Name: Aislamiento, expansión y Adipogenic inducción de CD31 + CD34 + células endoteliales del humano omentales y subcutáneos de tejido adiposo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprende a aislar células endoteliales CD34+CD31+ de tejido adiposo humano y diferenciarlas en adipocitos blancos y beige. Este método permite estudiar la remodelación del tejido adiposo y los mecanismos de la obesidad.

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Los autores desean reconocer Becky Márquez, el Coordinador de la clínica en el centro de bariátrica Sentara su asistencia con el proceso de paciente investigación y consintiendo. Esta investigación fue apoyada por R15HL114062 a Anca D. Dobrian.

El Comité de revisión institucional en Eastern Virginia Medical School aprobó la investigación y recolección de muestras de tejido adiposo humano utilizado en el estudio. Se obtuvo consentimiento informado de los pacientes.
1. preparación de tampones, medios e instrumentos
<ol><li>Preparar una solución de Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (KRBBS): 135 mM cloruro sódico, cloruro de potasio 5 mM, sulfato de magnesio 1 m m, 0.4m m potasio Fosfato dibásico, 5,5 mM de glucosa, adenosina 1 mM, 0.01% antibiótico/antimicótico mezcla (50 μg/mL de penicilina, 50 μg/mL de estreptomicina, 30 μg/mL de gentamicina, 15 ng/mL de anfotericina) y 10 mM HEPES (pH = 7,4). Esta solución se prepara fresca cada vez para la colección de tejidos y la digestión.</li>
	<li>Preparar una solución fresca de colagenasa: 1 mg/mL de colagenasa, tipo 1, en KRBSS; hacer 3 mL/g de grasa. Precalentar la solución de la colagenasa a 37 ° C en un baño de agua antes de la digestión del tejido.</li>
	<li>Preparar un Buffer de aislamiento de células CD34: 2% de suero bovino fetal (FBS) y 1 mM EDTA en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).</li>
	<li>Preparar medios de Adipogénesis: DMEM/F12, 5% FBS, 50 μg/mL de penicilina/estreptomicina, 1.25 μl/mL de insulina humana (5 μg/mL o mU/mL 144) y 0,36 μl/mL de rosiglitazona de 2,8 mM (1 μm).</li>
	<li>Preparar una solución stock de aceite rojo O (ORO) de 0,3% (peso/volumen) disolviendo 0,3 g de ORO en 100 mL de isopropanol.</li>
</ol>2. adiposo fracción Vascular estromal de aislamiento
Nota: El estudio incluyó a una cohorte transversal de diabético obeso tipo 2 (T2D) y sujetos no diabéticos, de 18 – 65 años, sometidos a cirugía bariátrica en la Sentara metabólica y centro de cirugía de pérdida de peso (Sentara Medical Group, Norfolk, VA). Criterios de exclusión fueron una enfermedad autoinmune como diabetes mellitus tipo 1, condiciones que requieren terapia inmunosupresora crónica, medicamentos antiinflamatorios, thiazolinendiones, tabaquismo activo, infecciones agudas o crónicas o una historia de malignidad tratados dentro de los últimos 12 meses. T2D se definió como una glucemia plasmática en ayunas de 126 mg/dL o mayor, una glucosa de 200 mg/dL o mayor después de la prueba de una tolerancia a la glucosa 2 h o el uso de medicamentos antidiabéticos.
<ol><li>Recoger humano omental (OM) y subcutánea (SC) el tejido adiposo (AT) de sujetos humanos sometidos a cirugía bariátrica.</li>
	<li>Manten el OM en SC en viales independientes que contienen y tamponada con solución de Hank salina con 50 μg/mL de penicilina/estreptomicina a temperatura ambiente inmediatamente después de la extracción de tejido.</li>
	<li>Limpieza y remover secciones del tejido fibróticas y cauterizan utilizando pinzas y tijeras limpia de etanol 70% cuando la muestra llega al laboratorio después de la extracción de tejido.</li>
	<li>Pesa el tejido adiposo y alícuotas de él a 5 g (o menos) para la digestión de la colagenasa de la partición.</li>
	<li>Finamente picada 5 g de a en 5 mL de una solución de colagenasa en un vial de centelleo a temperatura ambiente, usando dos pares de tijeras.</li>
	<li>Agregar un adicional 10 mL de solución de colagenasa en el tejido picadito para total 15 mL.</li>
	<li>Digerir las muestras durante 1 h, a 37 ° C, en baño de agua con agitación continua.</li>
	<li>Cortar la punta de una jeringa de 20 mL para un extremo romo.</li>
	<li>Cortar un cuadrado de 9 cm x 9 cm de una malla de 250 μm y empuje hasta la mitad en un tubo cónico de 50 mL, utilizando la jeringa de extremo romo.</li>
	<li>Vierta las muestras en la jeringa de 20 mL extremo romo y el filtro a través de las 250 μm de malla de nylon en el tubo cónico de 50 mL para separar adipocitos y células del estroma vasculares del tejido sin digerir. Nota: No use más de 5 g de en por el tubo cónico de 50 mL, como la malla conseguir estorbada debido al exceso de material sin digerir fibrótico.</li>
	<li>Lavar el vial de centelleo con 10 mL de KRBBS y vierta a través del filtro para recoger células residuales.</li>
	<li>Incubar las muestras filtradas por 5 min a temperatura ambiente. Nota: Este paso es importante para permitir que los adipocitos a flotar en la parte superior del tubo y algunas de las células del estroma vasculares a instalarse en la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Utilizar una jeringa de 20 mL y 20 x 6 pipeteo aguja para eliminar la capa de la fracción vascular estromal y transferirlo a un tubo cónico de 50 mL limpio.</li>
	<li>Añadir 10 mL de KRBBS y permita que las muestras a sentarse en el Banco durante 5 minutos, a temperatura ambiente.</li>
	<li>Repita los pasos 2.12-2.14 dos veces. Nota: Estos pasos se aseguran de que no hay contaminación de las células del estroma vasculares con los adipocitos flotantes.</li>
	<li>Mantenga las fracciones vasculares stromal de ambos depósitos de hielo para su posterior procesamiento, tal como se describe en los pasos siguientes. Nota: No deje las células en hielo por más de 1 h, como esto puede tener un impacto en la viabilidad celular. Los adipocitos pueden ser flash-congeladas en nitrógeno líquido para el almacenamiento a largo plazo o frescos para experimentos.</li>
</ol>3. aislamiento de las células endoteliales del tejido adiposo
<ol><li>Girar las fracciones vasculares stromal (SVF) a 500 x g durante 5 minutos, a 4 ° C.</li>
	<li>Extraer las muestras de la centrifugadora y retirar cuidadosamente el sobrenadante; mantener el pellet que contiene las células SVF.</li>
	<li>Suavemente vuelva a suspender los pellets de células en 5 mL de PBS. Nota: Si más de 5 g de un depósito en fue procesado en múltiples alícuotas (vea el paso 2.4), la piscina los pellets de células juntas.</li>
	<li>Girar las muestras a 500 x g durante 5 minutos, a 4 ° C.</li>
	<li>Eliminar el sobrenadante, resuspender las células en 1 mL de PBS y contar las células. Nota: Aquí, se utilizó un contador celular automático para el recuento celular. La viabilidad celular se obtuvo mezclando 12 μl de suspensión celular con 12 μl de una solución de acridina naranja, propidio (AO/PI) (véase Tabla de materiales). El número promedio de células por gramo de AT de cada depósito es: (a) depósito de OM: 1.69 x 105 ± 4.51 x 104; (b) SC Depot: 1.24 x 105 ± 6.45 x 104. La viabilidad de las células de ambos depósitos fue > 90%.</li>
	<li>De la pelotilla de las muestras a 500 x g durante 5 minutos, a 4 ° C. Nota: Un protocolo de selección Inmunomagnética de CD34 (véase Tabla de materiales) se ha adaptado para pasos 3.7 – 3.15.</li>
	<li>Resuspender el sedimento en 100 μl de buffer de aislamiento de CD34. Nota: El recuento total requiere los volúmenes re-suspensión: (a) < 2 x 107 células: Resuspender el precipitado en 100 μl; (b) 2 x 108– 5 x 108 células: Resuspender el precipitado en 1 mL. En pasos 3.9-3.16, se redujo los volúmenes de los reactivos usados para < 2 x 107 células.</li>
	<li>Añadir 10 μl de CD34 cóctel e incubar la muestra durante 15 min, a temperatura ambiente.</li>
	<li>Añadir 5 μl de granos magnéticos e incubar la muestra durante 10 min, a temperatura ambiente.</li>
	<li>Añadir 2,5 mL de tampón de aislamiento CD34 a cada muestra y coloque las muestras en el imán, durante 5 minutos, a temperatura ambiente.</li>
	<li>Invertir el imán durante 5 s para retirar el tampón de aislamiento.</li>
	<li>Extraer las muestras del imán y repita los pasos 4 x 3.10 y 3.11.</li>
	<li>Retire el tubo del imán y añadir 2 mL de tampón de aislamiento de CD34.</li>
	<li>Sedimenten las células a 500 x g durante 5 minutos, a 4 ° C.</li>
	<li>Resuspender el pellet celular en 1 mL de tampón de aislamiento CD34 y contar las células. Nota: Aquí, el número promedio de células por gramo de a es: (a) depósito de OM: 4.75 x 104 ± 3,36 x 104; (b) SC Depot: 1.06 x 104 ± 9.53 x 103. Un protocolo de immunobead plástico CD31 fue adaptado para pasos 3.16 – 3,34 (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>De la pelotilla de las células a 500 x g durante 5 minutos y resuspender el precipitado en 250 μl de tampón B y 250 μl de tampón de lavado.</li>
	<li>Resuspender bien los granos de CD31 con un vórtex los tubos.</li>
	<li>Añadir 20 μl de CD31 granos. Nota: Debido a la célula total cuenta > 1 x 106, el volumen fue reducido según entrada del fabricante.</li>
	<li>Incubar la muestra con mecedora durante 30 min, a temperatura ambiente.</li>
	<li>Adjuntar un filtro a un tubo cónico estéril 50 mL. Nota: La apertura más grande del filtro debe estar en la parte superior.</li>
	<li>Antes de la separación celular, agregar 1 mL de tampón de lavado para equilibrar el filtro. Aplique la mezcla generada bajo paso 3.16 a la coladera.</li>
	<li>Lave el filtro con 5 mL de tampón de lavado en un movimiento circular para un volumen total de 20 mL. Acople el conector a un tubo cónico estéril de 50 mL y cierre luer-lock.</li>
	<li>Sujete la cesta al conector. Añadir 1 mL de tampón de lavado a lo largo de la pared del filtro. Añadir 1 mL de buffer activado D a lo largo de la pared del filtro. Agitar suavemente la muestra e incubar durante 10 minutos, a temperatura ambiente.</li>
	<li>Añadir 1 mL de tampón de lavado. Separar las células de los granos mediante pipeteo arriba y abajo de 10 x. Nota: Evitar la generación de burbujas de aire.</li>
	<li>Abrir la cerradura de luer y permitir que las células separadas que fluyen en el tubo cónico de 50 mL. Lavar el filtro de 10 x con 1 mL de tampón de lavado cada vez.</li>
	<li>Deseche el conector y el colador y centrifugar las muestras a 300 x g durante 10 min, 4 ° c. Resuspender el precipitado de células en 2 mL de medios EGM-2 completo de la cultura. Nota: El número promedio de células por gramo de AT en este punto es: (a) depósito de OM: 5.92 x 103 ± 4.27 x 103; (b) SC Depot: 4.12 x 103 ± 2.1 x 103. La viabilidad de las células de ambos depósitos fue superior al 90%.</li>
</ol>4. inducción de la adipogénesis en células endoteliales aisladas
<ol><li>Crecen las células en placas de cultivo de tejidos tratados 6 bien con medios EGM-2 completo en a 37 ° C, 5% CO2 incubadora. Sustituir los medios de comunicación cada 3 – 4 días hasta que las células alcancen 80-90% de confluencia. Nota: La duplicación de la población es entre 2-3 días.</li>
	<li>Ampliar las celdas por chapado en platos de Petri de 100 mm y dividir las celdas una vez de 1:3. En esta etapa, las células están en el paso 2.</li>
	<li>Recuento de las células usando una célula automática contador (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Células de la semilla aproximadamente 100-200.000 en placas de 6 pozos asegurando pocillos duplicados para cada depósito y la cultura les en completan los medios de comunicación EGM-2 durante 2 días.</li>
	<li>Aspire de cualquier medios de cultivo y reemplazarlo con 2 mL de DMEM/F12 con 5% FBS y 50 μg/mL de penicilina/estreptomicina para el control de las células y reemplazarlo con 2 mL de medio de Adipogénesis (ver paso 1.4) de las celdas de tratamiento.</li>
	<li>Incube las células a 37 ° C en un 5% humidificado CO2 incubadora durante 13 días, reemplazando los medios respectivos cada 3 a 4 días. Nota: Las células se comienzan a acumular lípidos después de 4 días de tratamiento.</li>
	<li>A cabo ORO y Nilo rojo coloración según métodos publicados15–17.</li>
	<li>Para aislar las células para una extracción de RNA, retire los medios de comunicación de las placas de inducción de 6 bien y lava con 1 mL de PBS estéril.</li>
	<li>Añadir 350 μl de una solución de tiocianato-fenol-cloroformo guanidínicos (véase Tabla de materiales) cada uno bien e incubar a temperatura ambiente durante 5-10 minutos.</li>
	<li>Raspar las células de la placa usando un raspador celular y transferir las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Nota: Las muestras pueden guardarse en el congelador de-80 ° C para la extracción de RNA y procesamiento posterior en una fecha posterior.</li>
	<li>Extraiga el mRNA de las muestras mediante una extracción de RNA adaptada del Protocolo (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Realizar una reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (RT-PCR) para evaluar la expresión del gene usando las puntas de prueba siguientes: adiponectina, UCP-1 y CIDEA (véase Tabla de materiales). Nota: Aquí, procedimientos de RT-PCR se llevaron a cabo utilizando el protocolo estándar siguiente: desnaturalización (95 ° C; 15 s), recocido y extensión (60 ° C, 1 min) para 40 ciclos. Las muestras que expresan genes con valores de CT > 35 se considera indetectable.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El enfoque de este trabajo es proporcionar una metodología para el aislamiento, expansión y adipogenic inducción de CD31 + CD34 + de las células endoteliales de los depósitos viscerales y subcutáneos de tejido adiposo humano.
Metodologías se han divulgado para el aislamiento de las células endoteliales de varios lechos vasculares de roedores o humanos que implican principalmente técnicas usando CD31 anticuerpos fluorescente etiquetado o junto a granos magnéticos18,...

La evidencia reciente muestra que tanto en ratones como en seres humanos, se puede distinguir un subconjunto de células residentes en la vasculatura de tejido adiposo en ya sea blanco o beige/brown adipocytes1,2,3. El fenotipo de estas células es un tema de controversia, con evidencias que las células endoteliales, músculo liso/pericyte o un espectro de fenotipos intermedios4,5,6,7. El alcance del desarrollo de esta metodología fue probar el potencial de adipogenic de CD31 + CD34 + células endoteliales aisladas de diferentes depósitos de grasa de los seres humanos obesos. Otros estudios en la literatura se centran en el potencial de la fracción vascular estromal total o del adipocito conocidos progenitores2,8,9adipogenic. Puesto que las tecnologías actualmente existentes pueden apuntar específicamente células endoteliales del tejido adiposo de drogas entrega10, entender el potencial de estas células a adipogenic inducción hacia adipocitos blancos o beiges es importante para futuras terapias dirigidas.
Diferentes grupos informaron la combinación de marcadores CD31 y CD34 como sustitutos para aislar las células endoteliales del tejido adiposo humano11,12,13. Por lo general, el aislamiento se realiza utilizando dos pasos secuenciales y una selección positiva mediante bolas magnéticas. En este informe, se utilizó immunoseparation usando CD34 + granos magnéticos combinados con bolas de plástico de CD31. Encontramos esta técnica superior a la immunoseparation magnético secuencial con respecto a la preservación de la morfología endoteliales típicas empedradas. También, hemos sido capaces de generar suficientes células necesarios para la expansión y adipogenic inducción a partir de tan poco como 1-2 g de grasa. Una biopsia pequeña muestra de la grasa subcutánea es suficiente para producir la cantidad necesaria de células para aplicaciones posteriores. Este aspecto es potencialmente importante, sobre todo si este método será utilizado para la detección de una respuesta a la inducción de adipogenic en sujetos humanos.
A diferencia de otros sistemas registrados en la literatura, este método utiliza sólo dos ingredientes para la inducción de adipogenic de las células de CD34 + CD31 +: un agonistas PPARy, rosiglitazona y la insulina humana. Lo importante es la cantidad de insulina utilizada cae dentro del rango de normal alta de circulante post-absorptive insulina en seres humanos14. El grado de sensibilidad a la insulina de las células en vitro, medido por el phosphorylation de Akt, no se correlaciona con su capacidad para responder a la inducción de cóctel. Curiosamente, esta inducción cóctel y experimental las condiciones de uso, una mezcla de células blancas y beige/marrón fueron obtenidos según lo determinado por el tamaño y número de gotas lipídicas intracelulares y la expresión de marcadores moleculares. Este protocolo de inducción directa y rentable junto con la evaluación cuantitativa del fenotipo de las células de la respuesta (blanca y beige) permite una proyección de agentes que potencialmente pueden alterar el equilibrio diferenciado beige : blanco adipocytes.
Este método también proporciona un enfoque traslacional para entender los mecanismos subyacentes de la adipogénesis de progenitores endoteliales vasculares en el tejido adiposo humano. Usando esta técnica de aislamiento/diferenciación específica, los investigadores pueden interrogar diversas vías responsables de Adipogénesis en un subconjunto de las células endoteliales vasculares de diferentes depósitos de grasa en los seres humanos lean y obesos.

<table><tbody><tr><td> Equipos grandes </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gabinete de bioseguridad </td><td> Nuaire </td><td> nu-425-400 </td><td></td></tr><tr><td> Incubadora de cultivo celular </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 800 DH </td><td></td></tr><tr><td> Baño de agua </td><td> Forma Scientific </td><td> 2568 </td><td> Agitador recíproco </td></tr><tr><td> Máquina RT-PCR </td><td> BIO-RAD<td> > CFX96-C1000 </td><td></td></tr><tr><td> Caja de electroforesis </td><td> BIO-RAD </td><td> Mini PROTEAN 3 celdas </td><td></td></tr><tr><td> Caja Transblot </td><td> BIO-RAD </td><td> Mini celda trans-blot </td><td></td></tr><tr><td> Electroforesis Fuente de alimentación </td><td> BIO-RAD </td><td> PowerPac Basic </td><td></td></tr><tr><td> Lector de ELISA </td><td> Molecular Devices </td><td> SpectraMax M5 </td><td></td></tr><tr><td> Lector de borrones </td><td> LI-COR </td><td> Odyssey </td><td> Infrarrojo cercano </td></tr><tr><td> Centrífuga refrigerada < </td><td> p>Eppendorf </td><td> 5810 R </td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga de sobremesa </td><td> Eppendorf </td><td> MiniSpin Plus </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio fluorescente </td><td> Olympus </td><td> BX50 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio invertido </td><td> Nikon </td><td> TMS </td><td></td></tr><tr><td> KRBSS Buffer </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Research Products International </td><td> H75030 </td><td></td></tr><tr><td> Bicarbonato de sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 792519 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de calcio dihidratado </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7902 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de potasio monobásico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5655 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfato de magnesio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 746398 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de sodio monobásico monohidratado </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9638 </td><td></td></tr><tr><td> Potasio cloruro </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> Acros Organics </td><td> 410950010 </td><td></td></tr><tr><td> Adenosina </td><td> Acros Organics </td><td> 164040250 </td><td></td></tr><tr><td> Albúmina sérica bovina </td><td> GE Biociencias de la salud </td><td> SH30574.02 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina/Estreptomicina </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 15070063 </td><td></td></tr><tr><td> <fuerte>Digestión de tejidos</fuerte> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 20 mL Jeringa </td><td> Global Medical </td><td> 67-2020 </td><td></td></tr><tr><td> Malla de nylon, 250 y micro; m </td><td> Sefar </td><td> 03-250/50 </td><td></td></tr><tr><td> Agujas de pipeteo </td><td> Popper </td><td> 7934 </td><td></td></tr><tr><td> Tijeras finas </td><td> Herramientas de ciencia fina </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzas de tejido </td><td> George Tiemann & Co </td><td> 160-20 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenasa Tipo I </td><td> Worthington Biochemical </td><td> LS004196 </td><td></td></tr><tr><td> Placas de Petri, 100 mm </td><td> USA Scientific </td><td> 5666-4160 </td><td> TC tratado </td></tr><tr><td> Tubos Eppendorf, 1.5 mL </td><td> USA Scientific </td><td> 1615-5500 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos cónicos, 15 mL </td><td> Nest Scientific </td><td> 601052 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos cónicos, 50 mL </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td><td></td></tr><tr><td> Viales de centelleo </td><td> Kimble </td><td> 74505-20 </td><td> Cubitos de tejidos </td></tr><tr><td> <fuerte>Aislamiento celular</fuerte> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Celómetro </td><td> Nexcelom </td><td> Auto 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Portaobjetos de celómetro </td><td> Nexcelom </td><td> CHT4-SD100-002 </td><td></td></tr><tr><td> Tinción de viabilidad del celómetro </td><td> Nexcelom </td><td> CS2-0106-5mL </td><td> Naranja de acridina/Propidium Yodo </td></tr><tr><td> Anti-CD34 Magnetic Beads </td><td> StemCell Technologies </td><td> 18056 </td><td> Kit </td></tr><tr><td> EasySep Imán </td><td> StemCell Technologies </td><td> 18000 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD31 Plastic Beads </td><td> pluriSelect USA </td><td> 19-03100-10 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect 10x Wash Buffer </td><td> pluriSelect USA </td><td> 60-00080-10 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect Anillo de conector </td><td> pluriSelect USA </td><td> 41-50000-03 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect Tampón de desprendimiento </td><td> pluriSelect USA </td><td> 60-00046-12 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect Tampón de incubación </td><td> pluriSelect USA </td><td> 60-00060-12 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect S Filtro de células </td><td> pluriSelect USA </td><td> 43-50030-03 </td><td></td></tr><tr><td> Cell Culture </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6-pocillos Placas </td><td> USA Scientific<td> > CC7682-7506 </td><td> TC tratado </td></tr><tr><td> 4- portaobjetos con </td><td> Corning Life Sciences </td><td> 354559 </td><td> Fibronectina recubierto </td></tr><tr><td> 4 portaobjetos con </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 154526PK </td><td> Vidrio sin recubrimiento </td></tr><tr><td> Células endoteliales microvasculares adiposas humanas (HAMVEC) </td><td> Sciencell Research Laboratories </td><td> 7200 </td><td> Primary cell line </td></tr><tr><td> Endothelial Cell Media (ECM) </td><td> ScienCell Research Laboratories </td><td> 1001 </td><td> Kit completo </td></tr><tr><td> DMEM/F12 Basal Media </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 11320082 </td><td></td></tr><tr><td> Suero fetal bovino (FBS) </td><td> Rocky Mountain Biologicals </td><td> FBS-BBT </td><td></td></tr><tr><td> Insulina </td><td> Lilly </td><td> U-100 </td><td> Humalog </td></tr><tr><td> Rosiglitazone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R2408 </td><td></td></tr><tr><td> Cell Analysis </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oil Red O Dye </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0625<td> > Preparado en isopropanol </td></tr><tr><td> 96 placas de pocillos </td><td> USA Scientific </td><td> 1837-9600 </td><td></td></tr><tr><td> 96 placas de PCR </td><td> Genesee Scientific </td><td> 24-300 </td><td></td></tr><tr><td> Extracción de ARN </td><td> Zymo Research </td><td> R2072 </td><td> Kit </td></tr><tr><td> cDNA Synthesis </td><td> BIO-RAD </td><td> 1708841 </td><td> Supermix </td></tr><tr><td> JumpStart PCR Polimerasa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9307-250UN </td><td> Arranque en caliente, con tampón de PCR N </td></tr><tr><td> Solución de cloruro de magnesio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M8787-5ML </td><td> 3 mM final en reacción de PCR </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> Promega </td><td> U1515 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan AdipoQ </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs00605917_m1 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan CIDEA </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs00154455_m1 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan RPL27 </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs03044961_g1 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan UCP1 </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs00222453_m1 </td><td></td></tr><tr><td> BCA Assay </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> QPBCA-1KT </td><td> Kit </td></tr><tr><td> Bis-acrilamida </td><td> BIO-RAD </td><td> 1610146 </td><td> 40% solución madre </td></tr><tr><td> Persulfato de amonio </td><td> BIO-RAD </td><td> 1610700 </td><td></td></tr><tr><td> TEMED </td><td> BIO-RAD </td><td> 1610800 </td><td></td></tr><tr><td> Tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> Glicina </td><td> BIO-RAD </td><td> 1610718 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfato de dodecal sódico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L3771 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> S311-100 </td><td></td></tr><tr><td> Azul de bromofenol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B8026 </td><td></td></tr><tr><td> Membrana de transferencia </td><td> EMD Millipore </td><td> IPFL00010 </td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452-SK4 </td><td></td></tr><tr><td> Odyssey Blocking Buffer, Tris </td><td> LI-COR </td><td> 927-50000 </td><td></td></tr><tr><td> Anticuerpo anti-AKT </td><td> Cell Signaling Technology </td><td> 2920S </td><td> Monoclonal de ratón </td></tr><tr><td> Anticuerpo anti-pAKT </td><td> Tecnología de señalización celular </td><td> 9271S </td><td> Conejo policlonal </td></tr><tr><td> Anticuerpo anti-UCP1 </td><td> Abcam </td><td> ab10983 </td><td> Conejo policlonal </td></tr><tr><td> Anticuerpo IgG anti-ratón </td><td> LI-COR </td><td> 926-68070 </td><td> Policlonal de Cabra, IRDye 680RD </td></tr><tr><td> Anticuerpo IgG anti-Conejo </td><td> LI-COR </td><td> 926-32211 </td><td> 3Policlonal de Cabra, IRDye 800CW </td></tr><tr><td> Anti-Rabbit IgG </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 111-025-003 </td><td> Policlonal de Cabra, TRITC </td></tr><tr><td> Solución salina tampón de fosfato </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 10010049 </td><td></td></tr><tr><td> 37% Solución de formaldehído </td><td> Electrónica Microscopy Sciences </td><td> 15686 </td><td> 4% solución para fijación celular </td></tr><tr><td> Suero de cabra normal </td><td> Vector Laboratories </td><td> S-1000 </td><td> 10% solución de permeabilidad </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X-100 </td><td> 0.1% solución de permeabilización </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> D1306 </td><td></td></tr><tr><td> Calceína AM </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 65-0853-39 </td><td> Visualización fluorescente de células </td></tr><tr><td> Matrigel Matriz de membrana basal </td><td> Corning Life Sciences </td><td> 356231 </td><td> factor de crecimiento reducido </td></tr><tr><td> DiI marcado Acetilado LDL </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> L3484 </td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento, expansión y adipogenic inducción de cd31 + cd34 + células endoteliales del humano omentales y subcutáneos de tejido adiposo

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

La obesidad se acompaña de una amplia remodelación del tejido adiposo sobre todo a través de la hipertrofia del adipocito. Crecimiento del adipocito extremas resulta en una pobre respuesta a la insulina, la hipoxia local y la inflamación. Mediante la estimulación de la diferenciación de los adipocitos blancos funcionales de progenitores, hipertrofia radical de la población de adipocitos puede prevenirse y, en consecuencia, se puede mejorar la salud metabólica del tejido adiposo junto con una reducción de inflamación. También, estimulando una diferenciación de los adipocitos beige/marrón, el gasto de energía total del cuerpo puede aumentar, lo que resulta en pérdida de peso. Este enfoque podría prevenir el desarrollo de comorbilidades de la obesidad como diabetes tipo 2 y enfermedad cardiovascular.
Este papel describe el aislamiento, expansión y diferenciación de los adipocitos blancos y beiges de un subconjunto de las células endoteliales humanas de tejido adiposo que conjuntamente expresan los marcadores CD31 y CD34. El método es relativamente barato y no se requiere mano de obra. Requiere acceso a tejido adiposo humano y el depósito subcutáneo es adecuado para el muestreo. De este protocolo, muestras de tejido adiposo fresco de sujetos obesos mórbidos [índice de masa corporal (IMC) > 35] se recogen durante los procedimientos de cirugía bariátrica. Utilizando un immunoseparation secuencial de la fracción vascular estromal, se producen suficientes células desde tan poco como 2-3 g de grasa. Estas células pueden ampliarse en cultura durante 10 – 14 días, pueden ser criopreservadas y retienen sus propiedades adipogenic con pases hasta el paso 5 y 6. Las células se tratan durante 14 días con un coctel utilizando una combinación de la insulina humana y lo agonistas PPARy-rosiglitazona adipogenic.
Esta metodología puede utilizarse para la obtención de la prueba de los experimentos de concepto en los mecanismos moleculares que conducen a respuestas adipogenic en adiposas células endoteliales, o para la detección de nuevos fármacos que pueden mejorar la adipogenic respuesta dirigida ya sea hacia el blanco o diferenciación del adipocito marrón/beige. Utilizando pequeñas biopsias subcutáneas, esta metodología puede utilizarse para descartar temas no respondedor ensayos clínicos dirigidos a estimular los adipositos beige/marrón y blanco para el tratamiento de la obesidad y comorbilidades.

Nuestro protocolo tiene como objetivo proporcionar un enfoque en vitro para determinar el potencial de adipogenic de CD31 + CD34 + células vasculares de diferentes depósitos de tejido adiposo humano. En la figura 1Ase muestra un diagrama de diagrama de flujo simplificado. El primer paso mediante una selección positiva de CD34 expresando células resulta en &gt; 95% CD34 + células en la población de las células recién aisladas (fig...

La diferenciación de los adipocitos blancos y beiges de tejido adiposo vascular progenitores tiene potencial para mejoramiento metabólico en obesidad. Se describen los protocolos para un CD34 + CD31 + aislamiento de células endoteliales de la grasa humana y un posterior en vitro expansión y diferenciación a adipocitos blancos y beiges. Se discuten varias aplicaciones posteriores.

Aislamiento, expansión y Adipogenic inducción de CD31 + CD34 + células endoteliales del humano omentales y subcutáneos de tejido adiposo

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la obesidad, como la identificación de los factores y mecanismos clave que impiden una respuesta adipogénica robusta durante la remodelación del tejido adiposo. La principal ventaja de esta técnica es que permite el aislamiento de células endoteliales CD34+CD31+ del tejido adiposo humano a partir de pequeñas cantidades de tejido. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando quisimos identificar células en la vasculatura adiposa humana que responden a la estimulación adipogénica.La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de aislamiento celular son difíciles de practicar debido al acceso a menudo limitado al tejido adiposo humano fresco. Recolectar tejido adiposo epiplónico y subcutáneo humano de sujetos humanos sometidos a cirugía bariátrica. Inmediatamente después de la extracción del tejido, mantenga el tejido adiposo onípico y subcutáneo humano en viales separados que contengan la solución salina tamponada de Hank con 50 microgramos por mililitro de penicilina estreptomicina a temperatura ambiente.Una vez que la muestra llega al laboratorio después de la extracción del

isolation-expansion-adipogenic-induction-cd34-cd31-endothelial-cells

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video demuestra una técnica para aislar y cultivar células madre adiposas (ADSC) derivadas de la cresta neural marcadas con fluorescencia a partir de tejido adiposo del arco periaórtico murino. Tras el aislamiento, las NCADSC se detectan, se clasifican mediante la clasificación celular activada por fluorescencia y, posteriormente, se cultivan en una placa, lo que promueve la proliferación celular.

Aislamiento de células madre derivadas del tejido adiposo periaórtico murino

La heterogeneidad transcripcional dentro de las células estromales derivadas del tejido adiposo humano se puede definir a nivel de célula individual utilizando marcadores de superficie celular y genes osteogénicos.  Describimos un protocolo que utiliza citometría de flujo para el aislamiento de subpoblaciones celulares con mayor potencial osteogénico, que puede usarse para mejorar la reconstrucción esquelética craneofacial.

El aislamiento y enriquecimiento de Human adiposo derivado de células estromales de la osteogénesis mejorada

Aquí se informa un método para el aislamiento de las poblaciones de células progenitoras de adipocitos (APC) de tejido adiposo perivascular (PVAT) utilizando clasificación de células activadas magnéticamente (MCS). Este método permite un mayor aislamiento de APC por gramo de tejido adiposo cuando se compara con la Clasificación de Células Activadas por Fluorescencia (FACS).

Expansión y Adipogénesis Inducción de Progenitores Adipocíticos de Tejido Adiposo Perivascular Aislado por Clasificación de Células Magnéticas Activadas

Este protocolo describe el enfoque técnico para aislar subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos murinos de tejido adiposo blanco intraabdominal (WAT) mediante clasificación celular activada por fluorescencia o separación inmunomagnética de perlas.

Aislamiento de subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos adiposos intraabdominales murinos

Presentamos un método simple para aislar células progenitoras adiposas altamente viables de las almohadillas de grasa epidídmica del ratón usando clasificación celular activada por fluorescencia.

Preparación de células progenitoras adiposas de tejidos adiposos epidídicos del ratón

Este protocolo detalla un método para la disección de depósitos adiposos de ratón y el aislamiento y la digestión de las arterias respectivas para liberar y luego identificar la población de células endoteliales. Las células recién aisladas utilizadas en aplicaciones posteriores avanzarán en la comprensión de la biología celular vascular y los mecanismos de la disfunción vascular.

Aislamiento e identificación de células endoteliales vasculares de distintos depósitos adiposos para aplicaciones posteriores

Este protocolo describe una metodología para aislar e identificar células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (MSC) de ratas Sprague Dawley.

Aislamiento e identificación de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo de ratas Sprague Dawley

Este protocolo describe el aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal (SVF) del tejido adiposo murino para obtener preadipocitos y lograr la diferenciación de los adipocitos in vitro. El uso de un disociador de tejidos para la digestión de la colagenasa reduce la variación experimental y aumenta la reproducibilidad.

Aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal del tejido adiposo blanco murino utilizando un disociador tisular

En este trabajo se describe el aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón, lo que permite estudiar la función del tejido adiposo perivascular y su relación con las células vasculares.

Aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón

El tejido adiposo es una excelente fuente de células madre mesenquimales. Aquí, traemos el paso a paso de la extracción, el cultivo y la caracterización de células madre derivadas del tejido adiposo (ADSC) del tejido adiposo epididimario de ratones suizos.

Aislamiento, expansión in vitro y caracterización de células madre mesenquimales a partir de tejido adiposo epididimario de ratón

El tamaño y la fragilidad de los adipocitos maduros han limitado las técnicas y herramientas disponibles para su estudio y aislamiento. En este trabajo se describe un protocolo para el aislamiento de adipocitos murinos maduros, que puede adaptarse fácilmente a diferentes depósitos de adiposo y dietas de ratones.

Aislamiento y cultivo de adipocitos murinos primarios de ratones delgados y obesos

Aprende a aislar células endoteliales CD34+CD31+ de tejido adiposo humano y diferenciarlas en adipocitos blancos y beige. Este método permite estudiar la remodelación del tejido adiposo y los mecanismos de la obesidad.

Aislamiento, expansión y Adipogenic inducción de CD31 + CD34 + células endoteliales del humano omentales y subcutáneos de tejido adiposo (Video) | JoVE Journal

Aislamiento, expansión y Adipogenic inducción de CD31 + CD34 + células endoteliales del humano omentales y subcutáneos de tejido adiposo

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