Name: Multimodal volumétrica retina imágenes por exploración oblicua oftalmoscopia de láser (oSLO) y tomografía de coherencia óptica (OCT) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Aprende a obtener imágenes retinianas volumétricas multimodales mediante oSLO y OCT de campo amplio en 3D. Esta técnica permite visualizar capilares individuales y evaluar la barrera hematorretiniana para diagnóstico oftalmológico.

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Financiamiento es de la financiación de Fundación Evans médicos de Boston Medical Center así como un subcontrato de NIH 5R01CA183101, piloto de BU-CTSI conceder 1UL1TR001430, programa piloto Joslin BU y BU-CTSI KL2TR001411.

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado Animal y uso Comité (ACUC) del centro médico de Boston.
1. configuración del sistema
<ol><li>Sistema de oSLO<ol>
<li>Utilizar una fuente láser de supercontinuum como la fuente de láser de sistema.<ol>
<li>Separar la gama ligera visible (450-650 nm) de mayor rango de longitud de onda (nm 650-2000) por un espejo dicroico (DM1). Ampliar el espectro con un par de prismas de dispersión después de la viga pasa a través de un divisor de haz de polarización (PBS).</li>
			<li>Lugar una rendija para seleccionar la gama de longitud de onda de excitación (475-495 nm). Use un espejo reflexivo para reflejar el rayo filtrado al par del prisma y luego acoplar la luz en una fibra monomodo (SMF 1).</li>
			<li>Utilice un espectrómetro para confirmar la selección de la longitud de onda en la salida de la fibra del solo modo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Conectar la fibra del solo modo con dos acopladores de fibra óptica en cascada como se muestra en la figura 2. Uno de los puertos de salida de fibra desde el segundo acoplador de fibra ofrece la luz para el sistema de oSLO.</li>
		<li>Colimar el láser primero en el sistema de oSLO.<ol>
<li>Desviar el láser por el espejo de un galvanómetro (GM1). Relé el láser a un segundo espejo del galvanómetro (GM2) por un sistema de telescopio de 1:1 y otras relé a la pupila del ojo mediante un sistema de telescopio de 3:1.</li>
			<li>Instale un espejo dicroico (DM2) en el sistema del telescopio de 3:1 para reflejar las señales de fluorescencia.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Montar el sistema del telescopio de 3:1 y el espejo dicroico (DM2) en un deslizador de cola de Paloma modificado para requisitos particulares para compensar el eje óptico y crear el oblicuo análisis de iluminación como se muestra en la figura 3. Use un calibrador para controlar con precisión la longitud de desplazamiento como se desee.</li>
		<li>Camino óptico de fluorescencia.<ol>
<li>Reflejar la fluorescencia por el espejo dicroico y relé para el tercer espejo del galvanómetro a la exploración la exploración lenta.</li>
			<li>Relé de la luz a una imagen objetivo por otro sistema de telescopio de 1:1. Instalar la óptica arriba en una etapa de la traducción. Nota: Dos etapas de traducción adicionales se instalan en el tercer espejo del galvanómetro (GM3) para proporcionar redundancia en los grados de libertad para optimizar la proyección de imagen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Montar un sistema de proyección de imagen final en un escenario que tiene tres grados de libertad (rotación y dos ejes de la traducción). Utilice una cámara planar para capturar las imágenes de fluorescencia transversal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sistema de tomografía de coherencia óptica<ol>
<li>Utilizar la misma fuente de laser de supercontinuum como la fuente de láser de sistema.<ol>
<li>Separar la gama cerca de (NIR) infrarroja (650-900 nanómetro) la luz restante (650-2000 nm) por otro espejo dicroico (DM3). Utilice un filtro de pase largo para limitar aún más el ancho de banda de 800-900 nm. Pareja la viga en una fibra monomodo (SMF 2).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Conecte la fibra del solo modo al puerto de entrada de los dos acopladores de fibra óptica en cascada para combinar con la excitación de oSLO azul. Dirigir la luz desde el segundo puerto de salida del segunda fibra acoplador para el brazo de referencia OCT, que tiene un filtro de densidad neutra variable (VNDF), las placas de compensación de dispersión y un espejo reflectante. Nota: La luz devuelta desde el brazo de referencia y el ojo recombina en el segundo acoplador de fibra óptica y se entrega al espectrómetro de OCT para recoger la señal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adquisición de datos<ol>
<li>Utiliza un software de sistema de adquisición de datos escrito en LabVIEW y modificado a partir del Protocolo de exploración de OCTA7,8,9,10. Para cada B-scan, un ciclo de deber del 80% que la sierra diente con 500 pasos salida por una placa de salida analógica (OA1) controlar la x' espejo de escaneado rápido, GM2.</li>
		<li>Activar la cámara de exploración por línea en cada paso para la adquisición de datos para los PTU solamente cuando el espejo está en adelante dirección de análisis. Establecer el tiempo de exposición de la cámara de exploración de línea que 17 μs.</li>
		<li>Para adquirir la señal de la OCTA, repita la medición 5 veces en el mismo lugar de B-scan.</li>
		<li>Establecer la tasa de salida AO a 100 kHz y la tasa-Vestido de noche de OCT a 50 kHz. Control de la y' lento análisis espejo, GM1, por una forma de onda de rampa. Sincronizar el espejo de la exploración, GM3, con GM1-escanear la exploración lenta.</li>
		<li>Activar la cámara planar por otro tablero de salida analógica (AO2) para capturar una imagen fluorescente en cada y' ubicación. Recortar el tamaño de imagen o bin los píxeles vecinos para aumentar la velocidad y la sensibilidad deseada.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. el sistema alineación
<ol><li>Ajuste la abertura en la fuente de luz de oSLO para seleccionar la longitud de onda de excitación azul. Usar un espectrómetro para monitorear el espectro para ser alrededor de 475-490 nm.</li>
	<li>Ajuste el regulador de montaje de cola de Paloma para desplazar el eje óptico por ~ 5 mm. Esto dará lugar a un desplazamiento en la pupila de rata ~1.7 mm, resultando en un ángulo oblicuo de ~ 15° en la retina.</li>
	<li>La misma de 5 mm para ajustar la etapa de la traducción de la óptica de detección de fluorescencia.</li>
	<li>Ajustar la fluorescencia final proyección de imagen para que sea ~ 30°.</li>
	<li>Medir la potencia óptica usando un medidor de potencia. Asegúrese de que el poder de excitación azul de oSLO es ≤0. 2 mW y OCT láser potencia ≤0.8 mW, que no causa daños de la retina. Nota: Basado en el estándar ANSI, es la máxima exposición permisiva (MPE) a la retina a nivel de ~ 2mW7,8 en la gama de luz visible. Según la fórmula por Delori et al. 9, el error máximo permitido para la luz infrarroja cercana es aproximadamente dos veces mayor que la luz visible, en cerca de 4 mW.</li>
</ol>3. en Vivo experiencia con animales
<ol><li>Transferencia de una rata de Evans largo macho de 12 semanas en la cámara de inducción. Anestesiar la rata con 4.5% de isoflurano en oxígeno durante 10 minutos con un caudal de 2 L/min por un vaporizador de isoflurano.<ol>
<li>Confirmar la profundidad de la anestesia según lo determinado por la falta del reflejo de retirada durante una pizca interdigital.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de la inducción, colocar la rata en un soporte de 5 ejes (x, y, traducciones de z, yaw y pitch). Proporcionar calor suplementario por el uso de una platina calefactada, manta de agua caliente u otro método adecuado en una experiencia prolongada de circulación. Mantener la anestesia en el 1,5% de isofluorane con un caudal de 2 litros/minutos durante la parte restante del experimento. Al no utilizar una cámara de inducción con escape activo, la cámara de inducción debe colocarse en una mesa de backdraft o campana extractora de encimera o bajo un snorkel para compactar isoflurano.</li>
	<li>Dilatar a la pupila con tropicamida solución oftálmica al 1% durante 2 minutos. Aplique solución oftálmica al 0.5% ácido clorhídrico del Tetracaine en el ojo de la rata para la anestesia local adicional, si es necesario. Mantener el ojo hidratado con lágrimas artificiales comerciales al menos una vez cada minuto durante el experimento.</li>
	<li>Inyectar fluoresceína sal (10% w/w) o FITC (10% w/w) diluido en solución salina estéril (0.1-0.3 mL) a través de la vena de la cola con un 1 mL aguja de jeringa y 29G.</li>
	<li>Encienda la fuente de láser. Coloque un filtro de densidad neutra para atenuar la excitación de luz azul durante la alineación. Medir la potencia de la luz OCT ~0.8 mW y la luz azul < 0,01 mW para evitar la formación de cataratas.</li>
	<li>Iniciar el modo de exploración y la alineación del galvanómetro. Ajuste la altura de la bola del ojo para hacer un láser estacionario mancha en la córnea. Ajustar la posición del ojo de rata para hacer el borde de la pupila más o menos perpendicular al láser y offset el láser al centro del ojo de ~1.5 mm apical.</li>
	<li>Más ajustar el soporte del animal hasta imágenes de OCT una calidad óptima. En el x' exploración rápida de dirección, asegúrese de que la imagen B-scan transversal aparezca plana. Cuando se cambia la y ' lenta exploración dirección, asegúrese de que la imagen B-scan de sección aparece inclinada, debido a la exploración oblicua.</li>
	<li>Retire el filtro de densidad neutra para la excitación de luz azul y monitorear el alimentación de la cámara en tiempo real. Imagen fluorescente seccional cruzada debe aparecer mostrando vasos que aparecen en diferentes profundidades.<ol>
<li>Ajuste el enfoque de la fluorescencia final sistema para alcanzar el objetivo óptimo de imagen. Permite un ajuste fino de la posición del ojo en el plano lateral para alcanzar una óptima calidad de imagen de oSLO.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de la alineación, empieza a adquirir OCTA simultánea y angiografía de la fluoresceína volumétrica (vFA).</li>
	<li>Construir las imágenes volumétricas de OCTA y oSLO por Matlab. Los algoritmos son descritos en detalle10. Generar vasculatures retinianas profundidad resuelta por segmentación de la imagen.</li>
	<li>Después de terminar la proyección de imagen, apagar el láser, liberar el animal y aplicar alguna pomada oftálmica en los ojos y luego coloque el animal en una caja de recuperación.</li>
	<li>No descuide el animal hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal o según política institucional.</li>
</ol>

<ol><li>Webb, R. H., Hughes, G. W., Delori, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+scanning+laser+ophthalmoscope%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Optics%22%5BJournal%5D)">Confocal scanning laser ophthalmoscope.</a> Applied Optics. 26 (8), 1492-1499 (1987).</li>
<li>Roorda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+optics+scanning+laser+ophthalmoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy.</a> Optics Express. 10 (9), 405-412 (2002).</li>
<li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4638169/">Optical coherence tomography.</a> Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).</li>
<li>de Carlo, T. E., Romano, A., Waheed, N. K., Duker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+optical+coherence+tomography+angiography+%28OCTA%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Retina+and+Vitreous%22%5BJournal%5D)">A review of optical coherence tomography angiography (OCTA).</a> International Journal of Retina and Vitreous. 1 (1), 5(2015).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Optical+Coherence+Tomography+Angiography+of+Choroidal+Neovascularization+in+Age-Related+Macular+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Quantitative Optical Coherence Tomography Angiography of Choroidal Neovascularization in Age-Related Macular Degeneration.</a> Ophthalmology. 121 (7), 1435-1444 (2014).</li>
<li>Chen, C. -L., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+based+angiography+%5BInvited%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography based angiography [Invited].</a> Biomedical Optics Express. 8 (2), 1056-1082 (2017).</li>
<li>Yi, J., Chen, S. Y., Shu, X., Fawzi, A. A., Zhang, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+retinal+imaging+using+visible-light+optical+coherence+tomography+guided+by+scanning+laser+ophthalmoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Human retinal imaging using visible-light optical coherence tomography guided by scanning laser ophthalmoscopy.</a> Biomedical Optics Express. 6 (10), 3701-3713 (2015).</li>
<li>Zhang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-band+spectral-domain+optical+coherence+tomography+for+in+vivo+imaging+the+spectral+contrasts+of+the+retinal+nerve+fiber+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Dual-band spectral-domain optical coherence tomography for in vivo imaging the spectral contrasts of the retinal nerve fiber layer.</a> Optics Express. 19 (20), 19653-19667 (2011).</li>
<li>Delori, F. C., Webb, R. H., Sliney, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximum+permissible+exposures+for+ocular+safety+%28ANSI+2000%29%2C+with+emphasis+on+ophthalmic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Optical+Society+of+America+a-Optics+Image+Science+and+Vision%22%5BJournal%5D)">Maximum permissible exposures for ocular safety (ANSI 2000), with emphasis on ophthalmic devices.</a> Journal of the Optical Society of America a-Optics Image Science and Vision. 24 (5), 1250-1265 (2007).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+fluorescence+retinal+imaging+in+vivo+over+a+30-degree+field+of+view+by+oblique+scanning+laser+ophthalmoscopy+%28oSLO%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Volumetric fluorescence retinal imaging in vivo over a 30-degree field of view by oblique scanning laser ophthalmoscopy (oSLO).</a> Biomedical Optics Express. 9 (1), 25-40 (2018).</li>
</ol>

Ji Yi tiene una patente pendiente para oSLO. Los otros autores no declaran a intereses financieros que compiten.

Aquí, hemos descrito oSLO, un en vivo volumétrica fluorescente retinal imaging técnica con un campo de visión 30 ° excesivo. En comparación con octubre, un estándar actual de cuidado imagen método en Oftalmología, oSLO ofrece una proyección de imagen capacidad 3D similar pero permite contraste de fluorescencia que OCT no es sensible a. La ventaja de oSLO es que requiere sólo una exploración de raster y permite así la combinación perfecta de PTU, proporcionando dos técnicas complementarias para la proyección de i...

Oftalmología y visión de la ciencia se beneficiaría enormemente de las modernas técnicas de imagen ópticas, puesto que la retina se puede acceder fácilmente con la luz. La proyección de imagen retiniana de la fluorescencia es una herramienta esencial en el diagnóstico y manejo de coriorretinal enfermedades vasculares como la retinopatía diabética (RD) y degeneración macular senil (DMS), los cuales son principales a causas de ceguera en los Estados Unidos.
Sin embargo, es todavía difícil para adquirir un gran campo de visión (FOV), retiniana de (3D) tridimensional de imágenes mediante el uso de imágenes por fluorescencia. Fotografía del fondo no tiene la capacidad de resolución de profundidad y no rechace la luz difusa. Como resultado, la mezcla de señales de diversa profundidad reduce la calidad de imagen. Exploración oftalmoscopia de láser (SLO) y confocal puede SLO (cSLO) reducir el efecto de luz difusa mediante el uso de bloquea confocal1. Sin embargo, es difícil para SLO o cSLO para adquirir una imagen 3D de retina humana debido al límite de su profundidad de foco. Óptica adaptativa SLO (AOSLO) puede proporcionar excelente resolución y contraste mediante la corrección de las aberraciones de frente de onda que el ojo humano. Sin embargo, AOSLO todavía tendría z de apilamiento para la proyección de imagen volumétrica2. Tomografía de coherencia óptica3 y sistemas de angiografía (OCTA) OCT superan estas restricciones para proporcionar tres dimensiones (3D) las imágenes anatómica y vascular4,5,6, pero la naturaleza libre de tinte de OCT no puede visualizar fugas indicativos de disfunción vascular.
Este protocolo describe una novela plataforma multimodal para retina de fluorescencia volumétrica 3D de imágenes, es decir oblicuas exploración oftalmoscopia de láser (oSLO). En este sistema de proyección de imagen, un análisis oblicuo se generaron por un deslizador de cola de Paloma, y un sistema de imagen final esté alineado en un ángulo para detectar fluorescencia Cruz imágenes seccionales. El sistema utiliza métodos de escaneo láser, y estas técnicas permiten la fácil incorporación con OCT como una modalidad de proyección de imagen estructural volumétrica complementaria. La resolución de profundidad actual es de 25 μm en la retina de la rata y el campo de visión es de 30°. Esencialmente, el oSLO permite una versión fluorescente de OCT y se puede combinar simultáneamente con OCT y OCTA sobre un gran campo de visión.
En este protocolo, describimos la configuración de la oSLO, el método de alineación y construcción, el método de las imágenes en vivo de retina de rata y los resultados representativos.

<table><tbody><tr><td>Fuente láser Supercontinuum</td><td>NKT Photonics</td><td>SuperK EXTREME EXU-OCT6</td><td></td></tr><tr><td>Espejo dicroico (DM1)</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP650R</td><td></td></tr><tr><td>Espejo dicroico (DM2)</td><td>Chroma</td><td>ZT514/1064rpc</td><td></td></tr><tr><td>Espejo dicroico (DM3)</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP900R</td><td></td></tr><tr><td>fibra monomodo (SMF 1)</td><td>Thorlabs</td><td>P3-460B-FC-2</td><td></td></tr><tr><td>Fibra monomodo (SMF 2)</td><td>Thorlabs</td><td>P3-780A-FC-2</td><td></td></tr><tr><td>Acoplador de fibra óptica</td><td>Thorlabs</td><td>TW850R5A2</td><td></td></tr><tr><td>sistema telescópico 1:1</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A&times; </td><td></td>2</tr><tr><td>Sistema telescópico 3:1</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A&times; </td><td></td>2</tr><tr><td>Sistema telescópico 3:1</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-50-A&times; </td><td></td>2</tr><tr><td>Espejos Galvo (GM1,GM2)</td><td>Thorlabs</td><td>GVS201&times; </td><td></td>2</tr><tr><td>Espejos Galvo De-sacn (GM3)</td><td>Thorlabs</td><td>GVS011</td><td></td></tr><tr><td>Lente Objetivo</td><td>Olympus</td><td>UplanSApo 20&times;/0.75</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagen final</td><td>Olympus</td><td>UplanFL N 10&times;/0.3</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagen final</td><td>Computar</td><td>12-36mm/1:2.8</td><td></td></tr><tr><td>Cámara</td><td>PCO</td><td>Pco.pixelfly usb</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td><td>Thorlabs</td><td>FEL0800</td><td></td></tr><tr><td>Filtro ND Variable Continuo</td><td>Thorlabs</td><td>NDC-50C-4M-A</td><td></td></tr> Cámara de <tr><td>escaneo de línea</td><td>Thorlabs</td><td>SPL2048-140K</td><td></td></tr><tr><td>Tarjeta de salida analógica (AO1)Tarjeta de salida analógica</td> <td>PCI-6731</td><td></td>de <td>National Instrument</td></tr><tr><td>(AO2)</td><td>Instrumento nacional</td><td>PCIe-6351</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso largo</td><td>Thorlabs</td><td>FEL0800</td><td></td></tr></tbody></table>

multimodal volumétrica retina imágenes por exploración oblicua oftalmoscopia de láser (oslo) y tomografía de coherencia óptica (oct)

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy (oSLO) and Optical Coherence Tomography (OCT)

Mientras que la proyección de imagen de la fluorescencia es ampliamente utilizada en Oftalmología, una imagen retiniana de la fluorescencia (3D) tridimensional de gran campo de visión (FOV) sigue siendo un gran reto con la retina de vanguardia imagen modalidades porque requerirían z de apilamiento para compilar un conjunto de datos volumétrico. Nueva tomografía de coherencia óptica (OCT) y sistemas de angiografía (OCTA) OCT superan estas restricciones para proporcionar imágenes tridimensionales (3D) de anatómico y vasculares, pero la naturaleza libre de tinte de OCT no puede visualizar salida indicativa de vascular disfunción. Este protocolo describe un oblicuo novedoso láser oftalmoscopia (oSLO) técnica que ofrece la proyección de imagen retiniana fluorescencia volumétrica 3D de escaneo. La configuración del sistema de proyección de imagen genera el oblicuo de un deslizador de cola de Paloma y alinea el sistema de imagen final en un ángulo de detección fluorescentes imágenes seccionadas transversalmente. El sistema utiliza el láser método de análisis y por lo tanto, permite una fácil incorporación de OCT como una modalidad de proyección de imagen estructural volumétrica complementaria. En vivo la proyección de imagen en la retina de la rata se demuestra aquí. Solución de fluoresceína se inyecta por vía intravenosa para producir la angiografía de la fluoresceína volumétrica (vFA).

Figura 4a muestra una imagen transversal del OCT de una retina de rata. Figura 4b c -4 muestran las mismas imágenes de retinales transversales de AGV OCTA y oSLO adquirió al mismo tiempo. El oSLO permite FA sección análoga al OCT B-scan. En comparación con el OCTA, la imagen transversal del AGV de oSLO identifica claramente los vasos de la capa de fibras nerviosas (NFL) y la capa de células ganglionares (GCL) y l...

Aquí, presentamos un protocolo para obtener una imagen retiniana OCT y fluorescencia (3D) tridimensional de gran campo de visión (FOV) mediante una novedosa plataforma multimodal proyección de imagen. Vamos a introducir la configuración del sistema, el método de alineación y protocolos operacionales. Se demostrará en vivo la proyección de imagen, y se proporcionará resultados representativos.

Multimodal volumétrica retina imágenes por exploración oblicua oftalmoscopia de láser (oSLO) y tomografía de coherencia óptica (OCT)

While fluorescence imaging is widely used in ophthalmology, a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence retinal image is still a big ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la oftalmología y las imágenes de la retina. Tales como la obtención de imágenes y la cuantificación de la disrupción de la barrera hematorretiniana y las funciones capilares de la retina. La principal ventaja de esta técnica es que puede obtener un gran campo de visión, imágenes de retina tridimensionales y de contraste múltiple mediante el uso de un láser de escaneo oblicuo en un solo escaneo de trama.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de la retinopatía diabética y otras enfermedades prerretinianas. Porque oSLO puede obtener imágenes de alto contraste de la microvasculatura de la retina, hasta capilares individuales en 3D. Aunque este método puede proporcionar información sobre las imágenes de la retina, también se puede aplicar a otros sistemas de imágenes que utilizan lentes de objetivo convencionales.Por ejemplo, la obtención de imágenes in vivo de la corteza del ratón. Se utiliza una fuente láser supercontinua como fuente láser del sistema para la oftalmoscopia láser de barrido oblicuo, o configuración oSLO. El rango de luz visible está separado del rango de longitud de onda más alta por el primer espejo dicroico.El espectro de luz se expande con un par de prismas dispersivos, después de que el haz pasa a través de un divisor de haz de polarización. Se utiliza una rendija para seleccionar el rango de longitud de onda de excitación. Y un espejo reflectante refleja el haz filtrado de vuelta al par de prismas para acoplar la luz en una fibra monomodo.Se utiliza un espectrómetro para confirmar la selección de la longitud de onda en la salida de la fibra monomodo. La fibra monomodo está conectada a dos acopladores de fibra óptica en cascada. Uno de los puertos de salida de fibra del segundo acoplador de fibra entrega la luz al sistema oSLO.Para colimar el láser en el sistema oSLO, el láser es desviado por un espejo galvanómetro. Un sistema de telescopio uno a uno transmite el láser a un segundo espejo galvanómetro, y un sistema de telescopio de tres a uno transmite aún más el láser a la pupila del ojo. Un espejo dicroico dentro del sistema de telescopio de tres a uno refleja las señales fluorescentes.El sistema telescópico de tres a uno y el espejo dicroico están montados en un deslizador de cola de milano personalizado para compensar el eje óptico y crear la iluminación de escaneo oblicua. La iluminación oblicua permite la obtención de imágenes de fluorescencia volumétrica sin necesidad de tener seccionamiento. Al desplazar el láser, un haz oblicuo se enfoca en la retina y, a continuación, la detección oblicua puede capturar una imagen de fluorescencia tomográfica a lo largo de la trayectoria del haz oblicuo.Para crear la trayectoria óptica de la imagen de fluorescencia, la fluorescencia es reflejada por el espejo dicroico y retransmitida al tercer espejo galvanómetro. A continuación, la luz fluorescente se transmite a una lente de objetivo de imagen mediante otro sistema de telescopio uno a uno. Se instalan dos etapas de traslación adicionales debajo del tercer espejo galvanómetro para proporcionar redundancia en los grados de libertad para optimizar la imagen.El sistema de imagen final está montado en un escenario que tiene tres grados de libertad. Rotación, y dos ejes de traslación. Se utiliza una cámara plana para capturar las imágenes de fluorescencia de sección transversal.Otro espejo dicroico separa el rango infrarrojo trasero de la luz restante. Se utiliza un filtro de paso largo para limitar aún más el ancho de banda a 800 a 900 nanómetros. Acople el haz en una fibra monomodo.La fibra monomodo se conecta al otro puerto de entrada de los dos acopladores de fibra óptica en cascada para combinarse con la excitación azul oSLO. La luz del segundo puerto de salida del segundo acoplador de fibra se dirige al brazo de referencia OCT. Que tiene placas de compensación de dispersión, filtro de densidad neutra variable y un espejo reflectante.El retorno de luz del brazo de referencia y el ojo se recombina en el segundo acoplador de fibra óptica y se entrega al espectrómetro OCT para recoger la señal. Utilice un software de sistema de adquisición de datos escrito en Labview y modificado a partir del protocolo de escaneo OCTA. Para cada b-scan, una placa de salida analógica emite un diente de sierra con un ciclo de trabajo del 80% con 500 pasos para controlar el espejo de escaneo rápido x-prime.Active la cámara de escaneo lineal en cada paso para adquirir datos para la OCT, solo cuando el espejo esté en la dirección de escaneo hacia adelante. Establezca el tiempo de exposición de la cámara de escaneo lineal en 17 microsegundos. Para adquirir la señal OCTA, repita la medición cinco veces en la misma ubicación de b-scan.Establezca la velocidad de salida de AO en 100 kilohercios y la velocidad de la línea A de OCT en 50 kilohercios. Controle el espejo de escaneo lento y-prime, GM1, mediante una forma de onda en rampa. Sincronice el espejo de deescaneo, GM3, con GM1 para eliminar el escaneo lento.Dispare la cámara plana mediante otra placa de salida analógica para capturar una imagen fluorescente en cada ubicación y-prime. Recorte el tamaño de la imagen o agrupe los píxeles vecinos para aumentar la velocidad y la sensibilidad según lo desee. Comience por confirmar un nivel adecuado de anestesia en la rata por la falta de un reflejo de retirada durante un pellizco intradigital.Después de la inducción de la anestesia, coloque la rata en un soporte. Coloque un cono en la nariz para mantener la anestesia durante el resto del experimento. Aplique la solución oftálmica de clorhidrato de tetracaína 5 en el ojo de rata para anestesia local.A continuación, dilatar la pupila con una solución oftálmica de tropicamida al 1%. Después de dos minutos de dilatación, use una jeringa de un mililitro y una aguja de calibre 29 para inyectar fluoresceína al 10% o FITC al 10% diluido en solución salina a través de la vena de la cola. A continuación, encienda la fuente láser y coloque un filtro de densidad neutra para atenuar la excitación de la luz azul durante la alineación.Mida la potencia de la luz azul, asegurándose de que sea inferior a 10 microvatios. Luego cambie a la luz de tomografía de coherencia óptica, asegurándose de que esté cerca de 8 milivatios. Encienda la fuente de alimentación del espejo del galvanómetro, que se utiliza para controlar la dirección del láser.Ajuste la altura del globo ocular para crear un punto láser estacionario en la córnea. Ajuste la posición del ojo para que el borde de la pupila sea aproximadamente perpendicular al láser. Y desplaza el láser a aproximadamente 1,5 milímetros del centro apical del ojo.Ajuste aún más el soporte del animal hasta que las imágenes de tomografía de coherencia óptica alcancen la calidad óptima. En la dirección de escaneo rápido x-prime, asegúrese de que la imagen de escaneo b de la sección transversal aparezca plana. Al cambiar a la dirección de escaneo lento y-prime, asegúrese de que la imagen de escaneo b de la sección transversal aparezca inclinada debido al escaneo oblicuo.Retire el filtro de densidad neutra a la excitación de luz azul. Y monitoree la transmisión en tiempo real de la cámara. Debe aparecer una imagen fluorescente transversal que muestre los vasos sanguíneos a diferentes profundidades.Ajuste el enfoque del sistema de imágenes de fluorescencia final para alcanzar el enfoque óptimo. Y realice ajustes finos de la posición del ojo en el plano lateral para alcanzar una calidad óptima de imagen de oftalmoscopia láser de escaneo oblicuo. Después de la alineación, comienza a adquirir simultáneamente la angiografía por tomografía de coherencia óptica y la angiografía con fluoresceína volumétrica.Esta imagen muestra una imagen de tomografía de coherencia óptica transversal de la retina de una rata. Se trata de una angiografía por tomografía de coherencia óptica, o imagen OCTA, de la misma región. Y una oftalmoscopia láser de barrido oblicuo y una angiografía volumétrica con fluoresceína por imagen, angiografía con fluoresceína transversal, o oSLO-VFA.Análogo a la tomografía de coherencia óptica b-scan. En comparación con OCTA, la oftalmoscopia láser de barrido oblicuo y la imagen transversal de angiografía volumétrica con fluoresceína identifican claramente los capilares en la capa plexiforme externa. La capa superficial de la retina se muestra aquí en una imagen OCTA.Los artefactos en forma de rayas verticales son visibles en la imagen. oSLO-VFA evita los artefactos de movimiento mediante el uso de contraste de emisión de fluorescencia. Dentro de la capa intermedia de la retina, los vasos que bucean verticalmente se muestran claramente en la imagen oSLO FA.Pero no es evidente en OCTA. Al intentar este procedimiento, es importante evitar la exposición continua del láser al ojo durante más de dos minutos. Evite la sequedad de la córnea y permita que el ojo descanse al menos 30 segundos entre secciones de imágenes bloqueando la luz.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la obtención de imágenes de ratones modificados genéticamente para expresar proteínas de fluorescencia, con el fin de responder a preguntas adicionales. Por ejemplo, cómo pueden cambiar tipos específicos de células de la retina y las variables observadas en el pasado con enfermedades conocidas.

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