Expresión y purificación de los canales iónicos de mamíferos Bestrophin

Este método puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con la biofísica de los canales iónicos de los mamíferos, incluidos, entre otros, la familia de canales iónicos de la bestrofina. La principal ventaja de esta técnica es que se puede aplicar a otros tipos de canales iónicos y genera productos clave para varios ensayos in vitro posteriores. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de las bestrofinopatías, ya que los ensayos que utilizan la proteína purificada contribuyen a nuestro conocimiento de cómo funcionan los canales de bestrofina en la retina y cómo las mutaciones en el gen BEST1 causan la degeneración macular.

Veinticuatro horas antes de la infección viral, agregue un volumen igual de azul de tripano a una alícuota de 15 microlitros de cultivo celular HEK293F y verifique la densidad celular y la viabilidad usando un hemocitómetro bajo un microscopio. Después de realizar el recuento de células, coloque 0,6 veces 10 hasta la sexta célula por mililitro en un volumen de 500 mililitros en cada uno de los dos matraces desechables de dos litros. Coloque los matraces en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados con un 8% de dióxido de carbono.

Gire el cultivo en una plataforma orbital a 135 rpm. El día de la infección, comprobar la densidad celular y la viabilidad de una alícuota de 15 microlitros del cultivo como antes. Una alta viabilidad celular de más del 95% es esencial para una infección eficiente y la expresión de proteínas.

La densidad de células esperada es de aproximadamente una por 10 a la sexta celdas por mililitro y el número total esperado de células es aproximadamente una por 10 a nueve. Agregue el Baculovirus P3 a las células en una multiplicidad de infección de cinco. Para determinar la cantidad de virus a inocular, use la ecuación que se muestra en la pantalla.

A continuación, incubar las células inoculadas durante 24 horas. Veinticuatro horas después, agregue butirato de sodio a una concentración final de 10 milimolares a cada cultivo celular y regrese a la incubadora establecida a 37 grados Celsius o 30 grados Celsius durante 48 horas. Cuarenta y ocho horas después, compruebe el porcentaje y el brillo de las células verdes que representan directamente la proteína bajo un microscopio de fluorescencia.

Recolectar las células centrifugando a 1.000 veces g a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos celulares con solución salina tamponada con fosfato hasta un volumen final de aproximadamente 80 mililitros. Divida cada suspensión de celda entre dos tubos cónicos de 50 mililitros y centrifugue durante 20 minutos a 1.000 veces g y cuatro grados centígrados.

Para comenzar el procedimiento de purificación de proteínas, primero descongele los gránulos celulares en un baño de agua agitadora a temperatura ambiente. Cuando los gránulos se descongelen después de 10 a 15 minutos, vuelva a suspender las células en el doble del volumen de tampón A suplementado con inhibidores de la proteinasa. Pipetear hacia arriba y hacia abajo extensivamente para obtener una suspensión celular homogénea.

Lisar las células con un homogeneizador de alta presión. Pase la suspensión de la célula a través del homogeneizador de siete a 10 megapascales tres o cuatro veces para lograr una homogeneización completa. Mantenga el lisado celular en hielo durante dos o tres minutos entre rondas.

Agregue detergente al lisado de celdas. Incubar con agitación durante una hora a 20 grados centígrados para extraer las proteínas de la membrana. Después de la incubación, centrifugar el lisado celular a 150.000 veces g en una ultracentrífuga a cuatro grados centígrados durante una hora.

Después de la centrifugación, el lisado de células claras se intercalará entre el gránulo en la parte inferior y una capa turbia en la parte superior. Utilice una pipeta de transferencia de 10 mililitros para recoger cuidadosamente el lisado transparente y, a continuación, cambie a una pipeta de un mililitro para los últimos mililitros de lisado. Aplique el lisado a una columna de afinidad NTA de níquel HisTrap de cinco mililitros preequilibrada con tampón A. A continuación, lave la columna con 25 mililitros de tampón B seguidos de 40 mililitros de tampón C. El protocolo se puede pausar aquí.

La proteína permanecerá estable mientras esté unida a la columna durante la noche. Después del lavado, conecte la columna a un sistema de cromatografía líquida rápida de proteínas y diluya la proteína de la columna con 13 mililitros de tampón D con fraccionamiento. Recoja las fracciones enriquecidas con proteínas de acuerdo con la lectura de absorbancia UV.

Mida la concentración del producto proteico eluido en un espectrofotómetro de microvolumen leyendo la absorbancia a 280 nanómetros. Para eliminar la etiqueta GFP10x his, agregue la proteasa TEV en una proporción de masa de uno a uno e incube a cuatro grados Celsius durante 30 minutos. Concentre la proteína en un volumen final de 400 a 500 microlitros con una unidad de filtro centrífugo de 15 mililitros girando a 4.000 veces g en una centrífuga de cuatro grados Celsius a intervalos variables a partir de 10 minutos.

Transfiera la proteína concentrada a un tubo limpio de 1,5 mililitros y elimine cualquier precipitado o burbuja del producto concentrado. Centrifugar a 12.000 veces g durante cinco a 10 minutos a cuatro grados centígrados, luego transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Utilice una jeringa de un mililitro y una aguja de punta redonda para cargar el producto final en un sistema FPLC para cromatografía de exclusión por tamaño con una columna de exclusión por tamaño preequilibrada con tampón E. Las proteínas de buen comportamiento se ejecutan como un solo pico.

Recoge la fracción de proteína o las fracciones múltiples que corresponden a ese pico. Concentre la proteína con una unidad de filtro centrífugo de cuatro mililitros o 0,5 mililitros del mismo límite de peso molecular que se utilizó anteriormente. Centrifugar a 4.000 veces g a cuatro grados centígrados hasta una concentración final de cinco a 10 microgramos por microlitro.

Utilice el espectrofotómetro para comprobar la concentración del producto final. La intensidad de fluorescencia observada en las células adhesivas HEK293 transfectadas transitoriamente que se ven aquí es un buen indicador del nivel de expresión de proteínas proyectado en las células HEK293F suspendidas que se muestran aquí. Una purificación exitosa se indica mediante un solo pico principal en el volumen de dilución esperado en la cromatografía de exclusión por tamaño y una sola banda dominante en un gel de página SDS desnaturalizado.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener todo en hielo durante la purificación y, si realiza varias purificaciones al mismo tiempo, cambie los guantes con frecuencia y asegúrese de no contaminar las muestras. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la cristalografía de rayos X y los ensayos de bicapa lipídica para responder a preguntas importantes como las relaciones entre estructura y función. Tras su desarrollo, esta técnica abrió el camino para que los investigadores en el campo de las enfermedades hereditarias de la retina exploraran las causas de las bestrofinopatías a nivel molecular.