Hidrogel Bioprintable alginato/gelatina 3D In Vitro modelo sistemas inducen formación de glóbulo esferoide

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del cáncer, como la formación de tumores, el seguimiento de la migración celular y la señalización del cáncer y las células sanas. La principal ventaja de esta técnica es que nos permite estudiar la tumorigénesis en un entorno 3D junto con células estromalas, como los fibroblastos, con un bajo coste y una alta reproducibilidad. Es importante asegurarse de que los materiales sean bioimprimibles y biofuncionales, lo que requiere un estudio cuantitativo de sus propiedades reológicas y compatibilidad celular.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de preparación y mezcla de hidrogel celular son difíciles de aprender porque la formación de burbujas interfiere con la fidelidad del modelo impreso. En un gabinete de bioseguridad, mezcle tres gramos de alginato y siete gramos de gelatina en polvo en un vaso de precipitados de 250 mililitros. Añade un agitador magnético y 100 mililitros de DPBS.

Selle el vaso de precipitados con una película de parafina estéril y papel de aluminio para evitar la contaminación. A continuación, muestre al participante los gráficos polares únicos y específicos que corresponden a sus patrones de electromiografía, o EMG. Después de esto, continúe la agitación a temperatura ambiente durante dos horas.

Calentar la solución a 37 grados centígrados hasta que el gel sufra una transición de fase al estado líquido. A continuación, transfiera la solución a tubos de centrífuga cónicos estériles de 50 mililitros y séllelos. Centrifugar los tubos a 834 veces g durante cinco minutos para eliminar las burbujas de gas.

A continuación, aspire el precursor de hidrogel en jeringas de 10 mililitros. Selle las jeringas con tapas y película de parafina. Almacene a cuatro grados centígrados hasta que esté listo para usar.

Cuando esté listo para comenzar la prueba, coloque una jeringa de precursor de hidrogel preparado en un baño de agua a 37 grados centígrados durante una hora. Mientras la jeringa se calienta, encienda e inicialice el reómetro. Después de una hora, retire la jeringa del baño de agua.

Extruya aproximadamente 0,5 mililitros del precursor en la plataforma del reómetro. En el panel de control, haga clic en el botón del triángulo hacia abajo. Espere a que la herramienta de medición baje a la posición de recorte.

Con una espátula, recorte cualquier exceso de precursor que haya escapado del borde de la herramienta de medición y deseche el material superfluo. A continuación, pipetee el aceite mineral en el borde de la herramienta de medición. Espere a que el aceite selle completamente el límite.

En el panel de control, haga clic en Continuar. A continuación, haga clic en el botón Inicio. Una vez completada la prueba, suelte la herramienta de medición y haga clic en el botón del triángulo hacia arriba.

Retire la herramienta de medición. Limpie tanto la herramienta de medición como la plataforma con etanol al 70%. Primero, complete los barridos de amplitud y temperatura como se describe en el protocolo de texto.

Para iniciar un barrido de tiempo isotérmico, haga clic en Mis aplicaciones y, a continuación, haga clic en la plantilla de Prueba de tiempo-temperatura isotérmica. Haga clic en el paso Medición en el flujo de trabajo. A continuación, haga clic en la deformación de oscilación variable y abra la ventana de configuración.

Establezca la tensión de oscilación en 0.1% y establezca la frecuencia de oscilación en un hercio. En la ventana desplegable, establezca el número de puntos de datos en 120. Establezca la frecuencia de recopilación de datos en un punto por minuto.

Haga clic en el botón Agregar para agregar la variable de temperatura. Haga clic en la temperatura variable y configúrela en 25 grados centígrados. Haga clic con el botón derecho en el paso Dispositivo, Mover al punto de medición en el flujo de trabajo.

Haga clic en Eliminar. A continuación, haga clic en el paso Dispositivo, Establecer valor. Desmarque la casilla Esperar hasta que se alcance el valor y establezca el valor en 25 grados centígrados.

Haga clic en Imagen, Título, Botones en la pantalla inferior. Desmarque la casilla Continuar. A continuación, haga clic en el paso Inicio, asigne un nombre al proyecto y guárdelo.

Ahora cargue la muestra en la plataforma del reómetro e inicie la prueba siguiendo el protocolo de prueba general descrito anteriormente. Después de esto, observe el número primo de Sol y el número primo doble de Sol frente al tiempo. Halla el punto de cruce de G primo y G doble primo, y determina el tiempo en el punto de cruce.

A continuación, haga clic en Tabla, copie todos los datos y péguelos en un archivo de texto. Para medir el límite elástico en varios momentos de gelificación, haga clic en Mis aplicaciones. Haga clic en la plantilla de Límite elástico y tensión de flujo, similar a un gel.

Asigne un nombre a este proyecto. A continuación, haga clic en el paso Inicio en el flujo de trabajo. En el menú superior, haga clic en Insertar.

A continuación, en el menú desplegable, seleccione Esperar. Abra la ventana de configuración y establezca el tiempo de espera en 50 minutos. Haga clic en Inicio y, a continuación, vuelva a hacer clic en Insertar.

Seleccione Dispositivo en el menú desplegable. Abra la ventana de configuración, seleccione Temperatura y configúrela a 25 grados centígrados. Desmarque la casilla Esperar hasta que se alcance el valor.

En el flujo de trabajo, seleccione el paso Medición. Seleccione la variable Esfuerzo cortante y abra la ventana de configuración. Ajuste el esfuerzo cortante inicial y final a cero y 10.000 pascales, respectivamente.

A continuación, haga clic en Calculadora, establezca la densidad de puntos en 0,2 puntos por pascale. En la pestaña Puntos de datos de la izquierda, establezca un punto por segundo. En la parte inferior de la ventana emergente, seleccione la pestaña Control de eventos, establezca el criterio Detener la medición si la velocidad de corte es superior a 100 por segundo.

Cargue la muestra en la plataforma del reómetro y comience la prueba siguiendo el protocolo de prueba general descrito anteriormente. Una vez completada la prueba, haga clic en Diagrama para observar la curva de tensión-deformación. Repita esta prueba para tiempos de espera de 30, 40 y 50 minutos.

Los siguientes pasos deben realizarse en condiciones estériles. Para empezar, esterilice la bioimpresora rociándola a fondo con etanol al 70% y exponiéndola a la luz ultravioleta durante la noche. Retire una jeringa de precursor de hidrogel del almacenamiento y caliéntela en un baño de agua a 37 grados centígrados durante una hora.

Transfiera un matraz en T de células previamente cultivadas de una incubadora de CO2 a la cabina de bioseguridad. Deseche el medio de cultivo y luego enjuague las células dos veces con DPBS. Agregue una solución tibia de tripsina-EDTA a las células.

Incubar a 37 grados centígrados durante seis minutos. Después de esto, inactive la tripsina agregando el mismo volumen de FBS. Retire la jeringa de precursor de hidrogel del baño de agua y límpiela.

Esterilice la jeringa con etanol al 70% antes de transferirla al gabinete de bioseguridad. Extruya aproximadamente tres mililitros de precursor de hidrogel en un cartucho de impresión de 10 mililitros. Mezcle el precursor con células MDA-MB-231-GFP a una concentración de un millón de células por mililitro pipeteándolo lentamente para evitar la producción de burbujas.

Cubra el cartucho con las tapas final y superior, y séllelo con una película de parafina. A continuación, centrifugarlo a 834 veces g durante un minuto para eliminar las burbujas de gas. Repite todo este proceso para los otros precursores.

Después de esto, esterilice los tres cartuchos con etanol al 70%. Cargue los cartuchos esterilizados en las cámaras de la bioimpresora. En el software de control de la impresora, haga clic en manual.

A continuación, expanda la pestaña Cabezal de herramienta en el software de control de la impresora. Haga clic en un cartucho en la interfaz gráfica del lado izquierdo, ajuste la temperatura del cartucho a 25 grados centígrados y espere 35 minutos para permitir que el precursor alcance las condiciones de impresión. Repita esto para los otros dos cartuchos.

En el software de control de la impresora, expanda la pestaña Cabezal de la herramienta. Haga clic en un cartucho en la interfaz gráfica y, a continuación, haga clic en el botón Medir corto para medir la posición de la punta de la boquilla. Repita esto para los otros dos cartuchos.

A continuación, coloque una microplaca de poliestireno transparente en la platina de la impresora. Abra el archivo de código G y cambie la presión a 200 kilopascales para todos los cartuchos. Regrese al software de control y haga clic en la pestaña Generador de andamios.

Seleccione un punto para iniciar la impresión y, a continuación, haga clic en el botón Ejecutar. Repita este proceso para obtener tres réplicas. Después de esto, agregue una solución de cloruro de calcio de 100 milimolares durante un minuto para reticular los modelos.

Enjuague dos veces con DPBS. Luego, use una espátula para transferir con cuidado los modelos a una placa de seis pocillos cubierta de agarosa. Agregue cinco mililitros de DMEM a cada pocillo e incube a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, reemplazando el medio de cultivo celular cada tres días.

En este estudio, se fabrican sistemas de hidrogel tridimensionales para recapitular microambientes tumorales in vivo y facilitar la formación de esferoides tumorales multicelulares. Un barrido de temperatura del precursor A3G7 muestra que G doble primo es mayor que G primo a 37 grados Celsius, lo que valida las propiedades conocidas del precursor. A medida que la temperatura disminuye, el precursor se somete a una gelificación física debido al enredo físico espontáneo de las moléculas de gelatina en una formación de triple hélice.

Tanto el sol primo como el sol doble doble aumentan, la temperatura disminuye y convergen a 30,6 grados centígrados, lo que indica una transición sol-gel. La microscopía confocal del modelo de hélice impresa muestra que las células MDA-MB-231-GFP comienzan a desarrollar esferoides a los 15 días del período de cultivo, y los esferoides continúan aumentando en tamaño y número hasta el día 30. También se observa que algunas de las células IMR-90-mCherry forman aglomeraciones.

Después de 30 días de cultivo, se pudieron observar células IMR-90-mCherry en la región inicialmente ocupada por las células MDA-MB-231-GFP, mientras que las células MDA-MB-231-GFP se observaron en la región dominada por IMR-90-mCherry. Esto implica posibles eventos de migración en el modelo. La microscopía confocal del modelo de disco revela que las células MDA-MB-231-GFP se comportan de manera similar a como lo hicieron en el modelo de hélice, lo que resulta en un hidrogel cargado de esferoide después de 21 días de cultivo.

Una vez dominada, esta técnica para imprimir modelos se puede realizar en dos horas, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener el hidrogel y las células lo más frescos posible, no mezclar lotes de hidrogel viejos con otros nuevos y trabajar en condiciones estériles para evitar resultados engañosos. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la microscopía electrónica de barrido y la microscopía de lapso de tiempo para responder preguntas adicionales, como la porosidad del material, la tasa de migración celular y la remodelación de la matriz.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia del cáncer porque este modelo in vitro permite estudios sistemáticos y controlados de la formación y el comportamiento tumoral en sistemas de co-cultivo. Además de las células de cáncer de mama, el modelo también se puede aplicar fácilmente a sistemas que utilizan otros tipos de células en varias ubicaciones iniciales. Después de ver este vídeo, debería tener una buena comprensión de cómo crear modelos de enfermedades heterogéneas en 3D mediante la preparación adecuada de hidrogeles, la incrustación de células y la impresión del material dentro de la ventana de impresión óptima.

No olvide que trabajar con muestras biológicas puede ser extremadamente peligroso y debe tomar precauciones como el uso de equipo de protección personal, como guantes, bata de laboratorio y gafas de seguridad mientras realiza este procedimiento.