Sistema hidropónico de un Flexible bajo costo para evaluar las respuestas de la planta a moléculas pequeñas en condiciones estériles

Se optimizó con éxito un sistema hidropónico in vitro simple, versátil y de bajo costo, lo que permitió experimentos a gran escala en condiciones estériles. Este sistema facilita la aplicación de productos químicos en solución y su absorción eficiente por las raíces para estudios moleculares, bioquímicos y fisiológicos. Demostramos que este sistema era altamente eficiente en la obtención de plántulas homogéneas a lo largo del desarrollo inicial, así como en la separación de raíces y brotes utilizando semillas de arabidopsis thaliana.

Los siguientes elementos son necesarios para construir el sistema hidropónico y cultivar plantas en condiciones estériles y controladas: 7% de etanol, 10% de solución de lejía, polisorbato 20, medio MS incluyendo vitaminas. MES monohidrato, agar, hidróxido de potasio.

Campana de flujo laminar, placa calefactora, cámara de crecimiento. Cajas de plástico desechables, placas de Petri de vidrio estéril, cinta adhesiva, puntas de pipeta estériles de 200 y 300 microlitros, tijeras, pipeta multicanal de 300 microlitros, pipeta de 200 microlitros, hoja de bisturí, pinzas y gradillas de puntas de pipeta de 200 microlitros. Es crucial que la punta de la pipeta plana tenga un área para llenarla con el medio sólido.

Esterilizar las gradillas de puntas de pipeta sin tapas que se utilizarán como mini-tanques en el autoclave a 121 grados durante 20 minutos. Con el fin de evitar la contaminación, todos los materiales mencionados anteriormente se esterilizaron en el autoclave. Cuando esto no era posible, como en el caso de las cajas de plástico desechables, los materiales se limpiaban con etanol al 7% antes de entrar en la campana de flujo laminar.

Si la campana lo permite, se puede encender la luz ultravioleta durante 10 minutos antes del montaje del sistema hidropónico. Selle la superficie superior de la punta de la pipeta con la cinta adhesiva. Si es posible, déjelos bajo luz ultravioleta durante 10 minutos.

A continuación, añada 108 microlitros de medio sólido fundido en cada pocillo utilizando una pipeta multicanal. Si está preparando muchos tanques, use una placa caliente para evitar que el medio MS se solidifique. Deje que el medio se solidifique por completo, aproximadamente 30 minutos.

Durante el período de solidificación, se puede encender la luz ultravioleta. Llene completamente la caja de puntas con medio de cultivo líquido. Garantizar el cierre compacto entre medios sólidos y líquidos.

Retire las cintas adhesivas de la superficie superior de la punta de la pipeta y colóquela en la gradilla con cuidado. El sistema hidropónico ya está listo para recibir las semillas esterilizadas. La esterilización con lejía líquida descrita aquí es un método práctico para esterilizar semillas.

En primer lugar, coloque 500 semillas de arabidopsis en un microtubo de 1,5 ml. Utilice tantos micro tubos como sea necesario de acuerdo con el número de plantas requeridas para el experimento. Lavar las semillas con etanol al 7% durante dos minutos con agitación.

Retire el etanol con cuidado. Añadir un ml de solución de lejía al 10% que contenga dos microlitros de detergente polisorbato 20. Agita durante cinco minutos.

Retire la solución con cuidado. Finalmente, enjuague las semillas con agua destilada esterilizada hasta eliminar por completo todos los residuos de lejía, aproximadamente cinco veces. Este protocolo es factible para arabidopsis, sin embargo, este sistema también se puede utilizar para otras especies de plantas.

Para ello, dicho procedimiento de esterilización debe ser modificado de acuerdo con el requerimiento de la especie. Después de la esterilización de la superficie, las semillas se sumergieron en agua destilada estéril y se estratificaron a cuatro grados en la oscuridad durante cinco días para sincronizar la germinación. Cortar ligeramente la extremidad de la punta de la pipeta de 200 microlitros con la ayuda de un bisturí estéril.

Pipetear las semillas de arabidopsis en el medio de cultivo sólido en la superficie superior de la punta de la pipeta. Tenga cuidado de que el medio no se desprenda del plano, de lo contrario, las semillas quedarán a la sombra y las plántulas no crecerán correctamente. Almacene tantos minitanques como sea posible dentro de una caja de plástico desechable para mantener una alta humedad y el ambiente libre de microorganismos.

Selle la caja de plástico desechable con cinta adhesiva. Los sistemas hidropónicos ya están listos para entrar en la cámara de crecimiento. Este sistema hidropónico se desarrolló inicialmente para facilitar la administración de productos químicos a las plantas, como compuestos marcados con isótopos, que en general son muy costosos para ser aplicados en experimentos a gran escala.

Como prueba de concepto, utilizamos el inhibidor competitivo de ATP AZD8055, que se dirige específicamente al sitio de unión de ATP de la proteína quinasa rapamicina diana. La quinasa TOR es un regulador importante que integra la detección de nutrientes y la señalización de energía para promover la proliferación y el crecimiento celular. Con el fin de evaluar las respuestas primarias de inhibición de TOR mediada por AZD, las semillas de arabidopsis se cultivaron hidropónicamente hasta la etapa de desarrollo deseada bajo un fotoperíodo de 12 horas.

Al final de la noche se sustituyó el medio fresco que contenía dos micromolares de AZD o 0,05% de DMSO como control en los tanques hidropónicos. Las plántulas se cosecharon en diferentes momentos después del tratamiento, se separaron en raíces y brotes congelados en nitrógeno líquido, se molieron hasta obtener un polvo fino y se almacenaron a menos 80 grados hasta su uso. El patrón de fosforilación de la proteína ribosómica S6 quinasa, RPS6, una de las dianas conocidas de la vía TOR.

La inmunotransferencia muestra la cantidad de RPS6 total y fosforilado en las raíces, el gráfico A y los brotes, gráfico B. La represión de la fosforilación en presencia de ADZ855 se produjo tan pronto como 30 minutos después del tratamiento farmacológico tanto en las raíces como en los brotes, lo que demuestra que, en las condiciones experimentales utilizadas, ADZ también ha demostrado ser un potente inhibidor de TOR que reprime rápidamente su actividad quinasa. Las líneas de arabidopsis transgénicas con expresión reducida del gen TOR o componentes del complejo TOR presentan un claro fenotipo de exceso de almidón. El análisis cualitativo del almidón utilizando la solución de Lugol revela el patrón esperado de acumulación y degradación del almidón durante el ciclo.

Las plántulas que no recibieron la aplicación del MSO o AZD855 no mostraron mayor acumulación de almidón en sus hojas al final de la noche, y la acumulación de almidón en las plantas control, el MSO, fue consistente con la literatura. Además, las plantas tratadas con AZD presentaron mayor cantidad de almidón remanente al final de la noche en comparación con las plántulas control. Estos resultados indican la utilidad del sistema hidropónico propuesto en el cultivo de plántulas que imitan las condiciones fisiológicas.

El almidón se acumula en las hojas durante el día y se removiliza durante la noche para mantener las actividades metabólicas. En condiciones normales, solo queda una pequeña fracción de almidón, entre el 5 y el 10% de la cantidad total después del final del día. Estos resultados comprueban que el fenotipo de los almidones observado bajo la represión de TOR se produce a lo largo de todo el ciclo.

Las plantas cultivadas hidropónicamente se compararon con plántulas que cultivan sustrato hortícola en condiciones climáticas muy similares en cuanto al nivel de expresión del ácido abscísico tienen el factor de unión al elemento sensible tres, el gen ABF3, que se muestra en la figura 5-A. La expresión de ABF3 se correlaciona directamente con los niveles internos de ABA, una clase de hormonas ampliamente conocida como marcador debido a su papel en múltiples respuestas de estrés abiótico. Aunque las plantas cultivadas hidropónicamente presentaron un aumento significativo en la expresión de ABF3 en comparación con las plantas cultivadas en el suelo, los niveles de expresión de asparagina sintetasa un ASN1, no se vieron afectados por los tratamientos MSO o AZD mostrados en la figura 5-B.

Sin embargo, la expresión de trehalosa fosfato sintasa cinco, TPS5, más un aumento significativo después de ocho horas de represión de TOR. ASN1 y TPS5 responden a niveles bajos y altos de azúcar respectivamente, lo que sugiere que estas plantas no experimentaron estrés genético. Hemos logrado utilizar este sistema para evaluar la aplicación de moléculas pequeñas en plantas.

En resumen, este sistema hidropónico posee muchas ventajas porque es muy rápido y fácil de ensamblar, y tiene un bajo costo, ya que los componentes principales son baratos y se pueden reutilizar ampliamente. Además, este sistema es versátil, ya que permite el estudio de plántulas intactas o distinciones a lo largo del desarrollo de la planta, y es altamente escalable, lo que permite el cultivo de una gran cantidad de plantas en un área muy pequeña.