Análisis colorimétrico de lactato intracelular en pequeña escala y del piruvato en el nematodo Caenorhabditis elegans

Esta investigación puede ayudar a responder a cualquier pregunta en el campo del recuento de bioquímica y la metodología, como un análisis de los derechos de desarrollo en nematodos. La principal ventaja de esta técnica es la precipitación proteica en la extraducción y la bebida y homogeneización de los gusanos. Comience este experimento cultivando la cepa E.coli OP50 en 300 mililitros de caldo LB medio líquido a 37 grados Celsius durante la noche.

Almacene el OP50 exitoso a cuatro grados centígrados. Pipetear dos mililitros del OP50 cultivado en un mínimo de tres NGM previamente preparados, o placas de agar de medios de crecimiento de nematodos y se extienden a mano girando la placa. Incubar las placas a temperatura ambiente durante la noche para crear una capa delgada de OP50.

A continuación, utilice un palillo de dientes estéril para recoger un pedazo de agar de un plato con gusanos, para agregar al menos 100 gusanos a cada placa OP50 NGM. Cultivo de al menos tres placas con los gusanos a 20 grados Celsius, hasta que los gusanos alcanzan la etapa adulta, que se confirma bajo microscopio estereoscópico. Localice hermafroditas gravitacionales llenas de huevos con un microscopio estereoscópico.

Después de añadir cinco mililitros de S-buffer a las placas, utilice la pipeta Pasteur para transferir los gusanos de las tres placas a un tubo cónico de 15 mililitros. Lave los gusanos tres veces añadiendo 15 mililitros de S-buffer y luego centrifugando a 300 veces G a temperatura ambiente durante 30 segundos. Si el volumen de S-buffer supera los cinco mililitros, elimine el búfer sobrante después de la centrifugación.

Para una exonización exitosa y aislamiento de óvulos a granel, disolver los gusanos en 0,5 mililitros de solución de hipoclorato alcalino. Mezclar invirtiendo e incubar a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos. Centrifugar a 1.400 RPM durante 30 segundos para extraer la solución.

Utilice 15 mililitros de S-buffer para lavar el pellet de huevo. Después de centrifugarlo, retire el sobrenadante y repita este lavado al menos tres veces. Después del último lavado, suspendemos el pellet en cinco a seis mililitros de S-buffer, sin E.coli e incubamos los huevos durante la noche a 20 grados celsius para incubarlos y lograr el cultivo síncrono H de larvas de la etapa L1.

Pipetear 10 microlitros de S-buffer que contienen gusanos L1 en tres resbalones de cubierta. Cuente las larvas bajo un microscopio estereoscópico y calcule el promedio para determinar el número aproximado de larvas de etapa L1. Finalmente, transfiera las larvas de etapa L1 a cinco placas de agar NGM con OP50 y creció a 20 grados centígrados hasta la etapa adulta joven, durante la cual se produce la autofertilización y se ponen unos pocos huevos.

Observe los gusanos todos los días bajo el microscopio y luego recoja al joven adulto, o gusanos de cinco días de edad. Para seleccionar solo gusanos vivos, agregue los gusanos suspendidos en tres a cuatro mililitros de S-buffer a un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, agregue un volumen igual de 60% de sacarosa helada y mezcle.

Centrifugar el tubo a 1.500 veces G a cuatro grados centígrados durante 15 segundos. A continuación, utilice una pipeta Pasteur para mover cuidadosamente los gusanos de la pared del tubo, y luego retire los gusanos flotantes en un tubo fresco. Llene el tubo con S-buffer para lavar los gusanos, y centrifugar a 1500 veces G a cuatro grados Celsius durante 30 segundos.

Retire el tampón y repita el lavado dos veces más. Después del tercer lavado, retire cuidadosamente el sobrenadante, asegurándose de no quitar ningún gusano, y utilice una punta de pipeta de 1.000 microlitros para medir el volumen húmedo de los gusanos lavados. Para la precipitación de proteínas, utilice una pipeta Pasteur para añadir los gusanos lavados a un volumen igual de ácido tricloroacético frío en frío 10% en un homogeneizador colocado en hielo.

Homogeneizar usando 40 golpes de passel con rotación, hasta 1, 300 RPM. Utilice un homogeneizador ultrasónico con un ciclo de trabajo del 20% para sonicar el homogeneizar. Utilice una pipeta Pasteur para transferir el homogeneato a un tubo de 1,5 mililitros colocado sobre hielo.

Después de transferir el homogeneizar a un tubo de micro centrífuga, centrifugar a 8.000 veces G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos para aclararlo. Transfiera el sobrenadante a un tubo fresco y agregue cuatro cloruros de potasio molar e incubar sobre hielo durante 20 minutos para neutralizarlo. Luego centrífla a 8.000 veces G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.

Transfiera el sobrenadante a un tubo fresco y guárdelo a 80 grados Celsius hasta que sea necesario para ensayos posteriores. Para medir la concentración de lactato, utilice un kit de ensayo colorimétrico para realizar análisis duplicados para las muestras de prueba. Agregue 10 microlitros de las muestras de prueba a cada pozo de una placa de 96 pozos y, a continuación, agregue el búfer de ensayo de lactato a cada muestra para ajustar el volumen a 15 microlitros.

Diluir 100 mililitros de L+Lactato Estándar con tampón de ensayo de lactato a un milimolar. Luego, en una serie de pozos, agregue cero, dos, cuatro, seis, ocho y 10 microlitros de L+Lactato Standard diluido. Añadir 50 microlitros de mezcla de reacción a cada pozo, e incubar a temperatura ambiente protegida de la luz durante al menos 30 minutos para que el color se desarrolle.

Por último, utilice un lector de microplacas para medir la absorbancia de cada pozo a 570 nanómetros. Restar la absorbancia de la mezcla de control de fondo de la absorbancia de la mezcla de reacción. A continuación, trazar la curva estándar de lactato, y calcular las concentraciones de lactato de la curva multiplicando cada concentración por 2,25.

Utilice un kit de ensayo colorimétrico para medir la concentración de piruvato en las muestras de ensayo y realizar exámenes dúplex. Agregue 10 microlitros de las muestras de prueba a diferentes pozos de una placa de 96 pozos y agregue 90 microlitros de reactivo de trabajo a cada muestra. Incubar cubierto durante 30 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, coloque la placa en el lector de microplacas para medir la absorbencia de cada pozo a 570 nanómetros. Trazar la curva estándar del piruvato y calcular las concentraciones de piruvato a partir de la curva estándar multiplicando cada concentración por 2,25. Y por último, para medir la concentración de proteínas en las muestras de ensayo, utilice un kit de ensayo colorimétrico como se describe en el protocolo de texto.

Después de la precipitación proteica, los ensayos colorimétricos se pueden utilizar para la determinación cuantitativa de las concentraciones de lactato y piruvato. Este experimento muestra la precisión de los ensayos colorimétricos contrarios a los informes anteriores en C.Elegans. Además, estos ensayos son lo suficientemente sensibles para medir las concentraciones de lactato y piruvato, incluso en muestras a pequeña escala en un corto período de tiempo.

Para detectar con precisión el lactato y el piruvato en C.elegans, es crucial realizar precipitación proteica durante la homogeneización de los gusanos. La cantidad de lactato y piruvato detectados es mayor cuando las muestras se precipitan a proteínas durante la homogeneización, en comparación con la fracción citosólica intacta o después de la homogeneización cuando no se detectó lactato o piruvato en absoluto.