Name: Una combinatoria unicelular enfoque para caracterizar Molecular y heterogeneidad de Immunophenotypic de madre humana y de las poblaciones progenitoras (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Aprende a caracterizar la heterogeneidad celular mediante análisis de expresión génica unicelular combinado con FACS. Este método permite aislar subpoblaciones específicas de células madre y cáncer para estudios funcionales detallados.

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Este trabajo es apoyado por becas de la sociedad sueca de cáncer, el Consejo de investigación sueco, sociedad sueca para la investigación médica, la Fundación sueca de cáncer infantil, la Fundación de Söderberg de Ragnar y el Knut y Alice Wallenberg Foundation

1. preparación de placas de lisis
<ol><li>Un banco libre de ARN/ADN, preparar suficiente buffer de lisis de 96 pocillos, con 10% extra, mezclando 390 agua libre de nucleasa μl, 17 μl de 10% NP-40, 2,8 μl 10 mM dNTP, 10 μl de 0,1 M TDT e inhibidor de Rnasa de 5.3 μl (véase Tabla de materiales). Vórtice y desactivación.</li>
	<li>Distribuir 4 μL de tampón de lisis en cada pocillo de una placa PCR bien 96 y sellar las placas con la película adhesiva. Desactivación de tubos para recoger el líquido en la parte inferior de las placas. Manten las placas de hielo hasta la célula clasificación (máximo 24 h).</li>
</ol>2. preparación de células para la clasificación de la célula
<ol><li>Descongelar el número apropiado de células (aquí, enriquecido madre hematopoyética CD34 y células progenitoras) para el experimento. 1 x 106 células son apropiadas para clasificar aproximadamente tres placas de 96 pocillos de solo las células con los controles.</li>
	<li>Transferencia de células descongeladas a un tubo cónico de 15 mL y añadir 1 mL de SBF cada 30 s hasta alcanzar un volumen total de 8 mL. Girar las células en una centrifugadora a 350 x g por 10 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender las células en 8 mL de tampón de tinción (PBS con 2% SBF) y centrifugar a 350 x g durante 10 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender las células en 200 μL tinción de buffer y eliminar células para control de manchas.</li>
	<li>Hacen fluorescencia menos uno controla (consistente) para cada fluoróforo, manchando de una fracción de células en 50 μl de tampón de tinción. En este ejemplo, se utilizan 6 tubos de microcentrífuga con 20.000 células como FMOSs. Tenga en cuenta que el número de células debe ajustarse dependiendo de la población investigada. Añadir anticuerpos todos en la misma concentración como en la tinción de la muestra excepto uno en cada tubo.</li>
	<li>Hacer las manchas individuales para cada fluoróforo manchando de una fracción de células en 50 μl de tampón de cada fluoróforo utilizado. En este ejemplo se utilizan 6 tubos de microcentrífuga con 20.000 células. Tenga en cuenta que el objetivo para cada anticuerpo debe ser expresada por las células que se utiliza para los controles. Añadir cada anticuerpo en la misma concentración como en la tinción de la muestra en tubos individuales. Además tenga 20.000 células sin manchas en 50 μl como control sin manchas.</li>
	<li>Añadir a la muestra de células, anticuerpos en su concentración adecuada. Usados aquí son CD34-FITC a una concentración 1/100, 1/50, CD38-APC CD90-PE 1/10, CD45RA-bv421 1/50, CD49F-PECy7 1/50 y linaje mezcla: 1/50 de CD3-PECy5 CD2-PECy5 1/50, CD19-PECy5 1/50, CD56-PECy5 1/50, CD123-PECy5 1/50, CD14-PECy5 1/50, CD16-PECy5 1/50, y CD235a-PECy5 1/1000.</li>
	<li>Incubar las células con anticuerpos por 30 min en hielo en la oscuridad.</li>
	<li>Lavar las células con 3 mL de tampón de tinción. Centrifugar las células a 350 x g por 10 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender las células y repetir el paso 2.9.</li>
	<li>Agite la muestra de 500 μl y consistente en 100 μl de buffer con células 7AAD y filtro de 1/100 de tinción a través de un filtro de 50 μm para obtener una suspensión unicelular.</li>
</ol>3. célula clasificación
<ol><li>Asegúrese que la máquina de FACS está correctamente con retardo de caída y configuración citómetro y seguimiento (CST) que recientemente se han realizado según las instrucciones del fabricante, para asegurar que se ordenan las células adecuadas. De células hematopoyéticas, se recomienda el uso de la velocidad de la boquilla y máximo de 85 micras de 4, mientras que la tasa de evento óptima es entre 800 y 2000 eventos/s.</li>
	<li>Correcta superposición espectral mediante la realización de compensación de fluorescencia y ajustar puertas según FMO controles o controles internos negativos.</li>
	<li>Realizar nuevo análisis de la población objetivo por clasificar por lo menos 100 células de destino en un nuevo tubo de microcentrífuga con 100 μl de tampón de tinción. FACS analizar las células clasificadas mediante el registro de la muestra ordenada y asegúrese de que terminan en la puerta de clase.</li>
	<li>Instalación placa celular única clasificación centrando la gota en el pocillo A1 en una placa bien 96. Cuando se centra, ordenar las partículas del μm 50 – 100 6 en todos los pozos alrededor del borde de un plato bien 96 vacío para asegurar que todos los pocillos Obtén una celda en el centro de cada pozo.</li>
	<li>Si es posible, puede agregarse un control adicional para asegurarse de que las células viables se ordenan por ordenar solo las células para el crecimiento en vitro . Células hematopoyéticas pueden cultivarse en placas bien inferior U 96 en 100 μl SFEM con 1% estreptomicina penicilina, 100 ng/mL FLT3L, TPO y SCF. Analizar cada bien después de 3 días en la cultura para las colonias de células utilizando un microscopio.</li>
	<li>Retire la película de placas. Una sola célula de tipo de interés (aquí Lin-CD34 + CD38-células) en 92 de 96 pocillos, activar ordenación de índice en el FACS clasificación software para guardar el perfil immunophenotypic para otros marcadores de interés (aquí CD45RA, CD49f y CD90) para cada célula.</li>
	<li>Ordenar dos pozos con 10 y 20 células respectivamente para controles de linealidad de la amplificación por PCR. Pozos H1 y H2 se utilizan generalmente.</li>
	<li>Mantener dos pozos sin cualquier célula como plantilla de no controles, generalmente pozos H3 y H4.</li>
	<li>Sellar las placas con la película transparente adhesiva y girar las placas a 300 x g durante 1 min antes de presión cero en hielo seco.</li>
	<li>Almacenar las placas congeladas a-80 ° C. Nota: Punto seguro. Las células sometidas a lisis y ordenadas pueden conservarse a-80 ° C para almacenamiento a largo plazo.</li>
</ol>4. Invierta la transcripción y la amplificación de la Diana
<ol><li>Preparar la mezcla de cartilla para todos los objetivos gen 96 agregando 2 μl de cada primer, incluyendo par limpieza gene cartillas y cartillas para el control de tacon en RNA, de 1,5 mL tubo libre de ARNasas en un banco libre de ARN/ADN. Si usando las cartillas menos de 96, añadir un volumen equivalente de agua libre de nucleasa para los iniciadores que falta. Cartillas se ordenan por separado para que coincida con el panel del gene deseado.</li>
	<li>Hacer la transcripción inversa y amplificación específicos mezclar agregando 632.5 μl 2 x la mezcla de reacción, 101.2 μl Taq/SuperscriptIII, 151.8 μl mezclar de cartilla y 0,7 μl con control RNA. Preforma de este paso en un banco de ADN gratuito. Mezcla por Vortex y centrifugar hasta recoger el líquido en la parte inferior del tubo. Mantenga en hielo hasta que además de la muestra.</li>
	<li>Hacer no-reverso transcripción control mezcla de cuatro pozos mezclando 27,5 μl de 2 x la mezcla de reacción, 1.76 μl de enzima Taq, 6,6 μl de mezcla de cartilla y 2.64 μl de agua libre de nucleasa. Punto de control de RNA. Realizar este paso en un banco de ADN gratuito. Vórtice y vuelta hacia abajo para recoger el líquido en la parte inferior del tubo y mantener en hielo hasta la adición a la muestra.</li>
	<li>Descongelar las placas lisadas en hielo. Añadir μl 8,75 de la transcripción reversa previamente preparada y mezcla de amplificación específicos a 92 pozos, incluyendo los controles de linealidad y no es de plantilla. Añadir 8,75 μl de mezcla de control no-reverso transcripción a los cuatro pozos restantes. Sellar las placas con la película adhesiva del claro y vuelta a recoger líquido en la parte inferior de las placas.</li>
	<li>Preforma de transcripción inversa y amplificación específicos mediante la ejecución de la placa en una máquina PCR según el programa previo; Paso 1:50 ° C durante 60 min, paso 2: 95 ° C por 2 min, paso 3: 95 ° C por 15 s, paso 4: 60 ° C por 4 min, repita los pasos 3-4 24 veces y finalmente el paso 5: 8 ° C para siempre.</li>
	<li>Después de PCR es completa, mantenga la placa en 8 ° C para almacenamiento a corto plazo y -20 ° C para almacenamiento a largo plazo. Nota: Punto seguro. Material amplificado puede conservarse a 8 ° C para almacenamiento a corto plazo y a-20 ° C para almacenamiento a largo plazo.</li>
</ol>5. preparación de muestra y las placas de ensayo para análisis de expresión génica de microfluidos Multiplex
<ol><li>Preparar ensayo placa de carga por pipeteo 3 μl de reactivo de ensayo de carga en cada pocillo de una placa bien 96. Agregar 3 μl de cada cebador a pocillos individuales en el ensayo de placa de carga.</li>
	<li>Selle la placa con película adhesiva y vuelta a recoger líquido en la parte inferior de las placas.</li>
	<li>Preparar placa de dilución por pipeteo 8 μl de nucleasa agua libre en todos los pocillos de una placa bien 96. Añadir 2 μl de la muestra ampliada a la placa de la dilución, realizar una dilución final de 1:5.</li>
	<li>La placa con la película adhesiva del sello, de la mezcla por la placa de Vortex por 10 s y por último girar hacia abajo para recoger líquido en la parte inferior de las placas.</li>
	<li>Preparar mezcla de carga de la muestra mezclando cuidadosamente 352 μl de mezcla principal con 35,2 μl de muestra carga reactivo. Preparar placa de carga de la muestra tomar 3.3 μl de mezcla a cada pocillo de una placa bien 96 de carga.</li>
	<li>Añadir 2,7 μl de la muestra diluida en cada pocillo de la muestra de placa de carga.</li>
	<li>Selle la placa con película adhesiva y vuelta a recoger líquido en la parte inferior de las placas.</li>
</ol>6. carga del Chip de microfluidos
<ol><li>Sacar un nuevo chip de microfluidos 96 x 96. Preparar las entradas por meter con una jeringa con la tapa en asegurarse de que se puedan mover.</li>
	<li>Elimine las burbujas de la jeringa. Añadir volumen completo de jeringas a cada válvula mientras el chip de inclinación 45 grados y presionar la válvula. Primer chip con el controlador IFC.</li>
	<li>Cargar cada entrada ensayo con 4.25 μl de cada uno de los pozos en el ensayo de placa de carga. Evitar las burbujas. Si aparecen burbujas en el pozo, elimínelos con una punta de pipeta.</li>
	<li>Continuar cargando cada entrada muestra con 4.25 μl de cada uno de los pozos en la muestra de placa de carga, evitar burbujas y si aparecen burbujas, retirar con la punta de la pipeta.</li>
	<li>Carga de viruta con el controlador IFC.</li>
	<li>Verifique que el chip se ve aún y que las cámaras hayan sido cargadas. Eliminar el polvo de la superficie del chip tocando con cinta. El chip se ejecutan en la plataforma de expresión de gene de microfluidos multiplex.</li>
</ol>7. ejecución de Chip en Multiplex microfluídicos Gene expresión plataforma
<ol><li>Después de cargar el chip en la plataforma de expresión de gene de microfluidos multiplex, nombre de la muestra.</li>
	<li>Establecer ROX como tinte pasiva. Fijar sonda individual y FAM-MGB como fluorescencia. 96 x 96 estándar v2 como el protocolo en uso. Empezar a correr.</li>
	<li>Quitar chip cuando se ejecuta es completa.</li>
</ol>8. preliminar análisis del funcionamiento de la viruta
<ol><li>Cargar datos en el software de análisis de PCR en tiempo real.</li>
	<li>Cargar nombres de genes y células pegar diseños celular y génica de un archivo delimitado por tabuladores.</li>
	<li>Abrir la vista de la imagen y seleccione ROX como tinte. Compruebe si todos los pozos tienen tinte pasiva ROX.</li>
	<li>Investigar si todas las parcelas de amplificación mira bien, con una curva de amplificación liso sin púas (similar a la figura 3E).</li>
	<li>Asegúrese de que todas las células solo tienen expresión de tacon en control RNA para asegurarse de que todos hayan sido cargados correctamente.</li>
	<li>Asegúrese de que todas las células tienen genes housekeeping y así han sido clasificadas correctamente.</li>
	<li>Aseguran control de linealidad de célula 10 y 20 aproximadamente 1 CT diferencia a validar linear de la amplificación.</li>
	<li>Compruebe si hay expresión en las muestras de control norte. Si se detecta la expresión en noRT considere cambiar sondas sondas que no detectan ADN genómico para posteriores carreras.</li>
	<li>Exportación de datos en archivos csv para su posterior análisis.</li>
</ol>9. unicelular análisis con SCExV
Nota: Una película introductoria está presente20 para introducir la herramienta. Aquí, se presenta una breve recomendación de cómo hacer uso de los controles introducidos en el protocolo de análisis.
<ol><li>Conecte a la Página Web de SCexV20.</li>
	<li>Subir archivos CSV exportados.</li>
	<li>Eligió el tacon en control RNA como control positivo. Eliminar cualquier célula que tiene un control ARN CT por encima de 25. Normalizar los datos mediana expresión de control RNA.</li>
	<li>Haga clic en "aquí -> analizar". Eliminar noRT, notemplate, 10 y 20 controles de celular en la opción de excluir de la célula.</li>
	<li>Se agrupan las células con el enfoque de clusterización de elección con el número esperado de racimos. Valores de exportación analizado.</li>
</ol>10. ordenación de índice análisis
<ol><li>Abra el software de análisis FACS y cargar las muestras indexadas.</li>
	<li>Abra el editor de secuencias de comandos y ejecute el script disponible de J. Quinn et al. 21
</li>
	<li>Ahora que el software de análisis FACS si han hecho una puerta para cada una de las células, abrir el editor de diseño y color de las células según la agrupación de SCexV (disponible en el archivo llamado "Sample_complete_Data.xls").</li>
</ol>

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<li>Schulte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Index+sorting+resolves+heterogeneous+murine+hematopoietic+stem+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations.</a> Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).</li>
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Los autores no tienen nada que revelar.

En los últimos años, análisis de expresión génica de la célula solo se ha convertido en un valioso aporte para definir la heterogeneidad de las diferentes poblaciones de células23. El advenimiento de las tecnologías de secuencias de RNA ofrece teóricamente una posibilidad para medir el transcriptoma completo de una célula, sin embargo estos métodos son complicados por las variaciones de profundidad de secuenciación de célula a célula y abandono. Sola célula qPCR ofrece un análisis sensible y robus...

Cada célula individual de la sangre se cree que residen en una jerarquía de celular, donde las células madre forman el ápice en la parte superior una serie de progenitores intermedias cada vez más comprometidos que eventualmente terminal se diferencian en las células effector final transporte específico funciones biológicas1. Mucho del conocimiento sobre cómo están organizados los sistemas de la célula de vástago se ha generado en el sistema hematopoyético, en gran parte debido a la capacidad de prospectiva aislar a poblaciones hematopoyéticas distintas altamente enriquecidas de células madre o progenitores diferentes2 por clasificación de FACS. Esto ha permitido muchas de estas poblaciones a analizarse funcionalmente o molecularmente, predominante a través de la expresión génica perfiles3,4. Sin embargo cuando análisis de expresión génica de las diferencias individuales de las poblaciones de bulto entre las células se promediaron y perdió5. Por lo tanto, incapacidad para detectar variaciones de célula a célula en fracciones celulares heterogéneas puede confundir nuestra comprensión de los procesos biológicos críticos si pequeños subconjuntos de células responsables de la función biológica inferida población6, 7. Por el contrario, investigación de firmas de expresión génica en unicelulares resolución ofrecen la posibilidad a delinear la heterogeneidad y eludir influencias precede de subconjuntos excesivamente de la células8.
Hasta la fecha se han desarrollado muchos protocolos para análisis de expresión génica unicelular; cada enfoque tiene sus propias advertencias. El método más temprano fue el RNA fluorescente en situ hibridación RNA (peces), que mide un número limitado de las transcripciones a la vez, pero es el único que permite la investigación de localización de RNA9,11. Primeros métodos usando PCR y qPCR para detectar que una sola o muy pocas transcripciones fueron también desarrollaron12. Sin embargo, estos últimamente han sido sustituidos por métodos basados en microfluídica que pueden analizar simultáneamente la expresión de cientos de transcripciones por la célula en cientos de células mediante qPCR y así permiten la heterogeneidad multidimensional utilizando análisis predeterminado de10,de paneles de gen13. Recientemente las tecnologías basadas en la secuencia de RNA han convertido en ampliamente utilizadas para el análisis de la célula, ya que teóricamente pueden medir el transcriptoma completo de una célula y así añadir una dimensión exploratoria a heterogeneidad análisis10, 14. Análisis de qPCR de multiplexado y la secuencia de RNA unicelulares tienen características diferentes, así la justificación para el uso de cualquiera de los métodos depende de la pregunta así como el número de células en la población objetivo. El alto rendimiento y bajo costo por la célula con características imparciales, exploratorias de la secuencia de RNA unicelulares son deseables cuando investigan celular desconocido o grandes poblaciones. Sin embargo, la secuencia de RNA unicelular también está sesgada hacia alta abundantes transcripciones de secuenciación más con frecuencia mientras las transcripciones con baja abundancia son propensas a la deserción. Esto puede conducir a los datos considerablemente complejos que pone altas demandas en análisis Bioinformático para revelar importantes señales moleculares que son a menudo sutiles u ocultas en ruido técnica15. Así, para los tejidos bien caracterizados, unicelular qPCR utilizando análisis predeterminados paneles primer seleccionados para los genes funcionalmente importantes o marcadores moleculares pueden servir como un acercamiento sensible, simple para determinar la heterogeneidad de un población. Sin embargo, cabe señalar que, en comparación a unicelular RNA-seq, el costo por la célula es generalmente más alto para qPCR unicelular métodos. Aquí, describimos un acercamiento que combina unicelular RT-qPCR (modificado de Teles J., et al. 16), al índice de FACS clasificación simultáneamente17 y bioinformática análisis18 a fin de caracterizar la heterogeneidad molecular e immunophenotypic dentro de las poblaciones.
En este enfoque, la población de la célula de interés se tiñe, y solo las células se clasifican por FACS directamente en tampón de lisis en placas de PCR de 96 pocillos. Al mismo tiempo, los niveles de expresión de un conjunto de marcadores de superficie celular se registran para cada celda individual durante FACS-clasificación, un método que se conoce como índice de clasificación. Posteriormente se amplifica el material sometidas a lisis celular y la expresión génica de un conjunto seleccionado de genes analizados con RT-qPCR, utilizando una plataforma de microfluidos. Esta estrategia permite el análisis molecular de la caracterización ordenada unicelular como simultáneo de la expresión de marcadores de superficie celular de cada célula individual. Mediante la asignación directamente molecularmente diferentes subconjuntos de células a la expresión de los marcadores clasificados indexadas, las subpoblaciones pueden vincularse con un immunophenotype específico que puede utilizarse para su aislamiento prospectivo. El método se describe paso a paso en la figura 1. Un panel determinado gen adicional contribuye a una mayor resolución de la expresión de genes específicos, ya que elude la medición de genes abundantes irrelevantes que de lo contrario puede ocluir gene sutiles señales de expresión. Por otra parte, la amplificación de la Diana, transcripción reversa un paso y amplificación permite medición robusta de baja transcripciones expresadas, como factores de transcripción o RNAs poli-adenylated. Lo importante, qPCR métodos permiten medición de mRNA de las proteínas de fusión, que es importante la investigación de ciertas enfermedades malignas19. Por último, el número centrado de genes investigados, bajas tasas de abandono, y limitadas diferencias técnicas entre las células hacen este método fácilmente analizado compararon con métodos dimensionales más alta, como unicelular RNA-seq. Siguiendo el protocolo, puede realizarse un experimento todo, de la clasificación de las células a los resultados analizados, dentro de tres días, haciendo de este un método sencillo y rápido para análisis de expresión génica sola célula sensible, de alto rendimiento.

<table><tbody><tr><td>CD14 PECY5</td><td>eBioscience</td><td>15-0149-42</td><td>Clon: 61D3</td></tr><tr><td>CD16 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>302010</td><td>Clon: 3G8</td></tr><tr><td>CD56 PECY5 Biolegend</td><td></td><td>304608</td><td>Clon: MEM-188</td></tr><tr><td>CD19 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>302210</td><td>Clon: HIB19</td></tr><tr><td>CD2 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>300210</td><td>Clon: RPA-2.10</td></tr><tr><td>CD3 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>300310</td><td>Clon: HIT3a</td></tr><tr><td>CD123 PECY5 Biolegend</td><td></td><td>306008</td><td>Clon: 6H6</td></tr><tr><td>CD235A PECY5</td><td>BD Pharma</td><td>559944</td><td>Clon GAR2</td></tr><tr><td>CD34 FITC</td><td>Biolegend</td><td>343604</td><td>Clon: 561</td></tr><tr><td>CD38 APC</td><td>Biolegend</td><td>303510</td><td>Clon: Hit2</td></tr><tr><td>CD90 PE</td><td>Biolegend</td><td>328110</td><td>Clon: 5E10</td></tr><tr><td>CD45RA BV421</td><td>BD bioscience</td><td></td><td>560362 Clon: HI100</td></tr><tr><td>CD49f Pecy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0495-82</td><td>Clon: eBioGOH3</td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SV30160.3</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>HyClone</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Placa de fondo en U de 96 pocillos</td><td>VWR</td><td>10861-564</td><td></td></tr><tr><td>SFEM</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>9650</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina estreptomicina</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>FLT3L</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorph tubo</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>CST perlas</td><td>BD</td><td></td><td></td>642412</tr><tr><td>Accudrop Beads</td><td>BD 345249</td><td></td><td>6 &micro; m partículas&nbsp;</td></tr><tr><td>Película adhesiva Clear</td><td>Thermo scientific&nbsp;</td><td>AB-1170</td><td></td></tr><tr><td>Película adhesiva Lámina</td><td>Thermo scientific&nbsp;</td><td>AB-0626</td><td></td></tr><tr><td>Placa de PCR de 96 pocillos</td><td>Axygen</td><td>PCR-96M2-HS-C</td><td></td></tr><tr><td>PCR tubo de 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-L-C</td><td></td></tr><tr><td>T100 Ciclador de PCR</td><td>BioRad</td><td>186-1096</td><td></td></tr><tr><td>10% NP40</td><td>Termo científico&nbsp;</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP</td><td>Takara</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M TDT</td><td>Invitrogen</td><td>P2325</td><td></td></tr><tr><td>RNAsout</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td>Inhibidor de ARNasa</td></tr><tr><td>CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11753-100</td><td></td></tr><tr><td>Neuclease free water</td><td>Invitrogen</td><td>11753-100</td><td>de CellsDirect kit</td></tr><tr><td>2x Reaction Mix</td><td>Invitrogen</td><td>11753-100</td><td>de CellsDirect kit</td></tr><tr><td>SuperScript III RT/Platinum Taq Mix</td><td>Invitrogen</td><td>11753-100</td><td>de CellsDirect kit</td></tr><tr><td>Platinum&nbsp; Taq&nbsp; ADN polimerasa</td><td>Invitrogen</td><td>10966026</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Kit de control de células a CT</td><td>Invitrogen</td><td>4386995</td><td></td></tr><tr><td>Xeno RNA</td><td>Control Invitrogen</td><td>4386995</td><td>del kit de control de células a CT TaqMan</td></tr><tr><td>20x Xeno RNA Control Taqman Ensayo de expresión génica Invitrogen</td><td></td><td></td><td>4386995 del kit de control de células TaqMan a CT</td></tr><tr><td>96.96 Kit de muestra/carga&mdash; 10 IFCs</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M10-96.96</td><td></td></tr><tr><td>2x Ensayo Carga de Reactivo</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>de 96.96 Kit de Muestra/Carga</td></tr><tr><td>20x GE Reactivo de Carga de Muestras</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>de 96.96 Kit de Muestra/Carga Línea de</td></tr><tr><td>Control Fluid&nbsp;</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>de 96.96 Muestra/Cargando Kit</td></tr><tr><td>TaqMan Expresión Génica Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>BioMark HD</td><td>Fluidigm</td><td>BMKHD-BMKHD</td><td></td></tr><tr><td>96.96 Dynamic Array IFC</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M10-96.96GT</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>V10</td><td>TreeStar</td><td>TreeStar</td><td></td></tr><tr><td>Análisis PCR en tiempo real</td> de <td>Fluidigm Fluidigm</td><td>Fluidigm</td><td></td></tr><tr><td>CD179a.VPREB1</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00356766_g1</td><td></td></tr><tr><td>ACE</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00174179_m1</td><td></td></tr><tr><td>AHR</td><td>Thermofisher Hs00169233_m1 científico</td><td>BCR_ABL.52</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermofisher</td><td>Hs03043652_ft</td><td></td> científico</tr><tr><td>BCR_ABL41</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs03024541_ft</td><td></td></tr><tr><td>BMI1</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00995536_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCNA2</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00996788_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCNB1</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01030099_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCNB2</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01084593_g1</td><td></td></tr><tr><td>CCNC</td><td>Thermofisher</td><td>científico Hs01029304_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCNE1</td><td>Thermofisher</td><td>Hs01026535_g1</td><td></td></tr><tr><td>científico CCNF</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00171049_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCR9</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01890924_s1</td><td></td></tr><tr><td>CD10. MME</td><td>Thermofisher</td><td>científico Hs00153510_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD11a</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00158218_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD11c.ITAX</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00174217_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD123. IL3RA</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00608141_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD133. PROM1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01009250_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD151</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00911635_g1</td><td></td></tr><tr><td>CD220. INSR</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00961554_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD24. HSA</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs03044178_g1</td><td></td></tr><tr><td>NCOR1</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01094540_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD26. DPP4</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00175210_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD274</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01125301_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD276</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00987207_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD32. FCGR2B</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01634996_s1</td><td></td></tr><tr><td>CD33</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01076281_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD34</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00990732_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD344. FZD4</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00201853_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD352. SLAMF6</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01559920_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD38</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01120071_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD4</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01058407_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD41. ITGA2B</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01116228_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD49f.ITGA6</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01041011_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD56. NCAM1</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00941830_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD9</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00233521_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD97</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00173542_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD99</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00908458_m1</td><td></td></tr><tr><td>CDK6</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01026371_m1</td><td></td></tr><tr><td>CDKN1A</td><td>Thermofisher </td><td>científico Hs00355782_m1</td><td></td></tr><tr><td>CDKN1B</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01597588_m1</td><td></td></tr><tr><td>CDKN1C</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00175938_m1</td><td></td></tr><tr><td>CEBPa</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00269972_s1</td><td></td></tr><tr><td>CSF1r</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00911250_m1</td><td></td></tr><tr><td>CSF2RA</td><td>Thermofisher científico</td><td></td><td></td>Hs00531296_g1</tr><tr><td>CSF3RA</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01114427_m1</td><td></td></tr><tr><td>E2A. TCF3</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00413032_m1</td><td></td></tr><tr><td>EBF1</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01092694_m1</td><td></td></tr><tr><td>ENG</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00923996_m1</td><td></td></tr><tr><td>EPOR</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00959427_m1</td><td></td></tr><tr><td>ERG</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01554629_m1</td><td></td></tr><tr><td>FLI1</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00956711_m1</td><td></td></tr><tr><td>FLT3</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00174690_m1</td><td></td></tr><tr><td>FOXO1</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01054576_m1</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs02758991_g1</td><td></td></tr><tr><td>GATA1</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00231112_m1</td><td></td></tr><tr><td>GATA2</td><td>Thermofisher científico</td><td></td><td></td>Hs00231119_m1</tr><tr><td>GATA3</td><td>Thermofisher</td><td>científico Hs00231122_m1</td><td></td></tr><tr><td>GFI1</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00382207_m1</td><td></td></tr><tr><td>HES1</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01118947_g1</td><td></td></tr><tr><td>HLF</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00171406_m1</td><td></td></tr><tr><td>HMGA2</td><td>Thermofisher Hs00171569_m1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HOXA5</td><td>Thermofisher</td><td>científico Hs00430330_m1</td><td></td></tr><tr><td>HOXB4</td><td>Thermofisher Hs00256884_m1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>científico ID2</td><td>Thermofisher Hs04187239_m1 científico</td><td>IGF2BP1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermofisher</td><td>Hs00198023_m1</td><td></td></tr> científico <tr><td>IGF2BP2</td><td>Thermofisher Hs01118009_m1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IKZF1</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00172991_m1</td><td></td></tr><tr><td>IL1RAP</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00895050_m1</td><td></td></tr><tr><td>IL2RG</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00953624_m1</td><td></td></tr><tr><td>IRF8</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00175238_m1</td> ITGB7 Thermofisher científico Hs01565750_m1 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KIT</td><td>Thermofisher científico</td><td></td><td></td>Hs00174029_m1</tr><tr><td>Lin28B</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01013729_m1</td><td></td></tr><tr><td>LMO2</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00153473_m1</td><td></td></tr><tr><td>LYL1</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01089802_g1</td><td></td></tr><tr><td>Meis1</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01017441_m1</td><td></td></tr><tr><td>mKi67</td><td>Thermofisher Hs01032443_m1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MPL</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00180489_m1</td><td></td></tr><tr><td>MPO</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00924296_m1</td><td></td></tr><tr><td>NFIB</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01029175_m1</td><td></td></tr><tr><td>Notch1</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01062011_m1</td><td></td></tr><tr><td>Pten</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs02621230_s1</td><td></td></tr><tr><td>RAG2</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01851142_s1</td><td></td></tr><tr><td>RPS18</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01375212_g1</td><td></td></tr><tr><td>RUNX1</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00231079_m1</td><td></td></tr><tr><td>Shisa2</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01590823_m1</td><td></td></tr><tr><td>Spi1</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs02786711_m1</td><td></td></tr><tr><td>Estéril.IgH</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00378435_m1</td><td></td></tr><tr><td>TAL1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01097987_m1</td><td></td></tr><tr><td>THY1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00264235_s1</td><td></td></tr><tr><td>Tim.3.HAVCR2</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00958618_m1</td><td></td></tr><tr><td>VWF</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00169795_m1</td><td></td></tr></tbody></table>

una combinatoria unicelular enfoque para caracterizar molecular y heterogeneidad de immunophenotypic de madre humana y de las poblaciones progenitoras

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Immunophenotypic caracterización y análisis molecular han utilizado durante mucho tiempo heterogeneidad de delinear y definir poblaciones celulares distintas. FACS es inherentemente un sola célula ensayo, sin embargo antes de análisis molecular, las células diana se aíslan a menudo prospectivamente a granel, perdiendo resolución unicelular. Análisis de expresión génica sola célula proporciona un medio para entender las diferencias moleculares entre las células individuales en poblaciones celulares heterogéneas. En análisis de la célula a granel una sobrerrepresentación de un tipo de células distinto resultado sesgos y oclusiones de las señales de las células raras con importancia biológica. Utilizando FACS índice clasificación acoplada a análisis de expresión génica unicelular, poblaciones pueden ser investigadas sin pérdida de resolución unicelular aunque también se capturan las células con expresión de marcadores de superficie intermedia de la célula, permitiendo la evaluación de la importancia de la expresión del marcador de superficie continua. Aquí, describimos un acercamiento que combina unicelular transcripción reversa cuantitativa PCR (RT-qPCR) y FACS índice de clasificación para al mismo tiempo caracterizar molecular y heterogeneidad de immunophenotypic dentro de poblaciones celulares.
En contraste con los métodos de secuenciación de RNA unicelular, el uso de qPCR con amplificación específicos permite medidas robustas de transcripciones de baja abundancia con menos abandonos, mientras que no se confunde por cuestiones relacionadas con las variaciones de célula a célula en lectura profundidad. Por otra parte, directamente índice-clasificación individual-células en lisis de búfer este método, permite para que síntesis de cDNA y pre-amplificación específicos a realizar en un solo paso, así en cuanto a la correlación de firmas moleculares derivadas posteriormente con la superficie de la célula expresión del marcador. El enfoque descrito se ha desarrollado para investigar células hematopoyéticas de solo, pero también se han utilizado con éxito en otros tipos celulares.
En conclusión, el enfoque descrito en el presente documento permite medida sensible de la expresión del mRNA de un panel de genes previamente seleccionados con la posibilidad de desarrollar protocolos para el aislamiento posterior prospectivo de molecularmente diferentes subpoblaciones.

El protocolo descrito es rápido, fácilmente realizado y altamente confiable. Una descripción del montaje experimental se presenta en la figura 1. El conjunto del Protocolo, de separación de células individuales, amplificación del objetivo específico, las mediciones de expresión génica y análisis preliminar se puede realizar en tres días. Un ejemplo de los resultados analizados en forma de un mapa de calor que representa datos preliminares del análisis de la e...

A granel gene expresión medidas nube célula individual diferencias en poblaciones celulares heterogéneas. Aquí, describimos un protocolo para análisis de expresión génica e índice cómo sola célula clasificación de Florescence activa célula clasificación (FACS) puede combinarse para delinear la heterogeneidad y immunophenotypically caracterizar poblaciones celulares molecularmente distintos.

Una combinatoria unicelular enfoque para caracterizar Molecular y heterogeneidad de Immunophenotypic de madre humana y de las poblaciones progenitoras

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Este método puede responder preguntas clave en los campos de células madre y cáncer, como cómo se ve la heterogeneidad de las células madre y cómo se puede aislar la terapia en células cancerosas sensibles. La principal ventaja de este estudio es que combina un análisis de expresión génica unicelular técnicamente robusto junto con la vaccinosis para una mayor caracterización posterior de las subpoblaciones diana. Aunque este método se puede utilizar para investigar el cáncer y la heterogeneidad de las células madre, también puede dar información sobre el cebado genético y el potencial de linaje.Para comenzar el protocolo, en un banco libre de ARN/ADN, preparar suficiente tampón de lisis para 96 pozos con 10% extra mezclando 390 microlitros de agua libre de nucleasas, 17 microlitros de 10%NP-40, 2.8 microlitros 10 dNTP milimolar, 10 microlitros 0.1 molar TDT y 5.3 microlitros inhibidores RNAse. Vórtice y gire por el tubo. A continuación, distribuya cuatro microlitros de tampón de lelisis a cada pozo de una placa PCR de 96 pozos y selle las placas con película adhesiva.Gire hacia abajo las placas para recoger el líquido en la parte inferior. Mantenga las placas sobre hielo hasta que

a-combinatorial-single-cell-approach-to-characterize-molecular

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Un método para analizar la distribución de progenitores hematopoyéticos de médula ósea en citometría de flujo, así como para aislar eficazmente altamente purificadas células madre hematopoyéticas (HSC) se describe. El procedimiento de aislamiento se basa esencialmente en el enriquecimiento magnética de c-kit + células y células de clasificación para purificar las CMH para los estudios celulares y moleculares.

El análisis fenotípico y aislamiento de células madre hematopoyéticas murinas y progenitores comprometidos Lineage

Se necesita ensayo de expresión de un solo gen celular para comprender las heterogeneidades de células madre.

Perfiles de Células Madre Embrionarias Humanas individual por RT-PCR cuantitativa

Este protocolo describe la forma de evaluar la expresión de una gran variedad de genes a nivel clonal. Una sola célula de RT-qPCR produce resultados altamente fiables con una fuerte sensibilidad para cientos de muestras y los genes.

Una sola célula de la expresión génica utilizando multiplex RT-qPCR para caracterizar heterogeneidad de las poblaciones linfoides Raras

Hemos desarrollado un nuevo protocolo para estudiar la dinámica de la población heterocelular en respuesta a las perturbaciones. Este manuscrito describe una plataforma basada en imágenes que produce conjuntos de datos cuantitativos para la caracterización simultánea de múltiples fenotipos celulares de poblaciones heterocelulares de una manera robusta.

Discriminación y Caracterización de las Poblaciones Heterocelulares Usando Técnicas de Imagen Cuantitativa

Aquí presentamos la metodología para el análisis clonal de precursores de células madre hematopoyéticas durante el desarrollo embrionario de ratón. Combinación de índice de clasificación de las células de la región aorta-gónada-mesonefros embrionaria con cocultivo de células endoteliales y trasplante para caracterizar las propiedades fenotípicas y el potencial de engraftment de precursores hematopoyéticos individuales.

Análisis clonal de precursores de células madre hematopoyéticas embrionarias usando índice célula clasificación combinada con células endoteliales nicho cultura Co

Presentamos un método de citometría de flujo para identificar simultáneamente diferentes tipos de células recuperadas del cerebro del ratón o de la médula espinal. Este método podría ser explotado para aislar o caracterizar las poblaciones de células puras en enfermedades neurodegenerativas o para cuantificar el alcance de la orientación celular a la administración in vivo de vectores virales o nanopartículas.

Caracterización citométrica de flujo simultáneo de múltiples tipos de células recuperadas del cerebro del ratón/cordón espinal a través de diferentes métodos de homogeneización

Aquí se presenta una técnica basada en citometría de flujo que permite medir simultáneamente el número de divisiones celulares, el fenotipo celular superficial y el parentesco celular. Esas propiedades se pueden probar estadísticamente utilizando un marco basado en permutaciones.

Evaluación simultánea del parentesco, el número de división y el fenotipo mediante citometría de flujo para células madre y progenitoras hematopoyéticas

El éxito de la transcriptómica y multiómica de una sola célula/núcleo único depende en gran medida de la calidad de las células/núcleos. Por lo tanto, el aislamiento de células/núcleos de los tejidos y su purificación debe estar altamente estandarizado. Este protocolo describe la preparación de núcleos del cerebro y la médula ósea para el ensayo multioma de un solo núcleo aguas abajo.

Preparación de núcleos cerebrales y de médula ósea de alta calidad para ensayos multioma de núcleos individuales

Este protocolo describe el uso de la clasificación celular activada por fluorescencia de células madre mesenquimales humanas utilizando el método de clasificación de una sola célula. Específicamente, el uso de la clasificación de una sola célula puede lograr una pureza del 99% de las células inmunofenotipadas de una población heterogénea cuando se combina con un enfoque basado en citometría de flujo multiparamétrica.

Clasificación unicelular de células madre mesenquimales inmunofenotipadas de dientes deciduos exfoliados humanos

El protocolo aquí presentado permite la identificación y el análisis de alta dimensión de células madre y progenitoras musculares mediante citometría de masas unicelulares y su purificación por FACS para estudios en profundidad de su función. Este enfoque se puede aplicar para estudiar la dinámica de regeneración en modelos de enfermedad y probar la eficacia de las intervenciones farmacológicas.

Identificación y análisis de progenitores miogénicos in vivo durante la lesión aguda del músculo esquelético mediante citometría de masa unicelular de alta dimensión

Aquí presentamos protocolos que permiten el aislamiento de células estromales de hueso murino, médula ósea, timo y tejido tímico humano compatible con multiómicas unicelulares.

Aislamiento de células estromales de órganos hematopoyéticos

Aprende a caracterizar la heterogeneidad celular mediante análisis de expresión génica unicelular combinado con FACS. Este método permite aislar subpoblaciones específicas de células madre y cáncer para estudios funcionales detallados.

Una combinatoria unicelular enfoque para caracterizar Molecular y heterogeneidad de Immunophenotypic de madre humana y de las poblaciones progenitoras (Video) | JoVE Journal

Una combinatoria unicelular enfoque para caracterizar Molecular y heterogeneidad de Immunophenotypic de madre humana y de las poblaciones progenitoras

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