Aislamiento, expansión y Adipogenic inducción de CD31 + CD34 + células endoteliales del humano omentales y subcutáneos de tejido adiposo

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la obesidad, como la identificación de los factores y mecanismos clave que impiden una respuesta adipogénica robusta durante la remodelación del tejido adiposo. La principal ventaja de esta técnica es que permite el aislamiento de células endoteliales CD34+CD31+ del tejido adiposo humano a partir de pequeñas cantidades de tejido. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando quisimos identificar células en la vasculatura adiposa humana que responden a la estimulación adipogénica.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de aislamiento celular son difíciles de practicar debido al acceso a menudo limitado al tejido adiposo humano fresco. Recolectar tejido adiposo epiplónico y subcutáneo humano de sujetos humanos sometidos a cirugía bariátrica. Inmediatamente después de la extracción del tejido, mantenga el tejido adiposo onípico y subcutáneo humano en viales separados que contengan la solución salina tamponada de Hank con 50 microgramos por mililitro de penicilina estreptomicina a temperatura ambiente.

Una vez que la muestra llega al laboratorio después de la extracción del tejido, limpie y retire cuidadosamente las secciones fibróticas y cauterizadas del tejido utilizando tijeras y pinzas frotadas con etanol al 70%. Pesar el tejido adiposo y dividirlo en alícuotas de cinco gramos para la digestión de la colagenasa. Use dos pares de tijeras para picar finamente cinco gramos de tejido adiposo en cinco mililitros de una solución de colagenasa en un vial de centelleo a temperatura ambiente.

Agregue 10 mililitros adicionales de solución de colagenasa al tejido picado para obtener 15 mililitros en total. Digirir las muestras durante una hora a 37 grados centígrados en un baño de agua con agitación continua. Después de la digestión, vierta las muestras en la jeringa roma de 20 mililitros.

Filtre la muestra a través de una malla de nailon de 250 micras en el tubo cónico de 50 mililitros para separar los adipocitos y las células vasculares estromales del tejido no digerido. Lave el frasco de centelleo con 10 mililitros de KRBBS y vierta el lavado a través del filtro para recolectar las células residuales antes de incubar las muestras filtradas durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego, utilice una jeringa de 20 mililitros y una aguja de pipeteo de calibre 20 por seis pulgadas para eliminar la capa de fracción vascular estromal y transferirla a un tubo cónico limpio de 50 mililitros.

Agregue 10 mililitros de KRBBS y deje reposar las muestras en el banco durante cinco minutos a temperatura ambiente. Mantenga las fracciones vasculares estromales de ambos depósitos en hielo para su posterior procesamiento. Centrifugar las fracciones vasculares del estroma a 500 veces G durante cinco minutos a 4 grados centígrados.

Retire las muestras de la centrífuga y vierta con cuidado el sobrenadante, conservando el pellet que contiene las células de la fracción vascular estromal. Vuelva a suspender suavemente los gránulos de celda en cinco mililitros de PBS. Después de volver a centrifugar las muestras, retire el sobrenadante, vuelva a suspender las células en un mililitro de PBS y cuente las células.

Granule las muestras por tercera vez y vuelva a suspender el pellet en 100 microlitros de tampón de aislamiento CD34. Añadir 10 microlitros de cóctel CD34 e incubar la muestra durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, añade cinco microlitros de perlas magnéticas e incuba la muestra durante 10 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, añada 2,5 mililitros de tampón de aislamiento CD34 a cada muestra y coloque las muestras en el imán durante cinco minutos a temperatura ambiente. Invierta el imán durante cinco segundos para verter el tampón de aislamiento. Después de repetir este proceso cuatro veces, retire el tubo del imán y agregue dos mililitros de tampón de aislamiento CD34.

Después de otra centrifugación, vuelva a suspender los gránulos de celdas CD34+ en un mililitro de tampón de aislamiento CD34 y cuente las celdas. Vuelva a pellet las celdas y vuelva a suspender el pellet en 250 microlitros de tampón B y 250 microlitros de tampón de lavado. A continuación, vuelva a suspender completamente las perlas de CD31 mediante vórtice en el tubo, luego agregue 20 microlitros de perlas de CD31 al gránulo de celda resuspendido e incube la muestra meciéndola durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Antes de la separación de las células, agregue un mililitro de tampón de lavado para igualar el colador. A continuación, aplique la mezcla preparada de células resuspendidas en perlas de CD31 al colador. Lave el colador con cinco mililitros de tampón de lavado con movimientos circulares para obtener un volumen total de 20 mililitros.

Conecte el conector a un tubo cónico estéril de 50 mililitros y cierre el cierre de leur. Después de conectar el colador al conector, agregue un mililitro de tampón de lavado a lo largo de la pared del colador, luego agregue un mililitro de tampón D activado a lo largo de la pared del colador. Agite la muestra suavemente y cocélela durante 10 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, agregue un mililitro de tampón de lavado y separe las celdas de las perlas pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Abra la cerradura de leur y permita que las celdas separadas fluyan hacia el tubo cónico de 50 mililitros. Lave el colador 10 veces con un mililitro de tampón de lavado cada vez.

Deseche el conector y el colador, y centrifuga las muestras a 300 veces G durante 10 minutos a 4 grados centígrados. Finalmente, vuelva a suspender el pellet de la célula en dos mililitros de medio EGM2 completo para el cultivo. Cultive las células en placas tratadas con cultivo de tejidos de seis pocillos con medios EGM2 completos en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius.

Reemplace el medio cada tres o cuatro días hasta que las células alcancen un 80 a 90% de confluencia. Luego, siembre aproximadamente de 100 a 200 mil células en placas de seis pocillos, asegurando pocillos duplicados para cada depósito, y cultívelos en medios EGM2 completos durante dos días. Después de dos días, aspire cualquier medio de crecimiento.

Reemplace el medio con dos mililitros de medio DMEM/F-12 con 5% de FBS y 50 microgramos por mililitro de penicilina estreptomicina para las células de control. Para las células de tratamiento, reemplace el medio con dos mililitros de medio de adipogénesis. Incubar las células a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5% durante 13 días, reemplazando los medios respectivos cada tres o cuatro días.

Se muestran resultados representativos que muestran la morfología endotelial típica de las células CD34+CD31+ después de dos pasos en cultivo. También se ha demostrado la capacidad de las células para formar túbulos cuando se cultivan en Matrigel como se esperaba. La absorción uniforme de LDL acetilado marcado con fluorescencia muestra la presencia de una población celular homogénea con identidad endotelial.

Aquí se muestra la tinción con Oil Red O de gotas de lípidos neutros en células CD34 + CD31 + después de 13 días de inducción adipogénica. Se muestran respuestas representativas de células de depósitos de epiplón y subcutáneo de tres sujetos humanos diferentes para ilustrar la gran variabilidad en respuesta a la inducción adipogénica entre depósitos de grasa del mismo donante y entre donantes. Esta imagen muestra la tinción de lípidos intracelulares fluorescentes en células CD34 + C31 + después de la inducción adipogénica durante 13 días.

La imagen muestra células con lípidos uniloculares, lípidos multiloculares y sin acumulación de lípidos. La PCR en tiempo real muestra la expresión del marcador de adipocitos pan, adiponectina, y de los marcadores marrón beige, CIDEA y UCP-1. Estos resultados confirman que las células que siguen la inducción adipogénica expresan marcadores moleculares consistentes con un fenotipo de adipocitos blanco y beige mixto.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cinco horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe utilizar tejido adiposo humano fresco que se haya recolectado y no almacenado por más de dos horas. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la citometría de flujo, la inmunohistoquímica y la RT-PCR para identificar subconjuntos específicos de células que responden y la expresión de marcadores de adipocitos maduros que se pueden utilizar para identificar un fenotipo de adipocitos marrón beige.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la obesidad exploraran las funciones del tejido adiposo, las células vasculares y la adipogénesis en los seres humanos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar, cultivar y expandir las células CD34 + 31 +. No olvide que trabajar con tejidos humanos puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como las normas de bioseguridad, al realizar este procedimiento.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de las comorbilidades asociadas a la obesidad, como la resistencia a la insulina, ya que identifica la respuesta adipogénica de las células a una posible intervención terapéutica.