Name: Una pantalla de 2 híbrido de levadura en lote para comparar las interacciones proteína (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Aprende a realizar pantallas de 2 híbridos de levadura en lote para comparar perfiles de interacción proteína-proteína mediante secuenciación profunda. Este método permite identificar interactomas diferenciales en biología molecular y celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos al personal en el Instituto de genética humana para secuenciación y NGS biblioteca preparación. Damos las gracias por su experiencia en la preparación de fragmentos de la biblioteca genómica de la biblioteca de plásmido Y2H aquí Einat Snir. Este trabajo fue financiado por National Institutes of Health: NIH R21 EB021870-01A1 y beca de proyecto de investigación NSF: 1517110.

<ol><li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li>
<li>Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+two-hybrid%2C+a+powerful+tool+for+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).</li>
<li>Vidal, M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+two-hybrid+assay%3A+still+finding+connections+after+25+years%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years.</a> Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).</li>
<li>Pashkova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEEPN+as+an+Approach+for+Batch+Processing+of+Yeast+2-Hybrid+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions.</a> Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).</li>
<li>Rajagopala, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Protein-Protein+Interactome+Networks+Using+Yeast+Two-Hybrid+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).</li>
<li>Weimann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Y2H-seq+approach+defines+the+human+protein+methyltransferase+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome.</a> Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).</li>
<li>Yachie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pooled-matrix+protein+interaction+screens+using+Barcode+Fusion+Genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics.</a> Molecular Systems Biology. 12 (4), 863(2016).</li>
<li>Trigg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CrY2H-seq%3A+a+massively+multiplexed+assay+for+deep-coverage+interactome+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping.</a> Nature Methods. , (2017).</li>
<li>Estojak, J., Brent, R., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+two-hybrid+affinity+data+with+in+vitro+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5820-5829 (1995).</li>
<li>Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+yeast+two-hybrid+systems+using+the+interactions+of+bacterial+motility+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins.</a> Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).</li>
<li>James, P., Halladay, J., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+libraries+and+a+host+strain+designed+for+highly+efficient+two-hybrid+selection+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast.</a> Genetics. 144 (4), 1425-1436 (1996).</li>
<li>Barbas, C. F. 3rd, Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitation of DNA and RNA.</a> CSH Protoc. 2007, pdb ip47(2007).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22485921">SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (4), (2006).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Alegria-Schaffer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting+using+chemiluminescent+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Western blotting using chemiluminescent substrates.</a> Methods in Enzymology. 541, 251-259 (2014).</li>
<li>Plank, J. Practical application of Phenol/Chloroform extraction. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://bitesizebio.com/3651/practical-application-of-phenolchloroform-extraction/">http://bitesizebio.com/3651/practical-application-of-phenolchloroform-extraction/</a> (2018).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).</li>
<li>Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p21+Cdk-interacting+protein+Cip1+is+a+potent+inhibitor+of+G1+cyclin-dependent+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases.</a> Cell. 75 (4), 805-816 (1993).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

Aquí ofrecemos a una guía de cómo llevar a cabo ensayos de Y2H en lote usando métodos optimizados. Hay algunos pasos críticos en el procedimiento para garantizar que la población de levaduras que se colocaba en la selección es representante de la biblioteca de partida y que suficiente de la población a partir de la levadura se utiliza para someterse a la selección para limitar la variabilidad . Lo importante, estos criterios son relativamente fáciles de lograr junto a adaptar los métodos y materiales para un ensayo de Y2...

Una comprensión completa de los procesos biológicos de la célula se basa en la búsqueda de las redes de interacción de proteínas que subyacen sus mecanismos moleculares. Un enfoque para identificar las interacciones entre proteínas es la levadura 2-híbrido (Y2H), que trabaja montando un factor de transcripción quimérica de funcionamiento una vez que dos dominios de la proteína de interés unen unos a otros1. Una típica pantalla de Y2H se realiza mediante la creación de una población de levaduras que alberga tanto una biblioteca de plásmidos que codifican las proteínas interactúan con fusible para un activador transcripcional (ej., proteína de la fusión de presas) y un plásmido determinado 'cebo' compuesta por la proteína de interés fusionado a un dominio de unión a ADN (por ejemplo, el dominio de Gal4 DNA-que atan que se une a la secuencia de activación Gal4-upstream). Una de las principales ventajas del enfoque Y2H es que es relativamente fácil y barato para llevar a cabo en un laboratorio típico equipado para trabajo biológico molecular de rutina2. Sin embargo, cuando tradicionalmente se realiza, un usuario muestras de colonias individuales que surgen en la selección para una interacción positiva de Y2H. Seriamente, esto limita el número de clones 'presa' de biblioteca que puede ser examinado. Este problema se agrava cuando la abundancia de una presa particular de interacción es muy alta en relación con los demás, disminuyendo la posibilidad de detectar la interacción de plásmidos de presas de baja abundancia.
Una solución para usar el principio de Y2H en cobertura del proteoma es el uso de un enfoque con formato de matriz en una matriz que contiene plásmidos conocido presa individual puede ser interrogada digitalmente. Sin embargo, este enfoque requiere una infraestructura que no es fácilmente accesible o rentable a investigadores individuales que estén interesados en definir el interactoma de un pequeño número de proteínas o dominios3. Además, bibliotecas de presa muy complejo que pueden codificar múltiples fragmentos de proteínas interactuantes ampliaría el tamaño de tales matrices matriz tamaño práctico. Una alternativa es realizar ensayos con complejo bibliotecas en lotes y evaluar la presencia de clones interactúan mediante secuenciación masiva en paralelo alto rendimiento4. Esto puede aplicarse para analizar la presencia de plásmidos de presas que se presentan en varias colonias con un típico Y2H formato enfoque en cual levadura las células vivienda un par de interacción de proteínas de fusión pueden crecer en una placa de5,6. Esta idea general se puede acentuarse para aumentar la consulta de ambos múltiples cebo y presa de componentes en el mismo tiempo7,8.
Sin embargo, muchas investigaciones requieren que un más fácil todavía centra más esfuerzo en pocos proteína 'cebos' y pueden beneficiarse más de una consulta exhaustiva y semi-cuantitativa de una sola presa complejo biblioteca. Hemos desarrollado y validado un método para llevar a cabo estudios de interacción de proteínas de gran escala usando un principio Y2H en lote formato4. Esto utiliza la tasa de expansión de un plásmido determinado presa como un proxy para la fuerza relativa de Y2H interacción9. Profundo secuenciación de los plásmidos dentro de una población sometida a un crecimiento normal o las condiciones de crecimiento selectivo produce un mapa completo de clones que producen interacciones de Y2H fuertes y débiles. El repertorio de interactianos puede ser obtenido y comparado directamente a través de múltiples plásmidos de cebo. El flujo resultante denominado DEEPN (enriquecimiento dinámico para la evaluación de redes de proteínas) así puede utilizarse para identificar interactomes diferencial de las mismas bibliotecas de presa para identificar proteínas, permitiendo la comparación entre una proteína y otra.
Aquí, demostramos DEEPN e introducir mejoras en los métodos de laboratorio que facilitan su uso, que se detallan en la figura 1. Las mejoras significativas incluyen:
Generación de las poblaciones de levadura presas. Uno de los requisitos clave de DEEPN está generando poblaciones de levaduras con cebo diferentes plásmidos que tienen la misma distribución de las bibliotecas de la presa de plásmido. Poblaciones de referencia equivalente de la biblioteca de plásmido de presa son esenciales para hacer comparaciones exactas entre los interactomes de diferentes cebos. Esto se logra mejor cuando un plásmido de biblioteca ya se encuentra en una población de levadura haploide y mover un plásmido determinado cebo en que la población se consigue por el apareamiento para producir un diploide. Aquí, ofrecemos a una guía clara de cómo hacer estas poblaciones usando librerías comerciales ubicados en levadura haploide. Aunque hemos encontrado métodos que generan un alto número de diploides, la eficiencia global de apareamiento de estas cepas de levadura que contiene la biblioteca comercial fue baja. Por lo tanto, construimos una nueva cepa que puede albergar bibliotecas presa que cede más diploides por reacción de acoplamiento.
Nuevo sistema de plásmidos de cebo. Muchos plásmidos actuales que expresan proteínas de la fusión de la 'carnada' compuestas de la proteína de interés y un dominio DNA-que atan son 2µ, lo que les permite ampliar su número de copia. Este número de la copia puede ser muy variable en la población y conducir a la variabilidad en la respuesta transcripcional de Y2H. Esto a su vez podría sesgar la capacidad para medir la fuerza de una interacción de proteína determinada basada en la respuesta de crecimiento de células en la selección. Esto puede ser en parte dirección mediante el uso de un plásmido de copia baja, algunos de los cuales se han descrito previamente como el pDEST32 disponible en el mercado10. Construimos un nuevo plásmido de cebo (pTEF-GBD) que produce proteínas de fusión Gal4-Unión al ADN dominio dentro de un plásmido de copia baja basada en el centrómero de TRP1 portadores del gen de resistencia Kanr que también facilita la clonación de fragmentos de cebo tanto aguas arriba y aguas abajo del dominio de unión al ADN de Gal4.
Biblioteca de fragmento de nueva alta densidad Y2H. Había construido un nuevo plásmido a las bibliotecas de casa Y2H presa y usado para construir una biblioteca de Y2H altamente compleja hecha de esquilado al azar fragmentos de la DNA genomic de Saccharomyces cerevisiae. Análisis de la secuencia demostró que esta biblioteca tenía sobre 1 millón de diferentes elementos, mucho más complejos que descrita levadura genómica Y2H plásmido bibliotecas11. Con esta nueva biblioteca, hemos sido capaces de demostrar que el flujo de trabajo DEEPN es lo suficientemente robusto como para dar cabida a las bibliotecas del complejo con muchos plásmidos diferentes en una manera fiable y reproducible.

<table><tbody><tr><td>Illumina HiSeq 4000</td><td>Plataforma de secuenciación profunda</td><td>Illumina</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos monoclonales anti-HA</td><td>Biolegend</td><td>901514</td><td>Anticuerpo primario para detectar la expresión de HA en construcciones pGal4AD Anticuerpos</td></tr><tr><td>policlonales anti-myc</td><td>QED Biosciences Inc</td><td>18826</td><td>Anticuerpo primario para detectar la expresión de MYC en construcciones pTEF-GBD</td></tr><tr><td>NarI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0191S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3236S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicol 3350, polvo</td><td>J.T. Baker</td><td>U2211-08</td><td></td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA</td><td>Trevigen, Inc vendido por Fisher Scientific</td><td>50-948-286</td><td>ADN portador para la transformación de levaduras sección 3.2.1.</td></tr><tr><td>Monosulfato de kanamicina Productos de</td><td>investigación internacionales</td><td>K22000</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarosa</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td>utilizado para hacer geles de agarosa de ADN</td></tr><tr>Productos de investigación<td>de cloruro de sodio</td><td>Internacional</td><td>S23025</td><td></td></tr><tr>Productos de investigación de<td>triptona</td><td>Internacional</td><td>T60060</td><td></td></tr><tr><td>Productos de investigación de D-sorbitol</td><td>Internacional</td><td>S23080</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de litio dihidratado</td><td>MP Biomedicals</td><td>155256</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de calcio</td><td>ThermoFisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Sal de sodio</td> Productos <td>de investigación internacionales</td><td>E57020</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura en polvo Productos</td> de <td>investigación internacionales</td><td>Y20020</td><td></td></tr><tr><td>Base de nitrógeno de levadura (sulfato de amonio) sin aminoácidos</td><td>Research Products International</td><td>Y20040</td><td></td></tr><tr><td>CSM-TRP-LEU+40ADE</td><td>para</td><td>DCS0789</td><td></td></tr><tr><td>medio CSM-Trp-LEU-HIS+40ADE</td><td>para</td><td>DCS1169</td><td></td></tr><tr><td>medio CSM-Leu-Met</td><td>para medio</td><td>DCS0549</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Trp-Met</td><td>Bio 101, Inc</td><td>4520-922</td><td></td></tr><tr><td>L-metionina</td><td>para medio</td><td>DOC0168</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Research Products International</td><td>A11500</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Research Products International</td><td>G32045</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>utilizado para la fabricación de placas de medios en la sección 1</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Research Products International</td><td>P20240</td><td></td></tr><tr><td>3-amino-1,2,4 Triazol</td><td>Sigma</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>2- Mercaptoehanol (BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>USBiológico</td><td>Z1004</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio dibásico</td><td>Sigma</td><td>P8281</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:Cloroformo:IAA</td><td>Ambion</td><td>AM9732</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238074</td><td></td></tr><tr><td>Laboratorios de descontaminación de</td><td>etanol</td>, INC <td>2716</td><td></td></tr><tr><td>ARNasa A</td><td>ThermoFisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Research Products International</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Research Products International</td><td>L22010</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Gibco</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>azul de bromofenol</td><td>Amresco</td><td>449</td><td></td></tr><tr><td>Kit de clonación de ensamblaje de Gibson</td><td>New England Biolabs</td><td>E5510S</td><td>Método de ensamblaje rápido para la clonación de plásmidos en la sección 2</td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541S</td><td>Se utiliza para la amplificación de productos para el ensamblaje de Gibson en la sección 2.3, así como para la preparación de muestras para la secuenciación profunda de DEEPN en la sección 6.2.1</td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Amresco</td><td>0492-5G</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificación de PCR QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Se utiliza para la purificación de productos de PCR en la sección 6.2.3</td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel de ADN Qiaquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Se utiliza para la purificación de pTEF-GBD digerido en la sección 2.1</td></tr><tr><td>Kit KAPA Hyper Prep KAPA</td><td>Biosystems</td><td>KK8500</td><td>kit de preparación para la secuenciación profunda</td></tr><tr><td>Optimización de codones</td><td>http://www.jcat.de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimización de codones</td><td>https://www.idtdna.com/CodonOpt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gBlocks</td><td>Integrated DNA Technologies Fragmentos</td><td></td><td>de ADN utilizados para la clonación en la sección 2.2</td></tr><tr><td>Strings</td> Fragmentos de ADN de <td>Thermofisher</td><td></td><td>utilizados para la clonación en la sección 2.2</td></tr><tr><td>GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit EPOCH</td><td>Life Sciences</td><td></td><td>Utilizado para preparar cantidades de ADN en la sección 2.3</td></tr><tr><td>Covaris E220</td><td>Covaris</td><td></td><td>ultrasonido de alto rendimiento en sección 7</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5'- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3'</td><td>Tecnologías de ADN integradas o Thermofisher</td><td></td><td>utilizadas para la amplificación y secuenciación de PCR 5' inserto pTEF-GBD durante la construcción de plásmidos</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5'-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3'</td><td>Tecnologías de ADN integradas o Thermofisher</td><td></td><td>utilizadas para la amplificación y secuenciación de PCR 5' insertan pTEF-GBD durante la construcción de plásmidos</td></tr><tr><td>oligo nucelotida 5'-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTCTC-3'</td><td>Tecnologías de ADN integradas o Thermofisher</td><td></td><td>utilizadas para la amplificación y secuenciación de PCR 3' inserto pTEF-GBD durante la construcción de plásmidos</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5'-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3'</td><td>Tecnologías de ADN integradas o Thermofisher</td><td></td><td>utilizadas para la amplificación y secuenciación de PCR 3' inserto pTEF-GBD durante la construcción de plásmidos</td></tr><tr><td>oligonucleótido 5'-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3'</td><td>Tecnologías de ADN integradas o Thermofisher</td><td></td><td>5' Pimer utilizado para la amplificación de insertos de pGAL4AD</td></tr><tr><td>oligonucelotide 5'-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3'</td><td>Tecnologías de ADN integradas o Thermofisher</td><td></td><td>3' Pimer utilizado para la amplificación de insertos de pGAL4AD</td></tr><tr><td>oligonucelotide 5'-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3'</td><td>Integrated DNA Technologies o Thermofisher</td><td></td><td>5' Pimer utilizado para la amplificación de insertos de pGADT7</td></tr><tr><td>oligonucelotide 5'- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3'</td><td>Integrated DNA Technologies o Thermofisher</td><td></td><td>3' Pimer utilizado para la amplificación de insertos de la cepa de levadura pGADT7</td></tr><tr><td>PJ69-4A MatA</td><td>http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Bibliotecas genómicas y una cepa huésped diseñada para la selección altamente eficiente de dos híbridos en levadura. GENÉTICA 1996 144:1425-1436</td><td></td><td>MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7</td></tr><tr><td>pTEF-GBD</td><td>Dr. Robert Piper Lab</td><td></td><td>Gal4-DNA binding doimain expression plasmid</td></tr><tr><td>pGal4AD (pPL6343)</td><td>Dr. Robert Piper Lab</td><td></td><td>Plásmido de expresión de dominio de activación Gal4</td></tr><tr><td>placas de Petri de 100 mm</td><td>Kord-Vallmark vendido por VWR</td><td>2900</td><td></td></tr><tr><td>Matraz PYREX Erlenmeyer de 125 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63270</td><td></td></tr><tr><td>Matraz PYREX Erlenmeyer de 250 mL</td><td>Matraz Pyrex</td><td>S63271</td><td></td></tr><tr><td>1.000 mL Matraz PYREX Erlenmeyer</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63274</td><td></td></tr><tr><td>Matraz PYREX Erlenmeyer de 2.000 mL Matraz Fisher</td><td>Scientific</td><td>S63275</td><td></td></tr><tr><td>20 X 150 mm Tubo de cultivo desechable</td><td>Thermofisher</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>pipeta</td><td>Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipeta serológica</td><td>Denville</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipeta serológica</td><td>Denville</td><td>P7128</td><td></td></tr><tr><td>25 mL pipeta serológica</td><td>Denville</td><td>P7129</td><td></td></tr><tr><td>1.000 mL PYREX Vaso de precipitados Griffin</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-540P</td><td></td></tr><tr><td>1.000 mL PYREX Botella de almacenamiento de medios utilizables</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-414-1D</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro graduado de 1.000 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-572-6G</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax 190</td><td>Dispositivos</td><td></td> moleculares <td>utilizados para medir la densidad óptica de las células</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>Espectrofotómetro utilizado para cuantificar la cantidad de ADN</td></tr><tr><td>UV electrónico transiluminador</td><td>Ultra Lum</td><td>MEB 20</td><td>utilizado para visualizar el ADN en un gel de agarosa de bromuro de etidio</td></tr><tr><td>P1000 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td></td></tr><tr><td>P200 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123601G</td><td></td></tr><tr><td>P20 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123600G</td><td></td></tr><tr><td>P10 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F144802G</td><td></td></tr><tr><td>1250 y micro; L Puntas de pipeta de baja retención</td><td>GeneMate</td><td>P-1236-1250</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; Puntas de pipeta de retención LLow</td><td>VWR</td><td>10017-044</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L XL Puntas de pipeta de baja retención</td><td>VWR</td><td>10017-042</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de 50 ml</td><td>VWR</td><td>490001-627</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de 15 ml</td><td>VWR</td><td>490001-621</td><td></td></tr><tr><td>Rascador de células</td><td>Denville Scientific</td><td>TC9310</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Tubos de microcentrífuga</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fluka Analytical</td><td>318949-1L</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>J.T. Baker</td><td>5674-02</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores de madera</td><td>Solon Care</td><td>55900</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga Eppendorf 5424</td><td>Microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-400-005</td></tr><tr><td>Sorvall ST16R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004381</td><td>centrífuga de sobremesa</td></tr><tr><td>Amersham ECL Rabbit IgG, Ab entero ligado a HRP (de burro)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-1ML</td><td>Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>Amersham ECL IgG de ratón, Ab entero ligado a HRP (de ovejas)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-1ML</td><td>Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Sustrato quimioluminiscente</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34080</td><td>ECL</td></tr><tr><td>Incubadora Isotemp</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Incubadora</td></tr><tr><td>Mutitron 2</td><td>INFORS HT</td><td></td><td>Incubadora de agitación</td></tr><tr><td>Isotemp Baño de agua con control digital modelo 205</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>baño de agua</td></tr><tr><td>Y2H Biblioteca de ADNc para ratones en Y187 (tejido pan)</td><td>Clontech</td><td>630482</td><td>Biblioteca de ADNc disponible comercialmente</td>Biblioteca de</tr><tr><td>ADNc para ratones Y2H en Y187 (cerebro de ratón)</td><td>Clontech</td><td>630488</td><td>Biblioteca de ADNc disponible comercialmente</td></tr><tr><td>Vector</td> <td>pGADT7 ADClontech</td><td>630442</td><td>vector AD disponible comercialmente que alberga muchas bibliotecas de ADNc</td></tr><tr><td>pGBKT7 Vector DNA-BD</td><td>Clontech</td><td>630443</td><td>disponible comercialmente Vector DNA-BD</td></tr><tr><td>Biolase ADN polimerasa</td><td>Bioline</td><td>BIO-21042</td><td>ADN polimerasa utilizada para la sección 2.4</td></tr><tr><td>Termociclador GeneMate GCL-60 Máquina</td> de <td>PCR</td><td>BioExpress</td><td>P-6050-60</td></tr><tr><td>Tubos de PCR TempAssure 0,5 mL</td><td>Científico de EE. UU</td>. <td>1405-8100</td><td></td></tr></tbody></table>

una pantalla de 2 híbrido de levadura en lote para comparar las interacciones proteína

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Detección de interacciones proteína-proteína usando el análisis de 2 híbrido de levadura ha sido una herramienta eficaz, pero su uso en gran parte se ha limitado al descubrimiento de interactianos de alta afinidad que se enriquecen altamente en la biblioteca de los candidatos interactúan. En un formato tradicional, el ensayo de 2-híbrido de la levadura puede producir también muchas colonias a analizar cuando se llevó a cabo en baja estrigencia donde podrían hallarse los interactianos de baja afinidad. Por otra parte, sin un interrogatorio amplio y completo de la misma biblioteca contra cebos diferentes plásmidos, no se puede lograr un análisis comparativo. Aunque algunos de estos problemas pueden abordarse utilizando bibliotecas de vestida de presa, el costo y la infraestructura necesaria para el funcionamiento de estas pantallas pueden ser prohibitivos. Como alternativa, hemos adaptado el ensayo 2-híbrido de levadura para descubrir al mismo tiempo decenas de transitorios y las interacciones de proteínas estáticas dentro de una sola pantalla utilizando una estrategia denominada DEEPN (enriquecimiento dinámico para la evaluación de redes de proteínas), que incorpora la secuencia de la DNA de alto rendimiento y cálculo para seguir la evolución de una población de plásmidos que codifican a socios interactúan. Aquí, describimos modificado para requisitos particulares los reactivos y protocolos que permiten una pantalla DEEPN para ejecutar fácil y rentable.

El ensayo de Y2H ha sido ampliamente utilizado para la búsqueda de las interacciones proteína: proteína y se han desarrollado varias adaptaciones y sistemas. En su mayor parte, las mismas consideraciones que ayudan a asegurar el éxito con estos métodos anteriores son importantes para DEEPN. Algunos de los puntos de referencia importantes son: garantizar la expresión de dominio DNA-obligatorio proteínas de fusión, asegurando un bajo fondo de falso crecimiento su + en los diploides que cont...

Procesamiento por lotes de pantallas 2-híbrido de levadura permite la comparación directa de los perfiles de la interacción de múltiples proteínas de cebo con un sistema altamente complejo presa de proteínas de fusión. Aquí, describimos métodos de refinado, nuevos reactivos y cómo implementar su uso para esas pantallas.

Una pantalla de 2 híbrido de levadura en lote para comparar las interacciones proteína

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Este método utiliza el principio del sistema híbrido de levadura 2 en ambas poblaciones para identificar interacciones proteína-proteína que responden a preguntas clave sobre una variedad de procesos moleculares y celulares. Esta técnica aprovecha la secuenciación profunda para ver las interacciones de una proteína frente a otra. Dado que este enfoque está orientado a hacer comparaciones paralelas, puede identificar conjuntos de proteínas que interactúan con una proteína frente a otra o diferentes confirmaciones de la misma proteína o mientras se tipifica una versión mutante causante de una enfermedad, para revelar interactomas diferenciales.Se construyó un nuevo plásmido de cebo híbrido de levadura 2 pTEF-GBD para este procedimiento, como se describe en el protocolo de texto. Este plásmido produce proteínas de fusión del dominio de unión al ADN Gal4 dentro de un plásmido de baja copia basado en centrómero TRP1 que lleva el gen de resistencia a la kanamicina que también permite la clonación de fragmentos de cebo tanto aguas arriba como aguas abajo del dominio de unión al ADN Gal4. Este plásmido de cebo se utilizó para transformar la levadura MATa, y la expresión de las proteínas de

a-yeast-2-hybrid-screen-in-batch-to-compare-protein-interactions

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

MITO permite la detección sensible de las interacciones transitoria y estable entre las proteínas que se expresan en el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae. Se ha aplicado con éxito para estudiar las proteínas integrales de membrana exógenos y la levadura con el fin de identificar a sus socios que interactúan de un modo de alto rendimiento.

Split-ubiquitina levadura membrana base de dos híbridos (MITO) del sistema: Una poderosa herramienta para identificar interacciones proteína-proteína

Hemos desarrollado completa e imparcial en todo el genoma para comprender las pantallas de genes de drogas y las interacciones genético-ambientales. Métodos para la detección de estas colecciones mutantes se presentan.

Pantallas competitiva Genómica de Bibliotecas de levadura con código de barras

Este video muestra el ensayo de dos híbridos de levadura para detectar autointeracciones de proteínas específicas. En este ensayo, la proteína de interés se marca con dos dominios de un factor de transcripción que codifica la enzima β-galactosidasa. Cuando las dos proteínas interactúan, esto hace que la transcripción y la traducción formen la enzima, que luego se detecta mediante un ensayo bioquímico.

Ensayo de dos híbridos de levadura para determinar la autoasociación de proteínas en células de levadura

En este video, demostramos el ensayo de un híbrido de levadura modificada, que detecta múltiples proteínas que interactúan con el ADN objetivo. Las células de levadura transformadas contienen la secuencia de ADN diana aguas arriba del gen reportero. Además, expresan proteínas factores de transcripción. Cuando las proteínas forman complejos y se unen al ADN diana, el gen reportero se expresa y puede detectarse enzimáticamente.

Ensayo híbrido de levadura y uno modificado para detectar interacciones heteroméricas entre el complejo de proteínas y el ADN

Este artículo se centra en la identificación de la interacción de datos de alta confianza entre anfitrión y proteínas de patógenos utilizando una combinación de los dos métodos ortogonales: levadura de dos híbridos seguido de un ensayo de interacción de alto rendimiento en células de mamífero llamado HT-GPCA.

Un enfoque comparativo para caracterizar el paisaje del Huésped-Patógeno interacciones proteína-proteína

El uso de microarrays de proteínas que contienen casi toda la S. cerevisiae proteoma se sondeó para un rápido interrogatorio imparcial de miles de interacciones proteína-proteína en paralelo. Este método puede ser utilizado para la molécula de proteína pequeña, modificación postraduccional, y otros ensayos en alto rendimiento.

Sondeo de alta densidad microarrays de proteínas funcionales para detectar interacciones proteína-proteína

Las proteínas interactúan entre sí y estas interacciones determinan en gran medida sus funciones. Los socios de interacción de proteínas se pueden identificar a alto rendimiento in vivo utilizando un ensayo de aptitud de levadura basado en el ensayo de complementación de fragmentos de proteínas de dihidrofolato reductasa (DHFR-PCA).

Genoma toda la Proteína-proteína interacción Screening por Complementación de ensayo de proteínas-fragmento (PCA) en las células vivas

proteínas efectoras bacterianas son importantes para establecer infecciones exitosas. Este protocolo describe la identificación experimental de parejas de unión proteica de una proteína efectora bacteriana en su huésped natural de la planta. La identificación de estas interacciones efectoras a través de levadura híbrido de dos pantallas se ha convertido en una herramienta importante en el descubrimiento de estrategias moleculares de patogenicidad.

Desenredar la función de un efector bacteriana de una planta de patógenos no cultivables Uso de una levadura de dos híbridos pantalla

El ensayo de un híbrido de levadura modificado descrito aquí es una extensión del ensayo clásico de levadura híbrida (Y1H) para estudiar y validar la interacción heteromérica de complejo de proteína-ADN en un sistema heterólogo para cualquier estudio de genómica funcional.

Un sistema híbrido modificado de levadura-uno para estudios de interacción de ADN complejo-proteína heterotérica

Secuenciación profunda de las poblaciones de levaduras seleccionadas para las interacciones 2-híbrido de levadura positivos potencialmente produce una gran cantidad de información sobre la interacción de las proteínas de socio. Aquí, describimos el funcionamiento de herramientas bioinformáticas específico y personalizado software actualizado para analizar los datos de la secuencia de estas pantallas.

Análisis informático de datos de la secuencia de lote levadura híbrida 2 pantallas

Las interacciones de las biomoléculas, como las interacciones proteína-proteína, son la base molecular de las funciones biológicas. Si se pueden aislar mutantes nulos/deteriorados por interacción que carecen específicamente de la interacción relevante, serán de gran ayuda para comprender las funciones de esta interacción. Este artículo presenta una forma eficiente de aislar mutantes nulos o deteriorados por interacción.

Aislamiento de mutantes nulos o alterados de interacción mediante el ensayo de dos híbridos de levadura

Aprende a realizar pantallas de 2 híbridos de levadura en lote para comparar perfiles de interacción proteína-proteína mediante secuenciación profunda. Este método permite identificar interactomas diferenciales en biología molecular y celular.

Una pantalla de 2 híbrido de levadura en lote para comparar las interacciones proteína

Explorar más videos