Multimodal volumétrica retina imágenes por exploración oblicua oftalmoscopia de láser (oSLO) y tomografía de coherencia óptica (OCT)

Aquí, presentamos un protocolo para obtener una imagen retiniana OCT y fluorescencia (3D) tridimensional de gran campo de visión (FOV) mediante una novedosa plataforma multimodal proyección de imagen. Vamos a introducir la configuración del sistema, el método de alineación y protocolos operacionales. Se demostrará en vivo la proyección de imagen, y se proporcionará resultados representativos.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la oftalmología y las imágenes de la retina. Tales como la obtención de imágenes y la cuantificación de la disrupción de la barrera hematorretiniana y las funciones capilares de la retina. La principal ventaja de esta técnica es que puede obtener un gran campo de visión, imágenes de retina tridimensionales y de contraste múltiple mediante el uso de un láser de escaneo oblicuo en un solo escaneo de trama.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de la retinopatía diabética y otras enfermedades prerretinianas. Porque oSLO puede obtener imágenes de alto contraste de la microvasculatura de la retina, hasta capilares individuales en 3D. Aunque este método puede proporcionar información sobre las imágenes de la retina, también se puede aplicar a otros sistemas de imágenes que utilizan lentes de objetivo convencionales.

Por ejemplo, la obtención de imágenes in vivo de la corteza del ratón. Se utiliza una fuente láser supercontinua como fuente láser del sistema para la oftalmoscopia láser de barrido oblicuo, o configuración oSLO. El rango de luz visible está separado del rango de longitud de onda más alta por el primer espejo dicroico.

El espectro de luz se expande con un par de prismas dispersivos, después de que el haz pasa a través de un divisor de haz de polarización. Se utiliza una rendija para seleccionar el rango de longitud de onda de excitación. Y un espejo reflectante refleja el haz filtrado de vuelta al par de prismas para acoplar la luz en una fibra monomodo.

Se utiliza un espectrómetro para confirmar la selección de la longitud de onda en la salida de la fibra monomodo. La fibra monomodo está conectada a dos acopladores de fibra óptica en cascada. Uno de los puertos de salida de fibra del segundo acoplador de fibra entrega la luz al sistema oSLO.

Para colimar el láser en el sistema oSLO, el láser es desviado por un espejo galvanómetro. Un sistema de telescopio uno a uno transmite el láser a un segundo espejo galvanómetro, y un sistema de telescopio de tres a uno transmite aún más el láser a la pupila del ojo. Un espejo dicroico dentro del sistema de telescopio de tres a uno refleja las señales fluorescentes.

El sistema telescópico de tres a uno y el espejo dicroico están montados en un deslizador de cola de milano personalizado para compensar el eje óptico y crear la iluminación de escaneo oblicua. La iluminación oblicua permite la obtención de imágenes de fluorescencia volumétrica sin necesidad de tener seccionamiento. Al desplazar el láser, un haz oblicuo se enfoca en la retina y, a continuación, la detección oblicua puede capturar una imagen de fluorescencia tomográfica a lo largo de la trayectoria del haz oblicuo.

Para crear la trayectoria óptica de la imagen de fluorescencia, la fluorescencia es reflejada por el espejo dicroico y retransmitida al tercer espejo galvanómetro. A continuación, la luz fluorescente se transmite a una lente de objetivo de imagen mediante otro sistema de telescopio uno a uno. Se instalan dos etapas de traslación adicionales debajo del tercer espejo galvanómetro para proporcionar redundancia en los grados de libertad para optimizar la imagen.

El sistema de imagen final está montado en un escenario que tiene tres grados de libertad. Rotación, y dos ejes de traslación. Se utiliza una cámara plana para capturar las imágenes de fluorescencia de sección transversal.

Otro espejo dicroico separa el rango infrarrojo trasero de la luz restante. Se utiliza un filtro de paso largo para limitar aún más el ancho de banda a 800 a 900 nanómetros. Acople el haz en una fibra monomodo.

La fibra monomodo se conecta al otro puerto de entrada de los dos acopladores de fibra óptica en cascada para combinarse con la excitación azul oSLO. La luz del segundo puerto de salida del segundo acoplador de fibra se dirige al brazo de referencia OCT. Que tiene placas de compensación de dispersión, filtro de densidad neutra variable y un espejo reflectante.

El retorno de luz del brazo de referencia y el ojo se recombina en el segundo acoplador de fibra óptica y se entrega al espectrómetro OCT para recoger la señal. Utilice un software de sistema de adquisición de datos escrito en Labview y modificado a partir del protocolo de escaneo OCTA. Para cada b-scan, una placa de salida analógica emite un diente de sierra con un ciclo de trabajo del 80% con 500 pasos para controlar el espejo de escaneo rápido x-prime.

Active la cámara de escaneo lineal en cada paso para adquirir datos para la OCT, solo cuando el espejo esté en la dirección de escaneo hacia adelante. Establezca el tiempo de exposición de la cámara de escaneo lineal en 17 microsegundos. Para adquirir la señal OCTA, repita la medición cinco veces en la misma ubicación de b-scan.

Establezca la velocidad de salida de AO en 100 kilohercios y la velocidad de la línea A de OCT en 50 kilohercios. Controle el espejo de escaneo lento y-prime, GM1, mediante una forma de onda en rampa. Sincronice el espejo de deescaneo, GM3, con GM1 para eliminar el escaneo lento.

Dispare la cámara plana mediante otra placa de salida analógica para capturar una imagen fluorescente en cada ubicación y-prime. Recorte el tamaño de la imagen o agrupe los píxeles vecinos para aumentar la velocidad y la sensibilidad según lo desee. Comience por confirmar un nivel adecuado de anestesia en la rata por la falta de un reflejo de retirada durante un pellizco intradigital.

Después de la inducción de la anestesia, coloque la rata en un soporte. Coloque un cono en la nariz para mantener la anestesia durante el resto del experimento. Aplique la solución oftálmica de clorhidrato de tetracaína 5 en el ojo de rata para anestesia local.

A continuación, dilatar la pupila con una solución oftálmica de tropicamida al 1%. Después de dos minutos de dilatación, use una jeringa de un mililitro y una aguja de calibre 29 para inyectar fluoresceína al 10% o FITC al 10% diluido en solución salina a través de la vena de la cola. A continuación, encienda la fuente láser y coloque un filtro de densidad neutra para atenuar la excitación de la luz azul durante la alineación.

Mida la potencia de la luz azul, asegurándose de que sea inferior a 10 microvatios. Luego cambie a la luz de tomografía de coherencia óptica, asegurándose de que esté cerca de 8 milivatios. Encienda la fuente de alimentación del espejo del galvanómetro, que se utiliza para controlar la dirección del láser.

Ajuste la altura del globo ocular para crear un punto láser estacionario en la córnea. Ajuste la posición del ojo para que el borde de la pupila sea aproximadamente perpendicular al láser. Y desplaza el láser a aproximadamente 1,5 milímetros del centro apical del ojo.

Ajuste aún más el soporte del animal hasta que las imágenes de tomografía de coherencia óptica alcancen la calidad óptima. En la dirección de escaneo rápido x-prime, asegúrese de que la imagen de escaneo b de la sección transversal aparezca plana. Al cambiar a la dirección de escaneo lento y-prime, asegúrese de que la imagen de escaneo b de la sección transversal aparezca inclinada debido al escaneo oblicuo.

Retire el filtro de densidad neutra a la excitación de luz azul. Y monitoree la transmisión en tiempo real de la cámara. Debe aparecer una imagen fluorescente transversal que muestre los vasos sanguíneos a diferentes profundidades.

Ajuste el enfoque del sistema de imágenes de fluorescencia final para alcanzar el enfoque óptimo. Y realice ajustes finos de la posición del ojo en el plano lateral para alcanzar una calidad óptima de imagen de oftalmoscopia láser de escaneo oblicuo. Después de la alineación, comienza a adquirir simultáneamente la angiografía por tomografía de coherencia óptica y la angiografía con fluoresceína volumétrica.

Esta imagen muestra una imagen de tomografía de coherencia óptica transversal de la retina de una rata. Se trata de una angiografía por tomografía de coherencia óptica, o imagen OCTA, de la misma región. Y una oftalmoscopia láser de barrido oblicuo y una angiografía volumétrica con fluoresceína por imagen, angiografía con fluoresceína transversal, o oSLO-VFA.

Análogo a la tomografía de coherencia óptica b-scan. En comparación con OCTA, la oftalmoscopia láser de barrido oblicuo y la imagen transversal de angiografía volumétrica con fluoresceína identifican claramente los capilares en la capa plexiforme externa. La capa superficial de la retina se muestra aquí en una imagen OCTA.

Los artefactos en forma de rayas verticales son visibles en la imagen. oSLO-VFA evita los artefactos de movimiento mediante el uso de contraste de emisión de fluorescencia. Dentro de la capa intermedia de la retina, los vasos que bucean verticalmente se muestran claramente en la imagen oSLO FA.

Pero no es evidente en OCTA. Al intentar este procedimiento, es importante evitar la exposición continua del láser al ojo durante más de dos minutos. Evite la sequedad de la córnea y permita que el ojo descanse al menos 30 segundos entre secciones de imágenes bloqueando la luz.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la obtención de imágenes de ratones modificados genéticamente para expresar proteínas de fluorescencia, con el fin de responder a preguntas adicionales. Por ejemplo, cómo pueden cambiar tipos específicos de células de la retina y las variables observadas en el pasado con enfermedades conocidas.