Name: Hidrogel Bioprintable alginato/gelatina 3D In Vitro modelo sistemas inducen formación de glóbulo esferoide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 20 s
Description: Aprende a crear modelos tumorales 3D con bioimpresión de hidrogel alginato/gelatina usando células MDA-MB-231 e IMR-90. Esta técnica permite estudiar la formación de esferoides multicelulares y las interacciones tumor-estroma con bajo costo y alta reproducibilidad.

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Tao Jiang gracias el Consejo de becas de China (201403170354) y el Premio de Doctorado Ingeniería de McGill (90025) para la financiación de su beca. Jose G. Munguia-Lopez gracias CONACYT (250279, 290936 y 291168) y FRQNT (258421) para la financiación de su beca. Salvador Flores Torres agradece a CONACYT la beca de financiación (751540). Joseph M. Kinsella gracias a la ciencia nacional y Consejo de investigación de ingeniería, la Fundación Canadiense para la innovación, la Fundación de la familia Townshend Lamarre y Universidad de McGill para su financiación. Nos gustaría agradecer a Allen Ehrlicher por permitirnos usar su reómetro, Dan Nicolau por permitirnos usar su microscopio confocal y Morag parque para nosotros otorgando acceso a líneas celulares fluorescencia marcada.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Estructuras cargadas de celulares pueden ser comprometidas si contaminación (biológica o química) se produce en cualquier momento del proceso. Generalmente, contaminación biológica es vista después de dos o tres días de la cultura como un color cambia en los medios de cultivo o de la estructura de bioprinted. Por lo tanto, la esterilización (desinfección física y química) es un paso clave para todos los procesos relacionados con la célula. Notable, gelatina de autoclave cambia sus propiedades gelificantes, que hizo más l...

Aunque cultivo celular 2D es ampliamente utilizado en la investigación del cáncer, existen limitaciones como se cultivan las células en forma de monocapa con una concentración uniforme de nutrientes y oxígeno. Estas culturas carecen de importante célula-célula y las interacciones célula-matriz presentan en el microambiente del tumor nativo (TME). En consecuencia, estos modelos mal recapitulan las condiciones fisiológicas, lo que resulta en comportamientos aberrantes de la célula, incluyendo morfologías antinaturales, organización irregular del receptor, polarización de la membrana y expresión de genes anormales, entre otros condiciones1,2,3,4. Por otra parte, cultivo celular 3D, donde las células se expanden en un espacio volumétrico como agregados, esferoides, organoides, ofrece una técnica alternativa para crear ambientes en vitro más precisas para estudiar la fisiología y biología de la célula fundamental. Modelos de cultura celular 3D también pueden fomentar las interacciones célula-ECM que son la fundamentales características fisiológicas de los TME nativo en vitrode4,1,5. La tecnología emergente de bioprinting 3D ofrece posibilidades para construir modelos que imitan el TME heterogéneo.
Bioprinting 3D se deriva de prototipado rápido y permite la fabricación de microestructuras 3D que son capaces de imitar algunas de las complejidades de la vida tejido muestras6,7. Los métodos actuales de bioprinting incluyen chorro de tinta, extrusión y asistida por láser impresión8. Entre ellos, el método de extrusión permite la heterogeneidad a ser controlada dentro de las matrices impresas colocando precisamente distintos tipos de materiales en diferentes lugares iniciales. Por lo tanto, es el mejor enfoque para fabricar heterogéneos en vitro modelos que involucran a múltiples tipos de células o matrices. Bioprinting de extrusión se ha utilizado con éxito para construir andamios forma auricular9,11,de10,12de estructuras vasculares y tejidos13, resultando en la célula y alta fidelidad de impresión de la piel viabilidad. La tecnología también ofrece selecciones de material versátiles, la capacidad de depósito de materiales con células con una densidad conocida y alta reproducibilidad14,15,16,17 . Hidrogeles naturales y sintéticos se utilizan con frecuencia como bioinks para 3D bioprinting debido a su biocompatibilidad, bioactividad y sus redes hidrofílicos que pueden ser diseñados para parecerse estructuralmente a la ECM7,18 ,19,20,21,22,23. Los hidrogeles también son ventajosos ya que pueden incluir sitios de adhesivo para las células, elementos estructurales, permeabilidad de gases y nutrientes, y las adecuadas propiedades mecánicas a la célula de desarrollo24. Por ejemplo, hidrogeles de colágeno ofrecen integrina sitios de anclaje que las células pueden utilizar para atar a la matriz. Gelatina, colágeno desnaturalizado, conserva sitios de adherencia de células similares. En contraste, el alginato es bioinert pero proporciona integridad mecánica mediante la formación de reticulaciones con iones divalentes25,26,27,28.
En este trabajo, hemos desarrollado un hidrogel compuesto como un bioink, compuesto de alginato y gelatina, con similitudes a la arquitectura microscópica de un tejido conectador tumoral nativo. Fibroblastos y las células de cáncer de mama fueron encajados en los hidrogeles e impresión por medio de una bioprinter basada en la extrusión para crear un modelo 3D que imita el microambiente en vivo . El entorno 3D ingeniería permite las células cancerosas para formar esferoides multicelulares tumor (MCTS) con una alta viabilidad por largos períodos de cultivo celular (> 30 días). Este protocolo muestra las metodologías de síntesis de hidrogeles compuestos, caracterización de la microestructura e impresión, bioprinting celular modelos heterogéneos, los materiales y observar la formación de MCTS. Estas metodologías se pueden aplicar a otros bioinks en bioprinting de extrusión así como diversos diseños de modelos de tejido heterogéneo con potenciales aplicaciones en detección de drogas, ensayos de migración de la célula y estudios que se centran en la célula fundamental funciones fisiológicas.

<table><tbody><tr><td>Alginato de sodio</td><td>FMC BioPolymer</td><td>CAS-No: 9005-38-3</td><td>Protanal LF 10/60 FT</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td>Tipo B de piel bovina</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dubelcco (DPBS 1X)</td><td>Gibco</td><td>LS14190136</td><td>1&times;, sin calcio, sin magnesio</td></tr><tr><td>Placa calefactora magnética</td><td>Corning&nbsp;</td><td>N/</td><td>A Agitador/placa calefactora modelo PC-420</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 50 mL</td><td>Corning</td><td></td><td>352098 Falcon&reg; 50mL Tubo de centrífuga PP de alta claridad, fondo cónico,</td></tr><tr><td>centrífuga</td> estéril <td>GMI</td><td>N/A</td><td>Sorvall RT6000D, GMI, EE. UU.</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio anhidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ agua</td><td>Millipore</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Millipore 0.22 y micro; m filters</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td>Millex-GS Unidad de filtro de jeringa, 0.22&nbsp; y micro; m, mezclas de ésteres de celulosa, 33&nbsp; mm, óxido de etileno esterilizado</td></tr><tr><td>Reómetro de oscilación MCR 302</td><td>Anton Paar</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Reómetro herramienta de medición CP25</td><td>Anton Paar</td><td>79038</td><td>Geometría de placa cónica para reómetro</td></tr><tr><td>RheoCompass</td><td>Anton Paar</td><td>N/A</td><td>Reómetro de control por software MCR 302</td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de barrido</td><td>Hitachi N</td><td>/A</td><td>SEM, Hitachi SU-3500 Presión variable</td></tr><tr><td>Paraformaldehído, 96%, extra puro</td><td>Acros Organics</td><td>416785000</td><td></td></tr><tr><td>medio de águila modificado Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Solución antibiótica/antimicótica (100X) estabilizado</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>Matraces de cultivo celular T-75</td><td>Sigma-Aldrich CLS430641</td><td></td><td>75 cm2 Tratamiento de superficies con TC</td></tr><tr><td>Bioimpresora 3D BioScaffolder 3.1</td><td>GeSiM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GeSim software</td><td>GeSiM</td><td>N/A</td><td>Software de control BioScaffolder 3.1</td></tr><tr><td>Cartucho de 10cc resistente a los rayos UV</td><td>EFD Nordson</td><td>7012126</td><td></td></tr><tr><td>Tapa final</td><td>EFD Nordson 7014472</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tapa de punta</td><td>EFD Nordson</td><td></td><td></td>7014469</tr><tr><td>pistón&nbsp;</td><td>EFD Nordson</td><td>7012182</td><td></td></tr><tr><td>Boquilla de acero inoxidable G25</td><td>EFD Nordson</td><td>7018345</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>VWR</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>Biorreactivo, para biología molecular</td></tr><tr><td>Costar Placas de 6 pocillos&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>TC Placas de pocillos múltiples, envueltas individualmente, estériles&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopio invertido de disco giratorio confocal</td><td>Olympus Life Science</td><td>N/A</td><td>Olympus IX83</td></tr><tr><td>MTS kit de ensayo</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>CellTiter 96&reg; AQueous&nbsp; Ensayo de proliferación celular de una solución&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de citotoxicidad de viabilidad viva/muerta</td><td>Sondas moleculares,ThermoFisher Scientific</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 0.25/EDTA 1X</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Corning Placa de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>3595</td><td>Poliestireno transparente de fondo plano TC Microplaca, envuelta individualmente, con tapa de baja evaporación,</td></tr><tr><td>autoclave estéril Tuttnauer</td><td>Heidolph Brinkmann</td><td>N/A</td><td>Heidolph Tuttnauer 2540E Esterilizador de Autoclave Modelo Electrónico con 4 Bandejas de Acero Inoxidable, 23L de Capacidad</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>T10282</td><td>Solución al 0,4%</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Alcoholes comerciales</td><td>P016EA95</td><td>Alcoholes especiales Greenfield</td></tr><tr><td>Incubadora 2</td><td>Panasonic</td><td>N/A</td><td>MCO 19AIC-PA</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>SP Scientific</td><td>N/A</td><td>Virtis Sentry 2.0</td></tr><tr><td>SolidWorks</td><td>Dassault Systems</td><td>N/A</td><td>Un software CAD utilizado para construir un modelo demostrativo similar a una hélice</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks</td><td>N/A</td><td>Un software de programación utilizado para generar código G para BioScaffolder 3.1</td></tr></tbody></table>

hidrogel bioprintable alginato/gelatina 3d in vitro modelo sistemas inducen formación de glóbulo esferoide

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

La heterogeneidad celular, bioquímica y Biofísica del microambiente tumoral nativo no es recapitulada por creciente líneas celulares de cáncer inmortalizadas mediante cultivo celular (2D) bidimensional convencional. Estos retos pueden superarse mediante técnicas de bioprinting para construir modelos de tumor heterogéneo de (3D) tridimensional por el que se encajan los diferentes tipos de células. Alginato y la gelatina son dos de los biomateriales más comunes empleados en bioprinting debido a su biocompatibilidad, biomimética y propiedades mecánicas. Mediante la combinación de dos polímeros, logramos un hidrogel compuesto de bioprintable con similitudes a la arquitectura microscópica de un tejido conectador tumoral nativo. Estudiamos la imprimibilidad de hidrogel compuesto por reología y obtiene la ventana de impresión óptima. Fibroblastos y las células de cáncer de mama fueron incrustados en los hidrogeles e impreso para formar un modelo 3D que mímico el microambiente en vivo . El modelo heterogéneo de bioprinted alcanza una alta viabilidad de cultivos celulares a largo plazo (> 30 días) y promueve el automontaje de las células de cáncer de mama en esferoides multicelulares tumor (MCTS). Se observan la migración y la interacción de las células de fibroblastos asociada al cáncer (CAF) con el MCTS en este modelo. Mediante el uso de plataformas de la cultura de célula bioprinted como sistemas de co-cultivo, ofrece una herramienta única para estudiar la dependencia de tumorigénesis de la composición del estroma. Esta técnica cuenta con un alto rendimiento, bajo costo y alta reproducibilidad, y también puede proporcionar un modelo alternativo a los cultivos de monocapa de celulares convencionales y modelos animales de tumor para el estudio de la biología del cáncer.

El barrido de temperatura muestra una clara diferencia del precursor del A3G7 a 25 ° C y 37 ° C. El precursor es líquido a 37 ° C y tiene una viscosidad compleja de 1938.1 mPa ± 84,0 x s, que es validado por un G mayor "sobre G'. A medida que la temperatura disminuye, el precursor somete a congelación física debido al enredo físico espontáneo de las moléculas de gelatina en un tri-helix formación29,30. Tanto el G' y el G "aumentar...

Hemos desarrollado un modelo de cáncer de mama heterogéneos consistiendo en las células fibroblastos y tumor inmortalizadas encajadas un bioink de alginato/gelatina de bioprintable. El modelo recoge el microambiente tumoral de en vivo y facilita la formación de esferoides multicelulares tumor, dando la penetración en los mecanismos de conducción tumorigenesis.

Hidrogel Bioprintable alginato/gelatina 3D In Vitro modelo sistemas inducen formación de glóbulo esferoide

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del cáncer, como la formación de tumores, el seguimiento de la migración celular y la señalización del cáncer y las células sanas. La principal ventaja de esta técnica es que nos permite estudiar la tumorigénesis en un entorno 3D junto con células estromalas, como los fibroblastos, con un bajo coste y una alta reproducibilidad. Es importante asegurarse de que los materiales sean bioimprimibles y biofuncionales, lo que requiere un estudio cuantitativo de sus propiedades reológicas y compatibilidad celular.La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de preparación y mezcla de hidrogel celular son difíciles de aprender porque la formación de burbujas interfiere con la fidelidad del modelo impreso. En un gabinete de bioseguridad, mezcle tres gramos de alginato y siete gramos de gelatina en polvo en un vaso de precipitados de 250 mililitros. Añade un agitador magnético y 100 mililitros de DPBS.Selle el vaso de precipitados con una película de parafina estéril y papel de aluminio para evitar la contaminación. A continuación, muestre al participante los gráficos polares únicos y espe

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

El siguiente protocolo proporciona técnicas para encapsular las células β del páncreas en PEG-péptido crecimiento paso a hidrogeles formados por tiol-eno clic en la foto-reacciones. Esta plataforma de material no sólo ofrece un microambiente citocompatible para encapsulación de células, sino que permite también controlada por el usuario rápida recuperación de las estructuras celulares formadas dentro de los hidrogeles.

Generación y Recuperación de β-células esferoides de PEG-péptido de crecimiento Paso hidrogeles

Un bioprinter se utilizó para crear hidrogeles modelado basado en un molde de sacrificio. El molde poloxámero se rellenó con un segundo hidrogel y luego se eluyó, dejando huecos que estaban llenos de una tercera hidrogel. Este método utiliza elución rápida y buena capacidad de impresión de poloxámero para generar arquitecturas complejas a partir de biopolímeros.

Impresión Moldes inversa termosensible para la Creación de modelado hidrogeles de dos componentes para el 3D de cultivo celular

Aquí, describimos un protocolo rápido y flexible para la formación de esferoides celulares 3D a través de la agregación celular. Se adapta fácilmente a múltiples tipos de células y es adecuado para su uso en una variedad de aplicaciones, incluidos los ensayos de migración celular, invasión o anoikis, y para obtener imágenes y cuantificar las interacciones célula-matriz.

Un método de agregación celular eficiente y flexible para esferoide 3D Producción

Este protocolo describe la fabricación de microcryogels elástico macroporoso 3D integrando microfabricación con tecnología cryogelation. A cargar con las células, se generan microtissues 3D, que puede ser fácilmente inyectados en vivo para facilitar la terapia regenerativa o montado en arreglos de discos para en vitro screening de drogas de alto rendimiento.

Microtissues 3D para la terapia regenerativa inyectable y drogas de alto rendimiento

Aquí se presenta un método para la bioimpresión 3D de gelatina metacriloyl.

Protocolos de Bioimpresión 3D de Bioinks basados en Gelatin Methacryloyl Hydrogel

El objetivo de este protocolo es bioimprimir directamente las células epiteliales mamarias como esferoides multicelulares en redes endoteliales preformadas para crear rápidamente modelos de co-cultivo endotelial mamario 3D que pueden ser utilizados para estudios de detección de fármacos.

Bioimpresión directa de esferoides multicelulares de mama 3D en redes endoteliales

El presente protocolo describe una técnica para producir esferoides tisulares a gran escala de forma rentable utilizando un dispositivo similar a un sello impreso en 3D.

Generación de esferoides de tejido a través de un dispositivo similar a un sello impreso en 3D

El procesamiento por cizallamiento durante la formación de hidrogel da como resultado la producción de suspensiones de microgel que se adelgazan pero se reestructuran rápidamente después de la eliminación de las fuerzas de cizallamiento. Tales materiales se han utilizado como una matriz de soporte para bioimpresión compleja, estructuras cargadas de células. Aquí se describen los métodos utilizados para fabricar la cama de soporte y las biotintas compatibles.

Geles fluidos de agarosa formados por procesamiento de cizallamiento durante la gelificación para bioimpresión 3D suspendida

Aquí, presentamos un protocolo que permite la fabricación rápida, robusta y barata de esferoides tumorales seguida de encapsulación de hidrogel. Es ampliamente aplicable ya que no requiere equipo especializado. Sería particularmente útil para explorar las interacciones esferoides-matrices y construir modelos de fisiología tisular o patología in vitro .

Fabricación y encapsulación de esferoides tumorales en hidrogeles de polietilenglicol para el estudio de las interacciones esferoide-matriz

Este estudio presenta una metodología rentable y eficiente para generar estructuras celulares en 3D utilizando un sistema basado en sellos para crear micropocillos en moldes de agarosa. El sistema promueve la formación de esferoides/organoides uniformes, mejorando así las interacciones celulares. Este enfoque reduce la variabilidad experimental y apoya las aplicaciones en pruebas de fármacos e ingeniería de tejidos.

Generación de esferoides/organoides tridimensionales a partir de cultivos celulares bidimensionales utilizando un novedoso dispositivo de estampado

Aprende a crear modelos tumorales 3D con bioimpresión de hidrogel alginato/gelatina usando células MDA-MB-231 e IMR-90. Esta técnica permite estudiar la formación de esferoides multicelulares y las interacciones tumor-estroma con bajo costo y alta reproducibilidad.

Hidrogel Bioprintable alginato/gelatina 3D In Vitro modelo sistemas inducen formación de glóbulo esferoide

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