Name: Una pantalla de 2 híbrido de levadura en lote para comparar las interacciones proteína (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Aprende a realizar pantallas de 2 híbridos de levadura en lote para comparar perfiles de interacción proteína-proteína mediante secuenciación profunda. Este método permite identificar interactomas diferenciales en biología molecular y celular.

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Agradecemos al personal en el Instituto de genética humana para secuenciación y NGS biblioteca preparación. Damos las gracias por su experiencia en la preparación de fragmentos de la biblioteca genómica de la biblioteca de plásmido Y2H aquí Einat Snir. Este trabajo fue financiado por National Institutes of Health: NIH R21 EB021870-01A1 y beca de proyecto de investigación NSF: 1517110.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

Aquí ofrecemos a una guía de cómo llevar a cabo ensayos de Y2H en lote usando métodos optimizados. Hay algunos pasos críticos en el procedimiento para garantizar que la población de levaduras que se colocaba en la selección es representante de la biblioteca de partida y que suficiente de la población a partir de la levadura se utiliza para someterse a la selección para limitar la variabilidad . Lo importante, estos criterios son relativamente fáciles de lograr junto a adaptar los métodos y materiales para un ensayo de Y2...

Una comprensión completa de los procesos biológicos de la célula se basa en la búsqueda de las redes de interacción de proteínas que subyacen sus mecanismos moleculares. Un enfoque para identificar las interacciones entre proteínas es la levadura 2-híbrido (Y2H), que trabaja montando un factor de transcripción quimérica de funcionamiento una vez que dos dominios de la proteína de interés unen unos a otros1. Una típica pantalla de Y2H se realiza mediante la creación de una población de levaduras que alberga tanto una biblioteca de plásmidos que codifican las proteínas interactúan con fusible para un activador transcripcional (ej., proteína de la fusión de presas) y un plásmido determinado 'cebo' compuesta por la proteína de interés fusionado a un dominio de unión a ADN (por ejemplo, el dominio de Gal4 DNA-que atan que se une a la secuencia de activación Gal4-upstream). Una de las principales ventajas del enfoque Y2H es que es relativamente fácil y barato para llevar a cabo en un laboratorio típico equipado para trabajo biológico molecular de rutina2. Sin embargo, cuando tradicionalmente se realiza, un usuario muestras de colonias individuales que surgen en la selección para una interacción positiva de Y2H. Seriamente, esto limita el número de clones 'presa' de biblioteca que puede ser examinado. Este problema se agrava cuando la abundancia de una presa particular de interacción es muy alta en relación con los demás, disminuyendo la posibilidad de detectar la interacción de plásmidos de presas de baja abundancia.
Una solución para usar el principio de Y2H en cobertura del proteoma es el uso de un enfoque con formato de matriz en una matriz que contiene plásmidos conocido presa individual puede ser interrogada digitalmente. Sin embargo, este enfoque requiere una infraestructura que no es fácilmente accesible o rentable a investigadores individuales que estén interesados en definir el interactoma de un pequeño número de proteínas o dominios3. Además, bibliotecas de presa muy complejo que pueden codificar múltiples fragmentos de proteínas interactuantes ampliaría el tamaño de tales matrices matriz tamaño práctico. Una alternativa es realizar ensayos con complejo bibliotecas en lotes y evaluar la presencia de clones interactúan mediante secuenciación masiva en paralelo alto rendimiento4. Esto puede aplicarse para analizar la presencia de plásmidos de presas que se presentan en varias colonias con un típico Y2H formato enfoque en cual levadura las células vivienda un par de interacción de proteínas de fusión pueden crecer en una placa de5,6. Esta idea general se puede acentuarse para aumentar la consulta de ambos múltiples cebo y presa de componentes en el mismo tiempo7,8.
Sin embargo, muchas investigaciones requieren que un más fácil todavía centra más esfuerzo en pocos proteína 'cebos' y pueden beneficiarse más de una consulta exhaustiva y semi-cuantitativa de una sola presa complejo biblioteca. Hemos desarrollado y validado un método para llevar a cabo estudios de interacción de proteínas de gran escala usando un principio Y2H en lote formato4. Esto utiliza la tasa de expansión de un plásmido determinado presa como un proxy para la fuerza relativa de Y2H interacción9. Profundo secuenciación de los plásmidos dentro de una población sometida a un crecimiento normal o las condiciones de crecimiento selectivo produce un mapa completo de clones que producen interacciones de Y2H fuertes y débiles. El repertorio de interactianos puede ser obtenido y comparado directamente a través de múltiples plásmidos de cebo. El flujo resultante denominado DEEPN (enriquecimiento dinámico para la evaluación de redes de proteínas) así puede utilizarse para identificar interactomes diferencial de las mismas bibliotecas de presa para identificar proteínas, permitiendo la comparación entre una proteína y otra.
Aquí, demostramos DEEPN e introducir mejoras en los métodos de laboratorio que facilitan su uso, que se detallan en la figura 1. Las mejoras significativas incluyen:
Generación de las poblaciones de levadura presas. Uno de los requisitos clave de DEEPN está generando poblaciones de levaduras con cebo diferentes plásmidos que tienen la misma distribución de las bibliotecas de la presa de plásmido. Poblaciones de referencia equivalente de la biblioteca de plásmido de presa son esenciales para hacer comparaciones exactas entre los interactomes de diferentes cebos. Esto se logra mejor cuando un plásmido de biblioteca ya se encuentra en una población de levadura haploide y mover un plásmido determinado cebo en que la población se consigue por el apareamiento para producir un diploide. Aquí, ofrecemos a una guía clara de cómo hacer estas poblaciones usando librerías comerciales ubicados en levadura haploide. Aunque hemos encontrado métodos que generan un alto número de diploides, la eficiencia global de apareamiento de estas cepas de levadura que contiene la biblioteca comercial fue baja. Por lo tanto, construimos una nueva cepa que puede albergar bibliotecas presa que cede más diploides por reacción de acoplamiento.
Nuevo sistema de plásmidos de cebo. Muchos plásmidos actuales que expresan proteínas de la fusión de la 'carnada' compuestas de la proteína de interés y un dominio DNA-que atan son 2µ, lo que les permite ampliar su número de copia. Este número de la copia puede ser muy variable en la población y conducir a la variabilidad en la respuesta transcripcional de Y2H. Esto a su vez podría sesgar la capacidad para medir la fuerza de una interacción de proteína determinada basada en la respuesta de crecimiento de células en la selección. Esto puede ser en parte dirección mediante el uso de un plásmido de copia baja, algunos de los cuales se han descrito previamente como el pDEST32 disponible en el mercado10. Construimos un nuevo plásmido de cebo (pTEF-GBD) que produce proteínas de fusión Gal4-Unión al ADN dominio dentro de un plásmido de copia baja basada en el centrómero de TRP1 portadores del gen de resistencia Kanr que también facilita la clonación de fragmentos de cebo tanto aguas arriba y aguas abajo del dominio de unión al ADN de Gal4.
Biblioteca de fragmento de nueva alta densidad Y2H. Había construido un nuevo plásmido a las bibliotecas de casa Y2H presa y usado para construir una biblioteca de Y2H altamente compleja hecha de esquilado al azar fragmentos de la DNA genomic de Saccharomyces cerevisiae. Análisis de la secuencia demostró que esta biblioteca tenía sobre 1 millón de diferentes elementos, mucho más complejos que descrita levadura genómica Y2H plásmido bibliotecas11. Con esta nueva biblioteca, hemos sido capaces de demostrar que el flujo de trabajo DEEPN es lo suficientemente robusto como para dar cabida a las bibliotecas del complejo con muchos plásmidos diferentes en una manera fiable y reproducible.

<table><tbody><tr><td>Illumina HiSeq 4000</td><td>Plataforma de secuenciación profunda</td><td>Illumina</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos monoclonales anti-HA</td><td>Biolegend</td><td>901514</td><td>Anticuerpo primario para detectar la expresión de HA en construcciones pGal4AD Anticuerpos</td></tr><tr><td>policlonales anti-myc</td><td>QED Biosciences Inc</td><td>18826</td><td>Anticuerpo primario para detectar la expresión de MYC en construcciones pTEF-GBD</td></tr><tr><td>NarI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0191S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3236S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicol 3350, polvo</td><td>J.T. Baker</td><td>U2211-08</td><td></td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA</td><td>Trevigen, Inc vendido por Fisher Scientific</td><td>50-948-286</td><td>ADN portador para la transformación de levaduras sección 3.2.1.</td></tr><tr><td>Monosulfato de kanamicina Productos de</td><td>investigación internacionales</td><td>K22000</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarosa</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td>utilizado para hacer geles de agarosa de ADN</td></tr><tr>Productos de investigación<td>de cloruro de sodio</td><td>Internacional</td><td>S23025</td><td></td></tr><tr>Productos de investigación de<td>triptona</td><td>Internacional</td><td>T60060</td><td></td></tr><tr><td>Productos de investigación de D-sorbitol</td><td>Internacional</td><td>S23080</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de litio dihidratado</td><td>MP Biomedicals</td><td>155256</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de calcio</td><td>ThermoFisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Sal de sodio</td> Productos <td>de investigación internacionales</td><td>E57020</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura en polvo Productos</td> de <td>investigación internacionales</td><td>Y20020</td><td></td></tr><tr><td>Base de nitrógeno de levadura (sulfato de amonio) sin aminoácidos</td><td>Research Products International</td><td>Y20040</td><td></td></tr><tr><td>CSM-TRP-LEU+40ADE</td><td>para</td><td>DCS0789</td><td></td></tr><tr><td>medio CSM-Trp-LEU-HIS+40ADE</td><td>para</td><td>DCS1169</td><td></td></tr><tr><td>medio CSM-Leu-Met</td><td>para medio</td><td>DCS0549</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Trp-Met</td><td>Bio 101, Inc</td><td>4520-922</td><td></td></tr><tr><td>L-metionina</td><td>para medio</td><td>DOC0168</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Research Products International</td><td>A11500</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Research Products International</td><td>G32045</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>utilizado para la fabricación de placas de medios en la sección 1</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Research Products International</td><td>P20240</td><td></td></tr><tr><td>3-amino-1,2,4 Triazol</td><td>Sigma</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>2- Mercaptoehanol (BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>USBiológico</td><td>Z1004</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio dibásico</td><td>Sigma</td><td>P8281</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:Cloroformo:IAA</td><td>Ambion</td><td>AM9732</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238074</td><td></td></tr><tr><td>Laboratorios de descontaminación de</td><td>etanol</td>, INC <td>2716</td><td></td></tr><tr><td>ARNasa A</td><td>ThermoFisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Research Products International</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Research Products International</td><td>L22010</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Gibco</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>azul de bromofenol</td><td>Amresco</td><td>449</td><td></td></tr><tr><td>Kit de clonación de ensamblaje de Gibson</td><td>New England Biolabs</td><td>E5510S</td><td>Método de ensamblaje rápido para la clonación de plásmidos en la sección 2</td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541S</td><td>Se utiliza para la amplificación de productos para el ensamblaje de Gibson en la sección 2.3, así como para la preparación de muestras para la secuenciación profunda de DEEPN en la sección 6.2.1</td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Amresco</td><td>0492-5G</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificación de PCR QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Se utiliza para la purificación de productos de PCR en la sección 6.2.3</td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel de ADN Qiaquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Se utiliza para la purificación de pTEF-GBD digerido en la sección 2.1</td></tr><tr><td>Kit KAPA Hyper Prep KAPA</td><td>Biosystems</td><td>KK8500</td><td>kit de preparación para la secuenciación profunda</td></tr><tr><td>Optimización de codones</td><td>http://www.jcat.de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimización de codones</td><td>https://www.idtdna.com/CodonOpt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gBlocks</td><td>Integrated DNA Technologies Fragmentos</td><td></td><td>de ADN utilizados para la clonación en la sección 2.2</td></tr><tr><td>Strings</td> Fragmentos de ADN de <td>Thermofisher</td><td></td><td>utilizados para la clonación en la sección 2.2</td></tr><tr><td>GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit EPOCH</td><td>Life Sciences</td><td></td><td>Utilizado para preparar cantidades de ADN en la sección 2.3</td></tr><tr><td>Covaris E220</td><td>Covaris</td><td></td><td>ultrasonido de alto rendimiento en sección 7</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5'- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3'</td><td>Tecnologías de ADN integradas o Thermofisher</td><td></td><td>utilizadas para la amplificación y secuenciación de PCR 5' inserto pTEF-GBD durante la construcción de plásmidos</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5'-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3'</td><td>Tecnologías de ADN integradas o Thermofisher</td><td></td><td>utilizadas para la amplificación y secuenciación de PCR 5' insertan pTEF-GBD durante la construcción de plásmidos</td></tr><tr><td>oligo nucelotida 5'-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTCTC-3'</td><td>Tecnologías de ADN integradas o Thermofisher</td><td></td><td>utilizadas para la amplificación y secuenciación de PCR 3' inserto pTEF-GBD durante la construcción de plásmidos</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5'-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3'</td><td>Tecnologías de ADN integradas o Thermofisher</td><td></td><td>utilizadas para la amplificación y secuenciación de PCR 3' inserto pTEF-GBD durante la construcción de plásmidos</td></tr><tr><td>oligonucleótido 5'-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3'</td><td>Tecnologías de ADN integradas o Thermofisher</td><td></td><td>5' Pimer utilizado para la amplificación de insertos de pGAL4AD</td></tr><tr><td>oligonucelotide 5'-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3'</td><td>Tecnologías de ADN integradas o Thermofisher</td><td></td><td>3' Pimer utilizado para la amplificación de insertos de pGAL4AD</td></tr><tr><td>oligonucelotide 5'-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3'</td><td>Integrated DNA Technologies o Thermofisher</td><td></td><td>5' Pimer utilizado para la amplificación de insertos de pGADT7</td></tr><tr><td>oligonucelotide 5'- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3'</td><td>Integrated DNA Technologies o Thermofisher</td><td></td><td>3' Pimer utilizado para la amplificación de insertos de la cepa de levadura pGADT7</td></tr><tr><td>PJ69-4A MatA</td><td>http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Bibliotecas genómicas y una cepa huésped diseñada para la selección altamente eficiente de dos híbridos en levadura. GENÉTICA 1996 144:1425-1436</td><td></td><td>MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7</td></tr><tr><td>pTEF-GBD</td><td>Dr. Robert Piper Lab</td><td></td><td>Gal4-DNA binding doimain expression plasmid</td></tr><tr><td>pGal4AD (pPL6343)</td><td>Dr. Robert Piper Lab</td><td></td><td>Plásmido de expresión de dominio de activación Gal4</td></tr><tr><td>placas de Petri de 100 mm</td><td>Kord-Vallmark vendido por VWR</td><td>2900</td><td></td></tr><tr><td>Matraz PYREX Erlenmeyer de 125 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63270</td><td></td></tr><tr><td>Matraz PYREX Erlenmeyer de 250 mL</td><td>Matraz Pyrex</td><td>S63271</td><td></td></tr><tr><td>1.000 mL Matraz PYREX Erlenmeyer</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63274</td><td></td></tr><tr><td>Matraz PYREX Erlenmeyer de 2.000 mL Matraz Fisher</td><td>Scientific</td><td>S63275</td><td></td></tr><tr><td>20 X 150 mm Tubo de cultivo desechable</td><td>Thermofisher</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>pipeta</td><td>Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipeta serológica</td><td>Denville</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipeta serológica</td><td>Denville</td><td>P7128</td><td></td></tr><tr><td>25 mL pipeta serológica</td><td>Denville</td><td>P7129</td><td></td></tr><tr><td>1.000 mL PYREX Vaso de precipitados Griffin</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-540P</td><td></td></tr><tr><td>1.000 mL PYREX Botella de almacenamiento de medios utilizables</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-414-1D</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro graduado de 1.000 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-572-6G</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax 190</td><td>Dispositivos</td><td></td> moleculares <td>utilizados para medir la densidad óptica de las células</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>Espectrofotómetro utilizado para cuantificar la cantidad de ADN</td></tr><tr><td>UV electrónico transiluminador</td><td>Ultra Lum</td><td>MEB 20</td><td>utilizado para visualizar el ADN en un gel de agarosa de bromuro de etidio</td></tr><tr><td>P1000 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td></td></tr><tr><td>P200 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123601G</td><td></td></tr><tr><td>P20 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123600G</td><td></td></tr><tr><td>P10 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F144802G</td><td></td></tr><tr><td>1250 y micro; L Puntas de pipeta de baja retención</td><td>GeneMate</td><td>P-1236-1250</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; Puntas de pipeta de retención LLow</td><td>VWR</td><td>10017-044</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L XL Puntas de pipeta de baja retención</td><td>VWR</td><td>10017-042</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de 50 ml</td><td>VWR</td><td>490001-627</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de 15 ml</td><td>VWR</td><td>490001-621</td><td></td></tr><tr><td>Rascador de células</td><td>Denville Scientific</td><td>TC9310</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Tubos de microcentrífuga</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fluka Analytical</td><td>318949-1L</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>J.T. Baker</td><td>5674-02</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores de madera</td><td>Solon Care</td><td>55900</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga Eppendorf 5424</td><td>Microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-400-005</td></tr><tr><td>Sorvall ST16R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004381</td><td>centrífuga de sobremesa</td></tr><tr><td>Amersham ECL Rabbit IgG, Ab entero ligado a HRP (de burro)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-1ML</td><td>Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>Amersham ECL IgG de ratón, Ab entero ligado a HRP (de ovejas)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-1ML</td><td>Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Sustrato quimioluminiscente</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34080</td><td>ECL</td></tr><tr><td>Incubadora Isotemp</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Incubadora</td></tr><tr><td>Mutitron 2</td><td>INFORS HT</td><td></td><td>Incubadora de agitación</td></tr><tr><td>Isotemp Baño de agua con control digital modelo 205</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>baño de agua</td></tr><tr><td>Y2H Biblioteca de ADNc para ratones en Y187 (tejido pan)</td><td>Clontech</td><td>630482</td><td>Biblioteca de ADNc disponible comercialmente</td>Biblioteca de</tr><tr><td>ADNc para ratones Y2H en Y187 (cerebro de ratón)</td><td>Clontech</td><td>630488</td><td>Biblioteca de ADNc disponible comercialmente</td></tr><tr><td>Vector</td> <td>pGADT7 ADClontech</td><td>630442</td><td>vector AD disponible comercialmente que alberga muchas bibliotecas de ADNc</td></tr><tr><td>pGBKT7 Vector DNA-BD</td><td>Clontech</td><td>630443</td><td>disponible comercialmente Vector DNA-BD</td></tr><tr><td>Biolase ADN polimerasa</td><td>Bioline</td><td>BIO-21042</td><td>ADN polimerasa utilizada para la sección 2.4</td></tr><tr><td>Termociclador GeneMate GCL-60 Máquina</td> de <td>PCR</td><td>BioExpress</td><td>P-6050-60</td></tr><tr><td>Tubos de PCR TempAssure 0,5 mL</td><td>Científico de EE. UU</td>. <td>1405-8100</td><td></td></tr></tbody></table>

una pantalla de 2 híbrido de levadura en lote para comparar las interacciones proteína

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Detección de interacciones proteína-proteína usando el análisis de 2 híbrido de levadura ha sido una herramienta eficaz, pero su uso en gran parte se ha limitado al descubrimiento de interactianos de alta afinidad que se enriquecen altamente en la biblioteca de los candidatos interactúan. En un formato tradicional, el ensayo de 2-híbrido de la levadura puede producir también muchas colonias a analizar cuando se llevó a cabo en baja estrigencia donde podrían hallarse los interactianos de baja afinidad. Por otra parte, sin un interrogatorio amplio y completo de la misma biblioteca contra cebos diferentes plásmidos, no se puede lograr un análisis comparativo. Aunque algunos de estos problemas pueden abordarse utilizando bibliotecas de vestida de presa, el costo y la infraestructura necesaria para el funcionamiento de estas pantallas pueden ser prohibitivos. Como alternativa, hemos adaptado el ensayo 2-híbrido de levadura para descubrir al mismo tiempo decenas de transitorios y las interacciones de proteínas estáticas dentro de una sola pantalla utilizando una estrategia denominada DEEPN (enriquecimiento dinámico para la evaluación de redes de proteínas), que incorpora la secuencia de la DNA de alto rendimiento y cálculo para seguir la evolución de una población de plásmidos que codifican a socios interactúan. Aquí, describimos modificado para requisitos particulares los reactivos y protocolos que permiten una pantalla DEEPN para ejecutar fácil y rentable.

El ensayo de Y2H ha sido ampliamente utilizado para la búsqueda de las interacciones proteína: proteína y se han desarrollado varias adaptaciones y sistemas. En su mayor parte, las mismas consideraciones que ayudan a asegurar el éxito con estos métodos anteriores son importantes para DEEPN. Algunos de los puntos de referencia importantes son: garantizar la expresión de dominio DNA-obligatorio proteínas de fusión, asegurando un bajo fondo de falso crecimiento su + en los diploides que cont...

Procesamiento por lotes de pantallas 2-híbrido de levadura permite la comparación directa de los perfiles de la interacción de múltiples proteínas de cebo con un sistema altamente complejo presa de proteínas de fusión. Aquí, describimos métodos de refinado, nuevos reactivos y cómo implementar su uso para esas pantallas.

Una pantalla de 2 híbrido de levadura en lote para comparar las interacciones proteína

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Este método utiliza el principio del sistema híbrido de levadura 2 en ambas poblaciones para identificar interacciones proteína-proteína que responden a preguntas clave sobre una variedad de procesos moleculares y celulares. Esta técnica aprovecha la secuenciación profunda para ver las interacciones de una proteína frente a otra. Dado que este enfoque está orientado a hacer comparaciones paralelas, puede identificar conjuntos de proteínas que interactúan con una proteína frente a otra o diferentes confirmaciones de la misma proteína o mientras se tipifica una versión mutante causante de una enfermedad, para revelar interactomas diferenciales.Se construyó un nuevo plásmido de cebo híbrido de levadura 2 pTEF-GBD para este procedimiento, como se describe en el protocolo de texto. Este plásmido produce proteínas de fusión del dominio de unión al ADN Gal4 dentro de un plásmido de baja copia basado en centrómero TRP1 que lleva el gen de resistencia a la kanamicina que también permite la clonación de fragmentos de cebo tanto aguas arriba como aguas abajo del dominio de unión al ADN Gal4. Este plásmido de cebo se utilizó para transformar la levadura MATa, y la expresión de las proteínas de fusión del cebo Gal4 se verificó mediante inmunotransferencia con anticuerpos anti-MIC.Además, se creó una nueva biblioteca de híbridos de levadura 2 en el vector de plásmido de presa optimizado PGAL4 AD. El ADN genómico se fragmentó por cizallamiento, se seleccionó el tamaño, se modificó con adaptadores y se insertó en PGAL4-AD para crear la biblioteca de 2 híbridos de levadura saxairtab. Para comenzar el procedimiento de creación de poblaciones de levaduras con bibliotecas de cebo y presas, se inoculen tres cultivos de mililitros de cada uno de los transformadores de levadura MATa que llevan los distintos plásmidos de cebo que contienen plásmidos de cebo y CSM menos medio de viaje.Incluya dos cultivos separados, que contengan solo el plásmido vector, para que sirvan como controles de procedimiento. Incubar los cultivos a 30 grados centígrados y 200 rpm durante seis horas. A continuación, diluir cada cultivo en un cultivo de 25 mililitros en un matraz Erlenmeyer estéril e incubar durante la noche.Descongele un vil congelado de células alfa MAT que contienen la biblioteca de presas portadoras de lu2 a temperatura ambiente. Utilice todo el vil de células descongeladas para inocular 125 mililitros de CSM menos lu menos medio metido en un matraz Erlenmeyer estéril. Cultive el cultivo a 30 grados centígrados y 200 rpm durante la noche.Al día siguiente, después de confirmar que el OD600 de los cultivos transformantes de la estera nocturna oscila entre 1,0 y 1,5, transfiera los cultivos a tubos cónicos de 50 mililitros y centrifugue 21 equivalentes de OD 600 de cada cultivo a 4.696 veces g a temperatura ambiente durante cinco minutos. Vuelva a suspender cada gránulo de celdas de estera a en 10 mililitros de agua estéril, transfiera la suspensión a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros y centrifugue a 4.696 veces g a temperatura ambiente durante cinco minutos. Con una pipeta, retire suavemente el sobrenadante, sin alterar las células granuladas, y vuelva a suspender el pellet en cuatro mililitros de medio YPDA tamponado a pH 3,7.Por cada 10 reacciones de apareamiento deseadas, pellet 39 OD 600 equivalentes de la cepa mat alpha que transporta los plásmidos de la biblioteca en un tubo cónico de 50 mililitros. Vuelva a suspender las células alfa mat en 10 mililitros de agua estéril y repegue en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros a 4.696 veces g a temperatura ambiente durante cinco minutos. Con una pipeta, retire suavemente el sobrenadante, sin alterar las células granuladas, y vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de medio YPDA tamponado a pH 3,7.Para configurar cada reacción de acoplamiento, agregue lo siguiente a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros: un mililitro de células transformadas en MAT-A, un mililitro de células que contienen la biblioteca MAT-alfa y un mililitro de YPDA tamponado a pH 3,7. Incubar a 30 grados centígrados con una suave agitación orbital durante 90 minutos. Después de 90 minutos, centrifugue las células a 4.696 veces g a temperatura ambiente durante cinco minutos.Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en dos mililitros de YPDA-YPD tamponado uno a uno. Coloque los dos mililitros de células en una placa YPD de 100 mililitros e incube a 30 grados centígrados durante aproximadamente 20 horas. Para recolectar las células, pipetee de dos a tres mililitros de CSM menos lu menos medio de disparo en cada placa YPD y use un raspador de células para desalojar las células.Pipetea las células desprendidas en un tubo cónico de 50 mililitros. Enjuague la placa de cuatro a cinco veces con dos o tres mililitros de CSM menos lu menos medio de viaje utilizando una pipeta de 1.000 microlitros para pipetear el medio y expulsándolo suavemente a través de la superficie de la placa YPD. Centrifugar las células a 4.696 veces g a temperatura ambiente durante cinco minutos.Deseche el sobrenadante de cada tubo cónico y vuelva a suspender las células en 40 mililitros de CSM menos lu menos medio de disparo pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Para estimar el número de células diploides formadas, diluya cuatro microlitros de la mezcla diploide en 200 microlitros y 2.000 microlitros de CSM menos lu menos medio de viaje, respectivamente. Coloque 200 microlitros de cada dilución en una placa de disparo CSM menos lu menos para representar una dilución completa de uno a 10.000 y de uno a 100.000 del stock de diploides cosechados.Incubar las placas a 30 grados centígrados durante 36 a 40 horas. Utilice inmediatamente el resto de cada 40 mililitros de resuspensión celular para inocular 500 mililitros de CSM menos lu menos medio de viaje en un matraz Erlenmeyer de un litro. Mida el OD 600 de cada cultivo.Incubar estos matraces a 30 grados centígrados, agitándolos a 180 rpm, hasta que alcancen la saturación, lo que suele tardar entre 36 y 40 horas. Controle el crecimiento celular a las 24 horas y a las 36 horas midiendo el OD 600. Antes de continuar con el procedimiento, confirme la eficiencia de apareamiento de las dos cepas de levadura.Se requiere un número mínimo de 200 colonias en la placa de dilución de una a 10.000. Una vez que los cultivos hayan alcanzado la saturación, utilice una pipeta para extraer un aloquero de 20 mililitros de cada cultivo e inocule matraces Erlenmeyer de dos litros. Un matraz que contenía 750 mililitros de CSM menos lu menos medio de viaje y un segundo matraz que contenía 750 mililitros de CSM menos lu menos viaje menos su medio.Con el nivel más bajo de tres amino 124 triasol que elimina el fondo, determinado anteriormente como se describe en el protocolo de texto. Mezcle bien las nuevas culturas girando. Después de medir el OD inicial de 600, incubar los cultivos a 30 grados Celsius, mientras se agitan a 180 rpm, hasta la saturación, que generalmente ocurre dentro de las 24 horas para el cultivo CSM menos lu menos trip no seleccionado, pero puede demorar más de 70 horas para los cultivos bajo selección para interacciones de levadura 2-híbridos.Una vez que los cultivos hayan alcanzado la saturación, retire 11 mililitros de cada cultivo con una pipeta y sedimente las células con un centrifugado de cinco minutos a 4.696 veces g a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y proceda con la extracción de ADN como se demuestra en la siguiente sección. Para comenzar el procedimiento de extracción de ADN, utilice una pipeta para resuspender cada gránulo de célula preparado anteriormente en 500 microlitros de tampón TE fuerte.Transfiera a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y agregue 10 microlitros de caldo de zimolay a cada tubo. En una campana extractora, agregue tres microlitros de etanol beta marketol a cada tubo y mezcle bien. Incube en la incubadora a 37 grados centígrados durante 24 a 36 horas.A continuación, extraiga las muestras dos veces con 500 microlitros de alcohol isolaymal fenol cloroformo como se describe en el protocolo de texto. Añadir siete microlitros de cloruro sódico de cuatro molares y 900 microlitros de etanol 100% helado y mezclar por inversión. Sedimentar el ADN girando en una microcentrífuga a 21,130 veces g durante 10 minutos a temperatura ambiente.Deseche el sobrenadante por pipeteo y lave cada pellet tres veces con 900 microlitros de etanol al 70%. Sedimentar el ADN centrifugando a 21,130 veces g durante dos minutos. Después de eliminar el etanol residual, seque los pellets a 42 grados centígrados durante siete minutos.Vuelva a suspender cada pellet en 120 microlitros de TE 0,1x fuerte en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 90 minutos. Pipetear 60 microlitros del ADN extraído en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros. Agregue 120 microlitros de TE fuerte y 3,5 microlitros de caldo RN ace A, mezcle para mezclar e incube a 37 grados centígrados durante una hora.Agregue siete microlitros de acitato de amonio cinco molares y 900 microlitros de etanol 100% frío como hielo a cada tubo. Mezclar por inversión y sedimentar el ADN, como se demostró anteriormente. Vuelva a suspender el ADN tratado con RNace-A en 55 microlitros de TE 0,1x fuerte en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 90 minutos.Cuantificar el ADN por absorbancia a 260 nanómetros. El siguiente paso es realizar PCR en las inserciones de CDNA. Realizar dos reacciones de PCR de 50 microlitros por muestra de ADN.A cada reacción se le añade agua, cinco microgramos de muestra de ADN, 25 picamoles de cada cebador directo e inverso que coincida con el plásmido de la biblioteca de presas y 25 microlitros de mezcla maestra de PCR 2x de alta fidelidad. Amplifica las reacciones con este programa. Una desnaturalización de 30 segundos a 98 grados centígrados, 25 ciclos de D-natrina a 98 grados centígrados durante 10 segundos, anealing a 55 grados centígrados durante 30 segundos, y tiempos de extensión de tres minutos a 72 grados centígrados, seguidos de una incubación de cinco minutos a 72 grados centígrados.Analice cada reacción de PCR mediante electroforesis en frío de DNA agrose al 1% con un gel que contenga athidiumbromo y visualice el gel mediante transiluminación UV. Las muestras sin selección muestran un frotis generalizado de ADN, pero tras la selección se pueden discernir bandas individuales. Combine muestras de PCR duplicadas y purifique con un kit siguiendo las instrucciones del fabricante.Cuantificar el ADN por absorbancia a 260 nanómetros en un espectrofotómetro. Posteriormente, realice una secuenciación profunda, seguida del procesamiento y la verificación bioinformáticos como se describe en el protocolo de texto. En el procedimiento demostrado se utilizó la nueva biblioteca de 2 híbridos de levadura fragmentada al azar y los insertos de plásmidos amplificados por PCR se analizaron mediante secuenciación DEEP y procesamiento bioinformático utilizando el software DEEPN y se compararon con una biblioteca publicada anteriormente.Este gráfico muestra el orden de rango de las cañas por cada gen en las bibliotecas dividido por las cañas por gen encontrado mediante la secuenciación del genoma de la levadura. Este histograma muestra el número de plásmidos únicos por gen que codifica un fragmento que se encuentra tanto en la región codificante de proteínas como en el marco de lectura traduccional adecuado. Se muestra una comparación de los números de diferentes plásmidos en cada biblioteca que codifican genes de levadura y la proporción de los que están y no están en el marco de lectura traduccional correcto o se insertan al revés.En general, la nueva biblioteca tiene muchos más plásmidos diferentes. Estos métodos garantizan que la biblioteca pueda transferirse de forma reproducible a células que contengan diferentes proteínas cebo y que el procedimiento de selección pueda producir conjuntos reproducibles de genes enriquecidos, distinguiéndolos como proteínas candidatas específicas que interactúan. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente una semana si se realiza correctamente.La mayor parte de este trabajo consiste en la incubación de cultivos de células, y el tiempo de práctica real es de solo unas pocas horas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar crear poblaciones de un gran número de células diploides individuales para que la biblioteca pueda transferirse de forma reproducible a las células que contienen las diferentes proteínas cebo. También es importante prestar mucha atención a las condiciones de dilución y la tasa de crecimiento de las células para aquellas poblaciones que se someten a selección para condiciones positivas de híbrido de levadura 2.Siguiendo este procedimiento, los métodos computacionales que se explican en el trabajo adjunto identificarán las proteínas candidatas que interactúan y proporcionarán un camino para validar estas interacciones utilizando un ensayo tradicional de levadura 2-híbrido u otros métodos bioquímicos. Después de ver este video, debería tener una muy buena idea sobre cómo crear de manera reproducible poblaciones de levadura diploide que contengan la biblioteca de plásmidos de presa y cultivarlas en lote para seleccionar interacciones positivas de híbridos de levadura 2. No olvide que trabajar con solventes orgánicos, durante el protocolo de purificación del ADN, puede ser peligroso y debe hacerse en la campana extractora con guantes y una bata de laboratorio.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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Una pantalla de 2 híbrido de levadura en lote para comparar las interacciones proteína

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