV1 y/o mutantes de cisteína simples.Después de sembrar e incubar las celdas como se describe en el protocolo de texto, seleccione colonias blancas de dos milímetros de diámetro, ya que las colonias azules carecen del inserto de interés. Use un microscopio estereoscópico para verificar que las colonias blancas no contengan manchas azules. Coseche al menos tres colonias individuales y transfiéralas a un tubo estéril de 14 mililitros que contenga cuatro mililitros de medios LB suplementados.Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados en 250 RPM. Tome 1,5 mililitros de los cultivos durante la noche y aísle el ADN bacmid recombinante. Para generar el baculovirus recombinante, coloque un millón de células SF9 en dos milímetros de medio celular de insecto.Deje que las celdas se adhieran durante al menos 45 minutos. Después de lavar una vez con un mililitro de medio fresco, retire el medio de lavado y agregue la mezcla de reactivos de transfección de ADN a las células. Incubar las células a 27 grados centígrados durante cinco horas sin agitar.Después de la incubación, retire la mezcla de transfección y reemplácela con dos mililitros de medio de células de insecto que contengan 0,5% de suero bovino fetal. Luego, incuba las células a 27 grados centígrados durante cinco días. Transfiera los medios de cultivo celular a un tubo de centrífuga de 15 mililitros.Aísle el primer paso de material viral girando el tubo a 8000 veces G durante 15 minutos a 4 grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a un tubo centrífugo limpio de 15 mililitros y guárdelo inmediatamente a cuatro grados centígrados. De la segunda generación de material viral, pipetee un cultivo en suspensión de 25 mililitros de medios de células de insectos a un millón de células SF9 por mililitro que contengan 2% de FBS en un matraz de 125 mililitros.Agregue 25 microlitros del virus P1 al cultivo de 25 mililitros. Luego, incubar el cultivo a 27 grados centígrados durante 72 horas. Para cosechar el stock viral P2, transfiera el cultivo a un nuevo tubo de 50 mililitros y centrifuérrelo a 8000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados Celsius.Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 50 mililitros y guárdelo inmediatamente a cuatro grados centígrados. Agregue un mililitro de caldo de virus P2 al cultivo de un litro e incube a 27 grados Celsius durante 72 horas. Coseche el cultivo en suspensión de células de insectos de un litro girando a 4500 G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados.Pesa el pellet de la celda. Se espera que ronde los seis a los nueve gramos. Vuelva a suspender el pellet celular en 25 mililitros de tampón A helado en presencia de inhibidores de la proteasa.Desagregar los grupos de células para obtener una suspensión homogénea y rotar a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Rompa las celdas con un homogeneizador manual o de alta presión. Después de eliminar los restos celulares por centrifugación a 8000 veces G durante 20 minutos a cuatro grados Celsius, recoja el sobrenadante y centrifugue nuevamente a 100, 000 veces G durante 30 minutos a cuatro grados Celsius.Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y suspenda el pellet de membrana en un volumen total de 20 mililitros de tampón B helado suplementado con inhibidores de la proteasa. Alícuota de 20 mililitros de suspensión de membrana a tubos de 50 mililitros. Para realizar la purificación de proteínas, agregue tres mililitros de DDM por tubo.Gire los tubos durante dos horas a cuatro grados centígrados. Después de centrifugar la muestra a 100.000 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados, recoja el sobrenadante y agregue un mililitro de resina de amilosa limpia y húmeda. Gire la mezcla durante dos horas a cuatro grados centígrados.A continuación, cargue la mezcla de proteína amilosa en columnas de cromatografía de flujo por gravedad. Lave la resina de amilosa unida a la proteína con 10 veces el volumen del lecho de tampón C helado, seguido de 10 volúmenes de lecho de tampón frío como hielo D.Eluya la proteína eTRPV1 con fracciones de 0,5 mililitros hasta cinco mililitros de tampón D desgasificado helado suplementado con maltosa 20 milimolares. Realizar los lavados y elución a cuatro grados centígrados.Utilizando una unidad de filtro centrífugo de corte de 100 kilodalton, concentre las fracciones que contienen eTRPV1 entre dos y 2,5 miligramos por mililitro para su etiquetado. A continuación, añada un exceso molar de diez veces de la etiqueta de centrifugación MTSSL de una solución madre de 100 milimolares en DMSO a la proteína concentrada. Repita esto dos veces cada 30 minutos.Mantenga la reacción en la oscuridad a temperatura ambiente durante una hora y 30 minutos, seguida de una incubación nocturna a cuatro grados centígrados. A continuación, cargue la etiqueta de espín en eTRPV1 en una columna de cromatografía de exclusión por tamaño equilibrada en el tampón E, controlada por un sistema rápido de cromatografía líquida de proteínas. Recoja las fracciones que contienen tetrámero eTRPV1.Secar 10 miligramos de asolectina utilizando un evaporador rotativo al vacío durante una hora a 40 grados centígrados. Para hacer liposomas de asolectina, agregue un mililitro de tampón F y sonique la mezcla durante 15 minutos o hasta que la muestra sea homogénea. Desestabilizar los liposomas añadiendo DDM hasta una concentración final de dos milimolares e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.Después de ajustar la mezcla a la concentración crítica de micel DDM, como se detalla en el protocolo de texto, duplique el volumen de la mezcla de liposomas proteicos con tampón F. Retire el detergente agregando secuencialmente tres alícuotas de perlas absorbentes de poliestireno no polar a intervalos de una hora con agitación suave a temperatura ambiente. Cargue la mezcla en un filtro de columna para eliminar las perlas y transferir la mezcla de proteoliposomas a un tubo ultracentrífugo. Centrifugar las muestras a 100.000 veces G durante una hora a cuatro grados centígrados.Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 30 microlitros de tampón F y, a continuación, realice mediciones y análisis espectroscópicos. El primer punto de control es el análisis funcional de los mutantes de cisteína única antes de llevar a cabo los protocolos de expresión y purificación. Aquí, las células hek293 que expresan TRPV1 de tipo salvaje, eTRPV1 y mutantes se analizaron para detectar respuestas evocadas por capsaicina mediante imágenes de calcio de florescencia.El segundo punto de control es la caracterización bioquímica de los mutantes de cisteína única marcados con espín mediante cromatografía de exclusión por tamaño antes de proceder con la reconstitución y el análisis espectroscópico. El tercer punto de control es la caracterización funcional de los mutantes de cisteína única marcados con espín reconstituido antes de realizar el análisis espectroscópico. Las relaciones de corriente y voltaje determinadas por dos pinzas de voltaje de electrodos de ovocitos de Xenopus microinyectados con proteoliposomas que contienen espín marcado con A702C fueron desafiadas con pH5 y bloqueadas por capsazepina.Finalmente, es posible obtener las movilidades de los mutantes eTRPV1 marcados con espín determinadas por EPR de onda continua. Los primeros espectros derivados se muestran para mutantes de cisteína marcados con espín en solución de DDM y reconstituidos en liposomas de asolectina. Las distancias y movilidades de los mutantes eTRPV1 marcados con espín en detergente también fueron determinadas por DEER.Se muestra el eco de DEER y la distribución de la distancia del mutante E651C marcado con espín. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo expresar, embellecer y reconstituir un canal iónico de mamíferos para el análisis espectroscópico. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la falta de función proteica al eliminar los residuos de cisteína, el bajo rendimiento de proteínas y la inestabilidad de la proteína, ya sea en la purificación y después del etiquetado por centrifugado, y la agregación de proteínas en detergentes o liposomas.Después de su desarrollo, estos protocolos permitirán obtener cambios de distancia y dinámicos para explorar modelos mecanicistas para la compuerta polimodal TRPV1.

purification-and-reconstitution-of-trpv1-for-spectroscopic-analysis

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Se describe un protocolo simple de identificar a las proteínas del cerebro que se unen a la terminal C de longitud completa de la ATP-dependientes P2X2 receptores. La extensión y aplicación sistemática de este enfoque a todos los receptores P2X se espera que conduzca a una mejor comprensión de la señalización del receptor P2X.

Proteómica para identificar proteínas que interactúan con los canales de cationes P2X2 ligando

Isotachophoresis (ITP) es una separación sólida electrocinético y técnica de preconcentración con aplicaciones que van desde la detección de la toxina a la preparación de la muestra. Se revisan los principios físicos de la PTI y la metodología de aplicación de esta técnica a dos ejemplos de aplicaciones específicas: la separación y detección de moléculas pequeñas y purificación de ácidos nucleicos a partir de lisado de cultivo celular.

El chip Isotachophoresis para separación de iones y purificación de ácidos nucleicos

Termoforesis microescala (MST) puede ser ampliamente utilizado para la determinación de la afinidad de unión sin la purificación de la proteína diana a partir de lisados ​​celulares. El protocolo implica la sobreexpresión de la proteína GFP-fundido, lisis de las células en condiciones no desnaturalizantes, y la detección de la señal de MST en presencia de concentraciones variables del ligando.

Purificación de proteínas libre de Método de Determinación afinidad de unión por termoforesis Microscale

Para complementar los métodos comúnmente utilizados para el estudio de TRPV4, dos métodos se describen: Su mechanosensitivity puede ser estudiado por Ca 2 +-luminometría aecuorina en la levadura transgénica a partir del desafío hipo-osmótica. También puede ser examinado en TRPV4-ARN inyectado ovocitos de Xenopus por células enteras de fijación de voltaje de dos electrodos o parche abrazadera en en-célula o el modo extirpado.

Luminométricos levadura y Xenopus ovocitos electrofisiológicos Exámenes del mecanosensibilidad Molecular de TRPV4

Los pasos clave de la función de las proteínas, en particular los cambios conformacionales de la columna vertebral y las reacciones de transferencia de protones, a menudo tienen lugar en la escala de tiempo de microsegundos a milisegundos. Estos procesos dinámicos pueden estudiarse mediante espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier de barrido escalonado resuelto en el tiempo, en particular para proteínas cuya función es desencadenada por la luz.

Transferencia de Protones y Proteína Conformación Dinámica de proteínas fotosensibles por Time resuelto-Step-scan transformada de Fourier espectroscopia de infrarrojo

La reconstitución de la proteína transmembrana, KvAP, en vesículas unilamelares gigantes (GUVs) se demostró por dos métodos de deshidratación-rehidratación - electroformation e inflamación gel asistida. En ambos métodos, pequeñas vesículas unilamelares que contienen la proteína se fusionan para formar GUVs que luego pueden ser estudiadas mediante microscopía de fluorescencia y la electrofisiología patch-clamp.

Reconstitución de una proteína transmembrana, el canal iónico dependiente de voltaje, KvAP, en Gigante vesículas unilamelares para Microscopía y Patch Clamp Estudios

Este manuscrito describe cómo realizar ensayos basados en la Transferencia de Energía por Resonancia de Förster (FRET) (molécula única) para medir la dinámica de unión entre el receptor de antígeno de células T (TCR) y las moléculas MHC cargadas de péptidos antigénicos a medida que ocurren dentro de la sinapsis inmunológica de una célula T en contacto con una bicapa lipídica plana funcionalizada con soporte.

Medición de TCR-pMHC Encuadernación<em&gt; In Situ</em&gt; Usando un ensayo de microscopía basada en FRET

El estudio de los canales iónicos a través de un sistema de expresión de forma heteróloga se ha convertido en una técnica básica en la investigación biomédica. En este manuscrito, se presenta un método eficiente de tiempo para conseguir la expresión del canal iónico fuertemente controlada mediante la realización de la transfección transitoria bajo el control de un promotor inducible.

Expresión Ion Channel controlable a través de la transfección transitoria inducible

Este protocolo describe las técnicas utilizadas para determinar las estructuras de canal de iones por microscopia del cryo-electrón, incluyendo un sistema de baculovirus para expresar eficientemente genes en células de mamíferos con el mínimo esfuerzo y toxicidad, extracción de proteínas, purificación, y comprobación de la calidad, preparación de la red muestra y proyección, así como recopilación de datos y procesamiento.

Expresión y purificación de los humanos sensibles a lípido catiónico canal TRPC3 para la determinación estructural por microscopia del Cryo-electrón de solo-partícula

Basado en el mecanismo de ensamblaje del complejo de proteínas INAD, en este protocolo, se desarrolló una estrategia modificada de purificación de afinidad más competencia para purificar el canal endógeno Drosophila TRP.

Purificación de los canales potenciales del receptor transitorio de Drosophila endógeno

Este protocolo describe un enfoque de procesamiento de imágenes basado en iSCAT y seguimiento de una sola partícula que permite la investigación simultánea de la masa molecular y el comportamiento difusivo de las macromoléculas que interactúan con las membranas lipídicas. Las instrucciones paso a paso para la preparación de muestras, la conversión de masa a contraste, la adquisición de películas y el posprocesamiento se proporcionan junto con instrucciones para prevenir posibles trampas.

Seguimiento de partículas sensibles a la masa para caracterizar la dinámica de macromoléculas asociada a la membrana

Aprende a purificar y reconstituir TRPV1 para análisis espectroscópico mediante resonancia paramagnética electrónica. Este protocolo permite obtener cantidades miligramo de canal iónico funcional para estudiar cambios conformacionales.

Purificación y reconstitución de TRPV1 para análisis espectroscópico

Explorar más videos