Name: El percebe Balanus improvisus como modelo Marina - cultivo y expresión del gen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Aprende el cultivo del percebe Balanus improvisus para estudios de expresión génica y osmorregulación marina. Este método permite producir hasta 50.000 larvas semanales con alta viabilidad.

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Esta investigación fue apoyada por concesión 2017-04559 el Consejo Sueco de investigación (VR) y el proyecto europeo de apoyo marítimo a Anders Blomberg. En particular, el establecimiento de las instalaciones de cultivo, con los años, apoyo de becas a por R. Jonsson de los siguientes organismos de financiación: SSF (Fundación sueca para la investigación estratégica) a través del programa de ciencias marinas y tecnología y MISTRA a través del programa pintura Marina. Kent Berntsson era instrumental en las primeras fases de creación de la culturingfacility. Adicional de financiación para el establecimiento de las instalaciones de cultivo ha llegado del centro de biología evolutiva Marina (www.cemeb.science.gu.se), que es apoyado por una subvención de Linnaeus de la FORMAS de los consejos de investigación sueco y VR.

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</ol>

Los autores no tienen nada que declarar.

La cultura de Percebe en el laboratorio de investigación marina de Tjärnö (Suecia) ha estado funcionando más de 20 años y se ha utilizado para los estudios en muchas áreas de investigación diferentes. Se han publicado más de 30 trabajos científicos que han utilizado el sistema de cultivo durante los últimos años, incluyendo estudios de antifouling13,22, hidrodinámica23, ecología química24,16 el cambio climático ,5de la biología evolutiva y biología molecular2.
Para evitar la selección de ciertos individuos que están más adaptados al ambiente de laboratorio (individuos que podrían no ser representativas de la población salvaje), se recomienda recoger una reproductores nuevos en el campo cada año. Además, también es buena práctica para rejuvenecer la cultura anualmente, ya que hay aproximadamente 50-80% de la mortalidad en adultos durante un año normal. Sin embargo, si el objetivo es producir líneas puras o para estudios de evolución experimental, las familias sólo criados en laboratorio son para usarse.
Un buen momento para recoger B. improvisus en paneles en el laboratorio de investigación marina de Tjärnö es de junio a agosto porque en ese momento, hay un buen suministro de larvas cyprid en el mar. Revise los paneles semanal para ver cuando comienza el asentamiento de percebe y eliminar manualmente otros establecieron especies B. improvisus (por ejemplo, mejillones, tunicados, Briozoos, hidrozoos, nemertinos/tubeworms y otras especies de balanos) de la paneles (por ejemplo, con un cepillo de dientes). Alrededor de Tjärnö, hay tres especies de aguas someras Percebe presente (B. improvisus Semibalanus balanoidesy Balanus crenatus). Sin embargo, B. improvisus es el dominante sobresalía de superficies lisas durante julio – agosto. Balanoides S. tiene su período de asentamiento durante la primavera y prefiere principalmente substratos naturales (p. ej., piedras). B. crenatus puede ocurrir en los números bajos en los paneles durante el verano.
También es posible iniciar nuevas generaciones Percebe adulto de culto cyprids, que sería esencial si se han establecido ciertos linajes con características específicas, o en estudios de evolución experimental. La forma más conveniente para iniciar nuevas generaciones de adultos es colocar cyprids en los paneles termoplásticos en el laboratorio. Estos paneles con cyprids recién colocado también podrían utilizarse en tratamientos experimentales o para la exposición en el campo. En casos de emergencia, se pueden utilizar también adultos en desde un sitio cercano (por ejemplo, Idefjorden en el caso del laboratorio de investigación marina de Tjärnö) donde es común B. improvisus . Estos adultos ya establecidos son tratados de la misma manera como los adultos en los paneles, por lo tanto se colocan en bandejas y alimentados a través de la fluir-por sistema. Células de flujo pueden utilizarse también para establecer grupos especiales con percebes25. Estas son cámaras de flujo con red a los lados en que el cyprids no conformarse, con paneles como la superficie del establecimiento solamente para las larvas del plancton.
Hay varios pasos que son fundamentales para la creación de una cultura de Percebe funcionamiento a largo plazo incluyendo todas las etapas de la vida. Los métodos utilizados para cultivo B. improvisus son probablemente, en gran medida, también aplicable a otros invertebrados marinos con larvas planctotróficas nadan libremente. Procedimientos de cultivo para algunas especies ya están bien describen (por ejemplo, mejillones azules y diferentes especies de ostras)26, mientras que para otros invertebrados marinos, son sólo algunos ejemplos de cultivos a largo plazo que abarca toda la vida ciclo. Uno de los primeros intentos exitosos de percebes de la cultura (B. Anfitrite) fue realizado por Rittschof et al. 15. recursos financieros y personales a largo plazo deben estar en lugar antes de considerar establecer un Percebe facilidad de cultivo. El mantenimiento de este tipo de año-alrededor de Percebe cultura requiere al menos una persona trabajando medio tiempo. Puede haber cierto potencial para la futura automatización de algunos pasos en la cadena de producción, principalmente el cultivo de microalgas27. Además, para tener éxito, es esencial tener acceso a grandes cantidades de agua de mar de alta calidad. El cultivo de microalgas, Artemia y percebes no implica ningún procedimiento de seguridad particular. Sin embargo, las pruebas de algunas sustancias antifouling o productos químicos tóxicos pueden necesitar precauciones especiales.
Los paneles se verificaron varias veces a la semana para contaminaciones. El agua de mar en la cultura fue bombeada desde una profundidad de 40 m en el fiordo de Koster fuera del laboratorio de investigación marina de Tjärnö y pasó a través de dos filtros de arena antes de entrar en el sistema de agua de laboratorio. Si ningún filtro del agua se ha hecho, sería mucho más contaminación en la cultura. Es esencial para limpiar regularmente los paneles en la cultura de detritos y otros invertebrados (e.g., Estolón-edificio hidroides y nemertinos depredadores) que entran en el sistema a través del suministro de agua de mar en el campo. Por ejemplo, si no las larvas se producción a pesar del hecho de que la cultura ha sido bien alimentado y parece estar en buenas condiciones, el problema podría ser la presencia de nemertinos que aparecen inhibir el acoplamiento. Naturalmente, muchos de los organismos contaminantes en el cultivo en el laboratorio de investigación marina de Tjärnö eran específicas para la costa oeste sueca, y otros tipos de contaminación de organismos a ser frecuente ya más de un desafío en otras áreas geográficas. En la costa oeste de Suecia, es raro encontrar contaminación por otras especies de percebes en los paneles. En ocasiones, el establecimiento de S. balanoides se ha encontrado, pero este es un problema muy marginal (a lo sumo, un S. balanoides contaminante para 10.000 B. improvisus muestras). La falta de contaminación de especies fue probablemente dependiente del régimen para establecer nuevas culturas durante el verano, cuando los larvaefrom B. improvisus eran altamente dominante. Además, también hubo un claro enriquecimiento de B. improvisus en los paneles ya que esta especie es selectiva para las superficies lisas13.
Es esencial eliminar percebes adultos muertos. Si se dejan las cáscaras vacías de los paneles, pueden llegar a ser un refugio para nauplios de Artemia , así como para diversas especies contaminantes. Además, se ha notado que personas muertas influyen en el bienestar de los vecinos particulares, probablemente con la liberación de compuestos tóxicos durante la descomposición. Una consecuencia adicional de la mortalidad de adultos es que algunos individuos se dejará solo y muy lejos de cualquier otro adulto para permitir el apareamiento (aunque percebes tienen el pene más largo en el mundo animal en relación con su tamaño)28. Estos individuos sobrevivirán pero son improductivos para las larvas. Sin embargo, estos individuos adultos solitarios pueden eliminarse suavemente sin dañar la placa base y colocados horizontalmente cerca de otros para permitir el apareamiento. Percebes también pueden ser acoplados mediante la colocación de paneles con un adulto en cada uno pero lo suficientemente cerca para que pueda ocurrir el intercambio de ideas. De esta manera, líneas genéticas pueden ser producido14.
Es esencial para producir un alimento de alta calidad y para alimentar las culturas casi todos los días. Incluso unos pocos días sin alimento pueden ocasionar una disminución liberación de larvas. Pruebas anteriores de la composición de la dieta han demostrado que las diatomeas son esenciales para el crecimiento y supervivencia de nauplios de Percebe. Varias especies de diatomeas parecen adecuadas como alimentación, aunque las células solitarias o pequeños (menos de 10 μm de diámetro) pueden ser necesarias para la ingestión de los nauplios. La especie S. marinoi, simplex de C.y T. pseudonana ha demostrado ser adecuada alimentación nauplios B. improvisus , así como fácil de cultivar. Además, la calidad del alimento es generalmente más alta para el exponencial crecimiento de algas. También se ha divulgado que las diatomeas son esenciales para el establecimiento de culturas productivas de amphitrite B.15. Una teoría de la importancia de las diatomeas es que tienen un perfil único de ácidos grasos y son especialmente ricos en ácidos grasos altamente poliinsaturados 20:529. Se ha demostrado ciertos ácidos grasos son importantes para el buen desarrollo de las larvas de ostra30.
Con los años, no han sido incidencias de enfermedades perjudiciales en el cultivo de Percebe. En muchos acuaculturas comerciales de invertebrados, como las ostras y los mejillones, las enfermedades son bastante comunes y pueden ser muy perjudiciales. Efectos perjudiciales de los virus también se han divulgado de las poblaciones silvestres. La ostra nativa en Francia fue reemplazada por la portuguesa ostra Crassostrea angulata en 1925, pero esta especie fue aniquilada por un iridovirus alrededor 197031. Más recientemente, ha habido eventos de mortalidad masiva en el ostión Crassostrea gigas en las culturas en todo el mundo, que parece estar asociado con el herpesvirus herpesvirus 132. No hay informes sobre agentes patógenos, bacterias o virus en los percebes se han publicado hasta ahora. Sin embargo, en el curso-proyecto del genoma de B. improvisus, se encontraron secuencias de virus (Alm Rosenblad et al., datos no publicados), pero con ningún vínculo aparente a los síntomas de enfermedades. Mezclas de antibióticos se han aplicado anteriormente a las culturas para minimizar el riesgo de infecciones bacterianas; sin embargo, este procedimiento está actualmente abandonado y hasta la fecha, esto no ha causado problemas de contaminación.
Si el agua de mar es calentado (como se describe anteriormente), un sobrecalentamiento puede ser el riesgo más serio en la línea de producción de cultura. Por supuesto, es difícil proteger contra el sobrecalentamiento, aunque los sensores y sistemas de alerta adecuados pueden ser utilizado (por ejemplo, envío de correo electrónico o mensajes de texto a personas responsables). Incidencias de este tipo en el pasado han provocado la matanza substancial de los adultos en la cultura. Esto puede, por supuesto, ser devastador y arruinar las inversiones a largo plazo de tiempo y dinero. En particular, esto sería catastrófico si se han establecido líneas genéticas puras. Para asegurar la longevidad de dichas líneas y seguro de pérdida accidental, sería conveniente desarrollar una metodología de criopreservación para percebes. Se ha reportado que las larvas de ostión pueden ser congeladas abajo y revividas con éxito parcial33. Cryobanking también ha sido una valiosa herramienta para preservar los recursos genéticos de una amplia gama de especies34. Incluso nauplios de B. Anfitrite se divulgan para sobrevivir congelación35, y se encontró que 20% de los individuos abajo congelado transformado con éxito en cyprids36. Aplicación de congelación para la sostenibilidad a largo plazo de las culturas hasta ahora no ha sido aprobada, pero de hecho esto sería necesario para el mantenimiento de las líneas seleccionadas; Esto sería un paso esencial para establecer firmemente B. improvisus en una potente Marina modelsystem.
Aquí, se presentó un protocolo para la disección de varios tejidos de adultos de B. improvisus (es decir, cirros, soma y la chimenea). Sin embargo, debe destacarse que también se pueden extraer otros tejidos. Por ejemplo, el tejido blando entre el manto exterior e interior de la especie base membranosa Tetraclita japonica formosana ha sido cuidadosamente aislado y utilizados para extracción de RNA y RNA-seq análisis del gene expresión37. El protocolo de extracción optimizado contorno descrito aquí proporciona cantidades suficientes de ARN de alta calidad para la secuenciación de una cantidad mínima de material de partida. En primer lugar, la colección de larvas individuales directamente en los tubos de homogeneización minimiza cualquier pérdida durante el traslado de un tubo a otro. Además, entre los diferentes métodos de prueba, la homogeneización con granos de cerámica demostró para ser la producción más eficiente en términos de RNA e integridad, en comparación con homogeneización de sonicación o Maja. Cuando la planificación de la expresión génica o experimentos de genómica, uno tiene que tener en cuenta el reto de la alta variación genética en percebes, por lo menos para B. improvisus. Percebe tiene una diversidad genética en el rango de 3 – 5%, incluso en la codificación de las regiones (Alm Rosenblad et al., datos no publicados). Esto, por supuesto, pone demandas específicas en el diseño de cebadores para el análisis de qPCR, donde más conservan las regiones deben ser identificadas y utiliza como plantillas para imprimaciones para conseguir expresión consistente resultados betweenbatches. Regiones conservadas de genes de la blanco, como aquaporins y Na + / K + ATPasas, pueden identificarse mediante el estudio de la variabilidad de la secuencia de estos genes en el RNA-seq datos obtenidos de poblaciones de cyprids que contiene cientos de individuos. Para un análisis de genoma, ADN a ser muestreado. Sin embargo, obtener ADN de alta calidad de B. improvisus puede ser un desafío21.
En conclusión, la cultura de Percebe establecidos ha demostrado para ser instrumental en diferentes tipos de estudios experimentales. En particular, el todo-año-alrededor de la producción larvaria nos permite realizar experimentos sin estar limitado al período natural de desove (para B. improvisus, esto es durante el verano). Las larvas obtenidas se pueden utilizar para realizar una amplia serie de estudios experimentales, incluyendo el establecimiento de ensayos, ensayos de comportamiento, estudios de expresión de genes específicos, así como estudios de genoma transcriptoma.

Percebes son crustáceos marinos con un adulto sésil y larvas planctónicas, nadan libremente. La mayoría de las 1.200 especies de percebes habita aguas poco profundas y muchas están a menudo expuestos a baja salinidad. Una especie, el Bahía Percebe Balanus (Amphibalanus) improvisa (B. improvisus), puede tolerar agua casi dulce y Charles Darwin describió esta especie de un pequeño arroyo en el estuario del río de la Plata en Uruguay1. La salinidad de tolow tolerancia extrema hace B. improvisus un modelo particularmente relevante para los estudios de mecanismos osmoregulatoria2,3. Este Percebe prefiere condiciones salobres, pero es capaz de vivir en aguas con salinidades de alrededor 1.6 psu a tan alto como 40 psu4. Es la especie de Percebe único encontrada en el salobre mar Báltico. B. improvisus se cree para originar de la costa este del continente americano, pero hoy se encuentra en todo el mundo debido a la dispersión por el envío de5. Es un organismo importante de ensuciamiento se encuentra comúnmente en rocas, muelles y cascos de barco y por lo tanto es de interés general para la comprensión de los mecanismos de biofouling en construcciones en aguas marinas y salobres6,7.
Similar a la mayoría otras percebes, B. improvisus es hermafrodita con intercambio de ideas; reproducción se produce por apareamiento entre individuos vecinos usando un pene alargado y fertilización interna. El periodo reproductivo es principalmente de mayo a septiembre. B. improvisus tiene siete estadios larvarios pelágicos (seis nauplios seguidos por un cyprid etapa8). Las portillas del huevo fertilizado en una larva Nauplio que nadan libremente y se alimenta en la columna de agua de hasta varias semanas antes de mudar en una larva de cyprid de no alimentación. El cyprid utiliza señales múltiples para encontrar un sitio adecuado para asentarse y entonces sufre metamorfosis en sésiles Percebe juvenil9. Las especies pueden ser cultivadas en el laboratorio y tiene una duración de 1 a 2 años en el mar (2-3 años en cultivo de laboratorio). En promedio, B. improvisus crece a 10 mm de diámetro (con un máximo de alrededor de 20 mm) y alcanza una altura máxima de unos 6 mm (aunque pueden crecer más alto bajo condiciones de hacinamiento). La especie puede ser identificada por su concha hasta calcáreo liso (blanco o grisáceo), la base calcárea radialmente con motivos de la placa de shell y la forma de las placas tergal1,10.
El percebe B. improvisus tiene varias características ventajosas como modelo para estudios de osmoregulación, centrándose en los mecanismos moleculares y fisiológicos así como las interacciones ecológicas y consecuencias evolutivas. Es también ampliamente utilizado como modelo para las investigaciones de colocar biología, en particular en lo referente a investigación de antifouling y los mecanismos involucrados7,11,12,13. Sin embargo, natural desove estacional produce una fuente impredecible de larvas de cyprid de estudios. La capacidad de este Percebe a través de su ciclo de vida de la cultura todo el año es, por lo tanto, un activo importante para permitir que varios tipos de estudios moleculares y mecanicistas. Además, su presencia en aguas marinas/salobres en todo el mundo permite una combinación de campo y estudios experimentales. Cría controlada puede también producir familias de conocidos pedigríes para cultivo a largo plazo14, y un tiempo de generación de unos pocos meses puede permitir la evolución experimental a largo plazo. También hay un genoma proyecto y transcriptomas varios disponibles, y estos recursos han sido utilizados para la clonación de varios genes (por ejemplo, genes de importancia en la osmoregulación)2,3.
El objetivo de este protocolo es describir cómo establecer y mantener una cultura de los balanos B. improvisus durante todo el año para realizar estudios de expresión génica en adultos o las larvas de este organismo. Rittschof et al. 15 describe brevemente un método para el cultivo de percebes de la liberación de nauplios a la solución de cyprids para la especie Balanus amphitrite. El protocolo ha sido adaptado para el cultivo de todo el año de B. improvisus en el laboratorio de investigación marina de Tjärnö (Suecia), y se contornea una descripción detallada de todos los pasos en la cadena de producción, incluyendo la producción y cría de la barnacla las larvas, así como la administración de alimento para las larvas y adultos. Para tener una visión general del procedimiento completo, vea la figura 1. El uso del sistema de cultivo se ejemplifica con algunos montajes experimentales comunes e ilustrado en los estudios de genómica funcional de Na++ ATPasa de k y aquaporins, dilucidar sus posibles funciones en osmoregulación2, 3. A veces es esencial para examinar la expresión de genes en tejidos específicos, y algunos de los fundamentos de la disección de Percebe serán cubiertos. Con un buen suministro de agua de mar de alta calidad, el cultivo de los balanos B. improvisusy potencialmente muchas otras especies, debería ser posible en laboratorios marinos en todo el mundo.

<table><tbody><tr><td>Paneles de plexiglás (polimetacrilato de metilo)</td><td>Plástico produkter, Bromma, Suecia</td><td></td><td>glas transparente</td></tr><tr>Botella <td></td><td></td><td></td>de<td>PET de 1,5 L</td></tr><tr><td>Artemia</td><td>INVE Aquaculture, Bélgica</td><td></td><td>Hemos probado diferentes empresas; esta es realmente la mejor</td></tr><tr><td>Skeletonema marinoi (cepa CCAP 1077/5)</td><td>CCAP (Colección de Cultivos de Algas y Protozoos); Escocia &nbsp;</td><td>cepa 1077/5</td><td></td></tr><tr><td>Chaetoceros simplex var. gracilis (cepa CCAP 1085/3)</td><td>CCAP (Colección de Cultivos de Algas y Protozoos); Escocia &nbsp;</td><td>cepa 1085/3</td><td></td></tr><tr><td>Millipore sistema de filtro de cartucho</td><td>Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cartucho con un tamaño de poro nominal de 0,2 y micro; m</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>cartucho CWSS01S03</td><td>Alta capacidad para grandes volúmenes</td></tr><tr><td>de botella de policarbonato</td><td>Nalgene</td><td></td><td>ARN esterilizable en autoclave</td></tr><tr><td>posterior</td><td>Qiagen</td><td>76106</td><td>&nbsp; Solución de fijación para preservar el ARN</td></tr><tr><td>TURBO Kit libre de ADN</td><td>Invitrogen/Thermofisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>AM1907</td><td>Kit de ADNasa para eliminar el ADN del ARN preparado Kit de síntesis de</td></tr><tr><td>ADNc iScript Biorad</td><td></td><td>1708890</td><td>kit de síntesis de ADNc</td></tr><tr><td>SYBR Supermix verde</td><td>Biorad</td><td>1708880</td><td>colorante para QPCR</td></tr><tr><td>RNeasy minikit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Extracción de ARN de adultos o muchos chipríes</td></tr><tr><td>Homogeneización de tejidos blandos CK 14, tubos de 2 ml</td><td>Precellys</td><td>KT03961-1-003.2</td><td>Perlas cerámicas para la homogeneización</td></tr><tr><td>RNeasy micro kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>Extracción de ARN de pocos cípridos</td></tr></tbody></table>

el percebe balanus improvisus como modelo marina - cultivo y expresión del gen

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Percebes son crustáceos marinos con un adulto sésil y larvas planctónicas, nadan libremente. El percebe Balanus (Amphibalanus) improvisus es particularmente relevante como modelo para los estudios de mecanismos osmoregulatoria debido a su extrema tolerancia a la salinidad baja. Es también ampliamente utilizado como un modelo de solución de biología, en particular en lo referente a investigación de antifouling. Sin embargo, natural desove estacional produce una fuente impredecible de larvas de cyprid de estudios. Se describe un protocolo para el cultivo de todo el año de B. improvisus se ha desarrollado y una descripción detallada de todos los pasos en la línea de producción (es decir, el establecimiento de cultivos adultos en paneles, la recogida y cría de larvas de percebe y la administración de la alimentación de adultos y larvas). La descripción también proporciona una guía de solución de problemas y analiza los parámetros críticos (por ejemplo, la eliminación de la contaminación, la producción de alimentos de alta calidad, mano de obra necesitada y la importancia del agua de mar de alta calidad). Cada lote de cultivo sistema máximo rinde aproximadamente 12.000 nauplios y puede ofrecer cuatro lotes en una semana, por lo que puede producir hasta casi 50.000 larvas por semana. El método utilizado para cultura B. improvisus es, probablemente, en gran medida también aplicable a otros invertebrados marinos con swimminglarvae libre. Los protocolos se presentan para la disección de varios tejidos de adultos, así como la producción de RNA de alta calidad para estudios de expresión génica. También es descritos como cultos adultos y criados cyprids puede ser utilizado en una amplia gama de diseños experimentales para examinar la expresión génica en relación con factores externos. El uso de percebes cultivadas en la expresión génica se ilustra con estudios de posibles roles osmoregulatoria de Na++ ATPasa de k y aquaporins.

Con el procedimiento descrito para el cultivo de percebes adultos de B. improvisus, hasta cuatro lotes de nauplios larvas pueden ser producidas por semana. Sería posible recoger las larvas Nauplio casi cada noche, pero esto requiere de más personas y la infraestructura (con muchos percebes en los reproductores, una cultura libera larvas continuamente). Un factor limitante adicional para la producción de larvas parece ser la disponibilidad de alimento de alta calidad, en particular con respecto a la diatomea Skeletonema. Máximo, cada lote del sistema de cultivo consiste en aproximadamente 12.000 nauplios, así que hasta 50.000 nauplios por semana puede ser cultivado. Sin embargo, algunas semanas puede haber hasta diez veces menos larvas producidas. Un adulto solo puede producir larvas hasta 7.000 por día14, que significa que 1 – 2 adultos están liberando larvas por cada lote. Dentro de una semana, unos 70-90% de los nauplios recolectados se convertirán en cyprids (rendimiento máximo aproximadamente 30.000 cyprids por semana,) que puede utilizarse para ensayos de asentamiento y los estudios moleculares.
Cabe destacar que existen variaciones en las características cyprid entre lotes, y en general, hay grandes variaciones entre lotes que dentro de los lotes. Por ejemplo, el éxito de adaptación en los ensayos de asentamiento varía entre 30 y 70% para los diferentes lotes. Probablemente, esto se debe a la variación genética individual entre los pares específicos de adultos liberando las larvas durante los períodos de muestreo diferentes. Por supuesto, se recomienda que experimentos repetidos (Replica biológica) deben incluir cyprids de un número de lotes si declaraciones más generales sobre los resultados deben ser hechas. La variación de lote a lote pone exigencias en el diseño experimental, donde se debe aplicar controles adecuados y normalizar en estudios de expresión génica. Sin embargo, incluso después de que se han implementado varios procedimientos de normalización estadística que reducen considerablemente la variación entre lotes, algunos efectos del lote son generalmente todavía aparentes (datos no publicados).
Siguiendo el protocolo previsto, es posible obtener, en promedio, 500 ng de ARN de alta calidad desde tan poco como 20 cyprids, independientemente de la etapa de establecimiento de Percebe (tabla 1). La calidad del ARN se mide normalmente como la relación entre los picos de 18S y 28S (la posición esperada de los dos picos se indica en la figura 4). Sin embargo, en el caso de percebes y muchos otros artrópodos, 28S rRNA se descompone cuando se calienta (como parte del método de análisis) y migra junto con el pico de 1820. Por esta razón hay, en principio, un solo pico de rRNA en este tipo de análisis para los percebes. Está claro de esta prueba (figura 4) que una homogeneización por granos de cerámica proporciona el ARN con la más alta integridad y es, por tanto, el método de elección. El ARN es suficiente en cantidad y calidad para generar bibliotecas de secuenciación de alta calidad para la secuencia, dando por resultado un promedio de 70 millones de lecturas por muestra (el número de lecturas, por supuesto, depende del nivel de multiplexación durante la secuenciación). La cantidad de ARN también es suficiente para el análisis de expresión de cDNA síntesis y qPCR de un gran número de genes.
La figura 5 muestra el resultado del análisis de qPCR de aquaporins y de Na+k+ ATPasa (NAK1) empalme variantes, donde se investigaron los cambios de expresión en respuesta a cambios en señales ambientales2,3. Una comparación de la expresión relativa de largo y corto de empalme variantes de NAK1 muestra un doble aumento de mRNA NAK1 largo baja salinidad en relación con el NAK corto (figura 5A). Así, los datos indican que empalmar alternativo hace que la forma larga predominante bajo condiciones de baja salinidad. En el caso de aquaporins, es evidente que los dos paralogs transportar agua AQP1 y AQP2 Mostrar expresión diferencial (figura 5B). En particular, en el tejido del manto, es evidente que la AQP1 es substancialmente regula a salinidades más bajas, que no se ve de AQP2. En cambio, AQP2 muestra una expresión ligeramente mayor en salinidades más bajas, pero en el soma. Estos resultados proporcionan una base para las investigaciones de los roles funcionales de los diferentes transportadores de iones B. improvisus y aquaporins en osmoregulación de Percebe.
<img alt="Diagrama del ciclo de vida marino: muestreo de ADN/ARN, cultivo de nauplios a cipridos, proceso de asentamiento de adultos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1 : Resumen de todo el procedimiento de cultivo, la extracción de RNA para estudios de expresión génica en los adultos. Para iniciar una nueva cultura, los paneles están Unidos a un marco y desplegados en el mar a 1-3 m de profundidad. Después de varias semanas, los paneles con adultos/juveniles se colocan verticalmente en racks en las bandejas en el laboratorio. Cada bandeja tiene cerca de 40 paneles con adultos. Con aproximadamente 100 adultos por grupo, en total ≈ 4.000 individuos adultos son cultivados por bandeja. Los percebes adultos son alimentados con Artemia y pueden mantenerse año-alrededor de. Las larvas Nauplio se recogen varias veces a la semana de la bandejas a través de una filtración a través de un tamiz. Los nauplios recolectados son transferidos a cubos a 26 ° C en un baño de agua y alimentados con microalgas. Nauplios se crían hasta que muda en no alimentación cyprids, que se recogen por filtración. Nuevos paneles se pueden establecer en el laboratorio por el asentamiento de cyprids en los paneles, o bien para proporcionar nuevos paneles para el año-alrededor de cultura o que se utilizarán para montajes experimentales específicos con condiciones externas alteradas. RNA se extrae entonces de juveniles/adultos al final del experimento o en puntos de tiempo específicos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Experimento de filtración acuática; etapas de equipos y procesos; configuración de separación de sedimentos; investigación." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2 : Imágenes de algunos pasos importantes en el procedimiento de cultivo. (A) esta imagen muestra los marcos con paneles para recoger nuevas poblaciones del campo. (B) esta imagen muestra los paneles con percebes adultos de B. improvisus en estantes que se colocan en bandejas. Los paneles se colocan unos 2 cm de separación. (C) esta imagen muestra las bandejas con el percebe paneles y el tanque de alimentación a la izquierda. De cada bandeja, hay una toma donde se colocan los tamices para la recogida de larvas Nauplio. (D) esta imagen muestra que la producción de Artemia de la alimentación para los percebes adultos. (E) esta imagen muestra la crianza de nauplios en cubos colocados en un baño de agua a 26 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Diagrama de anatomía de percebes; placas operculares, concha, detalles del cuerpo; estudio biológico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3 : Descripción de los pasos de disección inicial de percebes adultos: quitar el cuerpo de su caparazón. (A) agarre una de las placas operculares insertando fórceps suavemente a través de la abertura. Tire suavemente para eliminar la placa y exponer el animal. (B) Tire del animal por el acaparamiento de la parte de soma justo debajo de los cirros. (C) este panel muestra la anatomía general de percebes de la bellota. El manto y potencialmente fertilizado los huevos (en el ovario) permanecen en la cavidad de la concha cuando el cuerpo se saca. Una nota sobre la anatomía del Percebe (para una cuenta más detallada, véase Anderson)9: las placas de pared de un Percebe pendiente hacia adentro, y juntos, forman un cono de volcán-como. Una abertura, la abertura, está cubierta por las dos placas operculares, que forman una puerta, u opérculo para cerrar la abertura. Percebes de bellota tienen generalmente una placa basal calcárea que se pega firmemente al substrato; sin embargo, algunas especies de percebes carecen de esta placa calcárea (p. ej., S. balanoides). Percebes segregan exoesqueleto de manto oscuro pigmentado (el caparazón). La superficie externa del manto de doble capa es calcificada para ser rígido, mientras que la superficie interna del manto no está calcificada y por lo tanto es flexible. Dentro de la abertura, los cirros están presentes en una posición retraída. Estos son los apéndices torácicos que percebes utilizan para la alimentación de la suspensión. Los ovarios se encuentran cerca de la base de los balanos, mientras que los testículos se encuentran en el soma. Esta figura ha sido adoptada de Panova et al. 21 y ha sido publicado con el permiso de Springer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Gráfico de tiempo de fluorescencia vs. intensidad, análisis de datos de picos de emisión, estudio espectroscópico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4 : Determinación de la integridad del rRNA por electroforesis capilar. RNA fue preparado por dos métodos diferentes de homogeneización: sonicación (A) y (B) granos de cerámica. La unidad en el eje y, FU, soportes para unidades de fluorescencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Gráficos de barras que comparan la salinidad, los efectos del pCO₂ en la expresión de NKA-L1/NAK-S; Expresión de acuaporinas en tejidos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5 : Expresión génica resultados de dos estudios diferentes de genes importantes para la osmorregulación en B. improvisus. (A) este panel muestra la expresión diferencial según lo medido por qPCR de variantes de empalme de la Na+k+ ATPasa NAK1 en respuesta a diferentes salinidades y pCO2 niveles3. En el tratamiento de baja salinidad, aumenta la expresión de la isoforma larga (NAK1-L) en relación con el corto (ANOVA, P &lt; 0.001). (B) este panel muestra la expresión de aquaporins en adultos de B. improvisus durante su exposición a diferentes salinidades2. qPCR fue utilizado para determinar los niveles de expresión de Acuaporina en relación con la actina. Individuos adultos se incubaron en 3 diferentes salinidades (3, 20 y 33 PSU) durante 14 días. Para la preparación de RNA, el soma, cirros y manto de los adultos fueron separados. En ambas figuras, barras de error indican la desviación estándar. El ** y *** indican el nivel de significancia (ANOVA), 0.01 y 0.001, respectivamente. Estas cifras se han modificado de Lind et al. 2 , 3. ambas figuras se publican con permiso de PLoS ONE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Fase de establecimiento</td>
			<td>Cantidad total de RNA (ng)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natación libre</td>
			<td>512</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exploración: Búsqueda cercana</td>
			<td>518</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cyprid adjunto</td>
			<td>550</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nueva metamorfosis juvenil</td>
			<td>832</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: rendimientos de RNA. Esta tabla muestra la cantidad de RNA extraída con un kit de preparación de RNA de las piscinas de 20 individuos cyprid recogidos en diferentes etapas durante el proceso de liquidación.

El percebe Balanus (Amphibalanus) improvisus es un modelo para el estudio de osmoregulación y antifouling. Sin embargo, natural desove estacional produce una fuente impredecible de larvas de cyprid. Aquí, se describe un protocolo para el cultivo de todo el año de B. improvisus , incluyendo la producción de larvas. Se ilustra el uso de percebes cultivadas en estudios de expresión génica.

El percebe Balanus improvisus como modelo Marina - cultivo y expresión del gen

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

La instalación de cultivo puede ayudar a responder preguntas clave dentro de la ecología de las larvas, la bioincrustación y la biología evolutiva. Más concretamente, se puede utilizar en estudios sobre las interacciones receptor-ligando durante el asentamiento de larvas, el desarrollo de nuevas tecnologías antiincrustantes y la evolución y función de los genes implicados en la osmorregulación. La principal ventaja de este organismo modelo es que el percebe Balanus improvisus es robusto, se reproduce durante todo el año y tiene un tiempo de generación relativamente corto.Aunque este método puede proporcionar información sobre el cultivo de percebes, también se puede aplicar al cultivo de otros organismos marinos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la gran cantidad de detalles que son importantes para el éxito, como el suministro de buena agua de mar, la producción robusta de alimento de alta calidad y una atención constante a la limpieza y alimentación de los cultivos. Los encargados de demostrar el procedimiento estarán a cargo de Martin Ogemark y Anna-Lisa Wrange, técnicos e investigadores que trabajan con percebes.Para empezar, coloque marcos que puedan contener varios paneles termoplásticos transparentes. Taladre dos agujeros en las esquinas superiores de cada panel y use bridas para sujetar los paneles a los marcos. Para recolectar percebes adultos, despliegue los paneles verticalmente a una profundidad de uno a tres metros en aguas tranquilas.Después de permitir que los percebes se asienten y crezcan hasta cinco milímetros de diámetro, lleve los paneles al laboratorio. A continuación, coloque los paneles verticalmente en un soporte con ranuras fresadas en una bandeja de polietileno. Primero, usando cinta adhesiva no tóxica y resistente al agua, pegue cinco paneles juntos para crear un cubo que esté abierto en la parte superior.Coloca el cubo en una bandeja pequeña y llénala con agua de mar. A continuación, agregue aproximadamente 200 cyprids en la parte superior del cubo. Cada dos días, alimente a los percebes juveniles con 100 mililitros de Skeletonema marinoi.Después de dos o tres semanas, los paneles del cubo deben contener juveniles establecidos de al menos cinco milímetros de diámetro. Separe el cubo y mueva los paneles a bandejas con agua de mar que fluya a través de él. Para cosechar nauplios de Artemia, primero apague la bomba de aireación y oscurezca la botella, luego ilumine la parte inferior de la botella durante 10 minutos.Los nauplios de Artemia eclosionados nadarán hacia la luz. Los quistes no eclosionados se hundirán hasta el fondo, mientras que las cáscaras de los quistes flotarán hasta la parte superior. Abra la pinza en la parte inferior y recoja la fracción intermedia como una población densa de nauplios de Artemia nadadores.Para limpiar los paneles con percebes adultos, rocíelos suavemente con agua dulce y elimine cualquier suciedad con un cepillo de dientes suave. Limpie las bandejas sin percebes y los tubos con agua dulce caliente. A continuación, coloque un colador en la bandeja de polietileno con un puerto de desbordamiento.Recoja las larvas de percebe que se instalan en el tamiz durante la noche. A continuación, llene un cubo con 20 litros de agua de mar filtrada y un litro de una mezcla de microalgas de diatomeas para crear una densidad de 50.000 diatomeas por mililitro. Transfiera los nauplios de percebes recolectados previamente a un plato de cristalización e ilumine el plato desde un lado.A continuación, utiliza una pipeta para recoger los nauplios que nadan hacia la luz y transfierirlos a otra placa. Transfiera los nauplios a un vaso de precipitados que contenga un litro de agua de mar filtrada para contar. A continuación, añade un litro de nauplios al cubo previamente preparado.Después de tres días, use un tamiz de 90 micrómetros para recolectar los nauplios de percebes, luego limpie el balde, llénelo con agua de mar filtrada y agregue un nuevo alimento de diatomeas y los nauplios de percebes. Después de dos o tres días más de incubación, use un tamiz de 320 micrómetros encima de un tamiz de 160 micrómetros para separar los nauplios de percebes no mudados de los cípridos. Después de configurar cuatro botellas de cuatro litros para el cultivo de microalgas, coloque las botellas a la luz a una intensidad de 50 a 100 micromoles por metro cuadrado.Coseche los cultivos cuando sean lo suficientemente densos como para ser utilizados como alimentación. Primero, seleccione individuos grandes y retenga la comida durante dos días antes de la disección. Luego, limpie la cáscara del percebe con un cepillo de dientes y enjuague con agua para minimizar la contaminación de otras especies presentes en el ambiente.Coloque un percebe individual sobre una superficie plana para la disección, luego inserte la punta de un par de pinzas entre las placas tergal y escutal. Sujete un plato y tire de él suavemente para retirarlo. A continuación, utiliza unas pinzas para sujetar los cirros y tirar del percebe hacia fuera.Finalmente, coloque los percebes disecados directamente en una solución estabilizadora de etanol o ARN al 96% para su fijación. Con el protocolo descrito aquí, se pueden producir hasta cuatro lotes de larvas de nauplio de percebe en una semana. Como máximo, cada lote del sistema de cultivo consta de aproximadamente 12.000 nauplios, lo que significa que se pueden cultivar hasta 50.000 nauplios por semana.Dentro de una semana, entre el 70 y el 90% de los nauplios recolectados se convertirán en cípridos, produciendo aproximadamente 30.000 cípridos por semana. Se obtuvo un promedio de 500 nanogramos de ARN de alta calidad a partir de tan solo 20 cípridas individuales, independientemente de la etapa de asentamiento. En los percebes, el ARNr 28S se descompone cuando se calienta.La homogeneización por perlas cerámicas proporciona al ARN la máxima integridad, lo que lo convierte en el método preferido para el manejo de tejido de percebes y artrópodos. Utilizando el análisis de qPCR, se observó un aumento del doble para las variantes largas de ARNm de NAK1 y baja salinidad en comparación con el NAK corto. Esto indica que la forma larga es predominante en condiciones de baja salinidad.Se requieren algunas semanas de capacitación para dominar los diferentes pasos involucrados en el cultivo del percebe. Al intentar este procedimiento, es particularmente importante minimizar la contaminación en todos los pasos del flujo de trabajo de cultivo. Después de su desarrollo, esta técnica de cultivo ha sido fundamental para darnos una mejor comprensión de la ecología, la fisiología y la biología molecular del percebe.También es una piedra angular importante en la transformación del percebe Balanus improvisus en un potente sistema de modelos marinos.

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El hawaiensis anfípodo Parhyale es un organismo modelo prometedor para los estudios de embriología y desarrollo de artrópodos crustáceos comparativa y evolución. Este protocolo describe un método para la extracción manual de blastómeros individuales a partir de embriones en estadio de división primeros de Parhyale.

Ablación de una sola célula de ocho células de embriones de los crustáceos anfípodos<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

Los métodos que producen embriones morphant son esenciales para estudiar los mecanismos de desarrollo y redes reguladoras de genes. La estrella de mar patiria miniata es un sistema modelo emergente para estos estudios. Aquí se presenta un protocolo para la obtención de gametos, la producción de cultivos de embriones, y la rápida microinyección de cigotos de esta especie.

Un método para la microinyección de Patiria minata Los cigotos

Presentamos aquí la expresión robusta y eficiente de proteínas fluorescentes después de la inyección de ARNm en oocitos no fertilizados de Branchiostoma lanceolatum. El desarrollo de la técnica de microinyección en este cordado basal allanará el camino para que alcance las innovaciones técnicas en este sistema modelo emergente, incluyendo imágenes in vivo y manipulaciones de genes específicos.

Expresión de proteínas fluorescentes en Lanceolatum Branchiostoma Por mRNA La inyección en ovocitos no fecundados

El objetivo de este protocolo es proporcionar a los usuarios un conjunto de métodos para la desencapsulación de alto rendimiento de embriones y larvas de Lymnaea stagnalis en preparación para la hibridación in situ de montaje completo, y para posteriores tratamientos de pre y post-hibridación.

A todo el montaje<em&gt; In Situ</em&gt; Método de hibridación para el molusco gasterópodo<em&gt; Lymnaea stagnalis</em

Aquí demostramos cómo inducir y monitorizar la regeneración en la anémona de mar estrellada Nematostella vectensis, un antozoo cnidario modelo.  Demostramos cómo amputar y categorizar la regeneración utilizando un sistema de estadificación morfológica, y utilizamos este sistema para revelar un requisito para la autofagia en la regeneración de estructuras de pólipos.

Inducir completa Pólipo regeneración de la aboral Physa de la anémona de mar Starlet Vectensis Nematostella

El objetivo de este protocolo es realizar la hibridación en situ en adultos muestras de corales que han sido incrustadas en parafina y seccionadas en portaobjetos de vidrio. Se trata de un método cualitativo utilizado para visualizar la expresión espacial de una sonda de RNA anti sentida en tejidos embebidos en parafina.

In Situ Técnicas de hibridación para muestras de corales adultos parafinadas

El objetivo de este protocolo es genotipo la anémona de mar Nematostella vectensis durante la gastrulación sin sacrificar el embrión.

Genotipado de anémona sin mar durante el desarrollo temprano

Los doliolids, incluyendo la especie Dolioletta gegenbauri,son pequeños zooplancton marinos gelatinosos de importancia ecológica que se encuentran en los sistemas productivos de estanterías subcontinentales en todo el mundo. La dificultad de cultivar estos delicados organismos limita su investigación. En este estudio, describimos los enfoques de cultivo para la recolección, cría y mantenimiento de la doliolida Dolioletta gegenbauri.

Cultivo del Tenicato Pelágico Marino Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) para Estudios Experimentales

El artículo presenta métodos para el cultivo larvario del gasterópodo Crepidula fornicata en un sistema a escala de laboratorio de pequeño volumen y en un sistema de mesocosmos de agua de mar ambiental que se puede implementar en el campo.

Cultivo en Laboratorio y Campo de Larvas de la Lapa Zapatilla, Crepidula fornicata

Este estudio describe un marco para desarrollar un modelo de biopelícula polimicrobiana agregada y optimizar un protocolo de extracción de ARN para evaluar la expresión génica de Pseudomonas aeruginosa que refleja el entorno pulmonar de la fibrosis quística. Las aplicaciones incluyen la evaluación de los efectos antimicrobianos y el estudio de alternativas a los antibióticos en condiciones relevantes para la fibrosis quística.

Modelo de biopelícula agregada de fibrosis quística para estudiar la expresión génica relevante para la infección

Este estudio desarrolló un flujo de trabajo para la generación y mantenimiento de líneas mutantes estables para el caracol manzano de agua dulce, Pomacea canaliculata. Los protocolos incluyen la recogida de cigotos, su microinyección con los componentes del sistema CRISPR/Cas9 para inducir la edición del genoma, el cultivo ex ovo de embriones y el genotipado tras cruces controlados.

El caracol manzana dorada Pomacea canaliculata: De los cigotos a las líneas mutantes estables

Aprende el cultivo del percebe Balanus improvisus para estudios de expresión génica y osmorregulación marina. Este método permite producir hasta 50.000 larvas semanales con alta viabilidad.

El percebe Balanus improvisus como modelo Marina - cultivo y expresión del gen

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