Name: Ensayo de co-inmunoprecipitación utilizando proteínas nucleares endógenas de las células cultivadas bajo condiciones hipóxicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprende co-inmunoprecipitación de proteínas nucleares endógenas en células HEK293A bajo hipoxia. Este método permite estudiar interacciones entre factores de transcripción y correguladores en condiciones de bajo oxígeno.

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Agradecemos a Prof. Asoc. pecado Tiong Ong para el uso de la plataforma de la hipoxia. Este trabajo fue apoyado por el siguiente: Singapur Ministerio de educación, Ministerio de educación 1T1-02/04 y MOE2015-T2-2-087 (a Y.A.), Lee Kong Chian Facultad de medicina, concesión de la puesta en marcha de la Universidad Tecnológica de Nanyang M4230003 (a P.O.B.), el Consejo de investigación sueco, la Fundación familiar de Erling Persson, la Fundación de Novo Nordisk, la Fundación af Fundación de Quito, la Asociación Sueca de la Diabetes, la compañía de seguros de Scandia, la investigación de la Diabetes y Wellness Foundation, Fundación de litera von Kantzow, el Programa de investigación estratégica en Diabetes en el Instituto Karolinska, la ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage y el Knut y Alice Wallenberg Foundation.

Esta sección del Protocolo, que utiliza el riñón embrionario humano 293A celular (HEK293A), s sigue las directrices del Comité de ética de investigación en la Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur.
1. inducción de hipoxia en las células HEK293A
<ol><li>Preparar cuatro platos de 10 cm y la semilla 3 – 5 x 10 células de6 HEK293A por plato en 10 mL Dulbecco modificado suplementado Eagle (DMEM, glucosa de 4.5 g/L) con 10% suero bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 110 mg/L, 100 U/mL de penicilina y 100 mg / estreptomicina de mL. Las células a 37 ° C, 5% CO2 incubadora de la cultura. Nota: Celular siembra debe realizarse en un gabinete de la seguridad biológica (BSC). Las superficies de todos los materiales a ser colocados en el BSC se deben limpiar con etanol al 70%.</li>
	<li>24 h después de la siembra, cuando las células han alcanzado 80-90% de confluencia, poner dos platos en el subchamber de la hipoxia en la guantera de la incubadora (véase Tabla de materiales) con 1% O2 y 5% CO2 a 37 ° C y mantener los otros dos platos en normoxia (21% O 2, 5% CO2 a 37 ° C) para h. 4 Utilice un conjunto de células hipóxicas y normoxic para evaluar el tratamiento de la hipoxia por western blot y utilizar el otro conjunto de células para los experimentos de co-inmunoprecipitación. Nota: Los niveles de oxígeno se pueden establecer a 0 – 5% y la duración del tratamiento de la hipoxia puede variar dependiendo del tipo de célula y objetivo de estudio.</li>
</ol>2. toda célula y extracción Nuclear
Nota: Ver tabla 1 para obtener información sobre los tampones utilizados en el presente Protocolo.
<ol><li>
Cosechar las células de control de normoxia.
	<ol>
<li>Quitar los medios de cultivo por aspiración y lavar las células con 10 mL DPBS (PH 7.0 – 7.2) usando una pipeta de 10 mL. Nota: Evite tocar la monocapa de células con la pipeta. Durante el lavado, pipetee suavemente la DPBS abajo la pared de la placa de cultivo celular para evitar la pérdida de la célula.</li>
		<li>Pipetear 5 mL DPBS helada en la placa y raspe las células de la superficie de la placa en PBS helado con un raspador celular.</li>
		<li>La suspensión de células de transferencia en tubos cónicos de 15 mL y conservar en hielo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cosecha de las células cultivadas bajo condiciones hipóxicas.
	<ol>
<li>Equilibre la DPBS a condiciones hipóxicas colocando una destapado 100 mL experimento botella reactiva de cristal llenada de DPBS en la subchamber de la hipoxia (1% O2 y 5% CO2 a 37 ° C) durante 24 h de antelación.</li>
		<li>Aproximadamente 1 h antes de la cosecha de las células tratada la hipoxia, coloque una caja de hielo con hielo en la cámara de procesamiento de la guantera, que ha sido equilibrada al 1% O2 y 5% CO2. Transferir al frasco que contiene la DPBS hipóxico previamente equilibrado de la subchamber de la hipoxia a la cámara de procesamiento y coloque en hielo.</li>
		<li>4 h después del tratamiento de la hipoxia, transferir las células de la subchamber de la hipoxia a la cámara de procesamiento que ha sido previamente equilibrada al 1% O2 y 5% CO2.</li>
		<li>Quitar los medios de cultivo por aspiración y enjuague las células una vez con 10 mL pipeta heladas previamente equilibrados DPBS hipóxicos con 10 mL.</li>
		<li>Añadir 5 mL DPBS heladas previamente equilibradas con 5 mL pipeta y desalojar a las células por raspado con una espátula de la célula.</li>
		<li>Inclinación de la placa de cultivo celular y recoger las células separadas con una pipeta de 10 mL. Transferir la suspensión de células en DPBS en tubos cónicos de 15 mL y conservar en hielo.</li>
		<li>Abrir la puerta entre las cámaras de procesamiento y memoria intermedia de la guantera, los cuales han sido previamente equilibrados 1% O2 y 5% CO2. Transferir los tubos cónicos de 15 mL en hielo que contiene células de hipoxia tratada de la cámara de procesamiento a la cámara de amortiguamiento. Abra la puerta de la cámara de amortiguamiento y eliminar completamente las células de la guantera.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tanto las células normoxic de 2.1 y las células hipóxicas de 2.2 de pellets por centrifugación a 1.000 x g durante 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>
Preparar la célula entera extractos.
	<ol>
<li>Resuspender el pellet celular en 500 μl de tampón de lisis de ensayo (RIPA) helada radio inmunoprecipitación que contiene 50 mM pH Trisaminomethane clorhidrato (Tris-HCl) 8.0, 150 mM cloruro de sodio (NaCl), 1% tipo de tergitol NP-40 (NP-40), desoxicolato de sodio 0,5%, y 0.1% sodio dodecil sulfato (SDS), complementado con 1 x inhibidor de la proteasa cóctel (véase Tabla de materiales) transfiriendo los pellets de células arriba y abajo varias veces.</li>
		<li>Transfiera los lysates de la célula a nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y mantener en hielo durante 30 minutos con Vortex ocasional.</li>
		<li>Centrifugue los lysates de la célula a 13.000 x g por 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Recoger el sobrenadante, alícuota 50 μl del sobrenadante en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y guardar a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparar los extractos nucleares usando una extracción nuclear kit (véase tabla de materiales).
	<ol>
<li>Suavemente, Resuspender el pellet celular en 500 μl de tampón de lisis NL complementado con 1 x inhibidor de la proteasa cóctel y 0.1 M de Ditiotreitol (DTT) transfiriendo los pellets de células arriba y abajo varias veces.</li>
		<li>Añadir 25 μl de una solución de detergente NP a la suspensión de la célula y vortex durante 10 s a velocidad máxima.</li>
		<li>Centrifugar a 10.000 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Recoger el sobrenadante (extractos citoplasmáticos), alícuota de 50 μl del sobrenadante en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y almacenar a-80 ° C.</li>
		<li>Resuspender el precipitado que contiene los núcleos de célula en 500 μl de tampón de lisis NL complementado con 1 x inhibidor de la proteasa cóctel y 0,1 M TDT con un vórtex durante 5 s a velocidad máxima.</li>
		<li>Centrifugar a 10.000 x g durante 5 min a 4 ° C y guardar el pellet nuclear.</li>
		<li>Resuspender el pellet nuclear en 50 μl de tampón de extracción NX1 complementado con 1 x inhibidor de la proteasa cóctel transfiriendo el diábolo hacia arriba y abajo varias veces.</li>
		<li>Incubar durante 30 min en hielo, mezcla en Vortex por 10 seg cada 5 min a velocidad máxima.</li>
		<li>Centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Desalar los extractos nucleares.
	<ol>
<li>Recoger el sobrenadante del paso 2.5.9 y transferencia en los dispositivos de diálisis mini con un volumen máximo de 100 μl por unidad.</li>
		<li>Los dispositivos de diálisis mini del casquillo y colocarlos en un dispositivo de flotación.</li>
		<li>Coloque el dispositivo de la flotación en un vaso de precipitados que contenga 500 mL de buffer de diálisis previamente enfriada (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 20% glicerol, 100 mM de cloruro potásico (KCl), 0,2 mM dihidratada del ácido (EDTA), 0,2 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF) y 0,5 mM DTT) e incubar durante 30 min a 4 ° C con agitación suave. PRECAUCIÓN: PMSF es peligroso. Evitar el contacto directo con la piel o inhalación.</li>
		<li>Recolectar las muestras de la esquina de los dispositivos de diálisis mini y transfiera a nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C, alícuota 25 μl de cada sobrenadante en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y guardar a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. evaluación del tratamiento de la hipoxia por la detección de la expresión de la proteína y la localización subcelular de HIF-1α
<ol><li>Determinar la concentración de proteína de la célula entera o extractos nuclear citoplasmática usando el ensayo de microplacas bicinchoninic ácido (BCA) proteína análisis kit según el las instrucciones18 fabricante.</li>
	<li>Diluir los lysates de la célula en tampón x Laemmli 1 que contiene 5% 2-Mercaptoetanol y hierve a 95 ° C durante 5 minutos. PRECAUCIÓN: No toque la superficie del bloque de calefacción, ya que puede provocar quemaduras.</li>
	<li>
Separar las proteínas por electroforesis en gel de poliacrilamida sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE).
	<ol>
<li>De carga iguales cantidades de proteína (25 μg) en cada pocillo de un geles de SDS-PAGE prefabricado gradiente (4 – 20%), junto con 3 μl del marcador de peso molecular.</li>
		<li>Correr el gel tampón que contiene 2,5 mM Tris, glicina de 19,2 mM, 0.01% SDS, PH8.3 durante 30 min a 200 V de corriente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transferencia de las proteínas desde el gel a la membrana de nitrocelulosa.
	<ol>
<li>Montar el sándwich de transferencia (papel de filtro de membrana de papel de filtro gel) con el gel en el lado del ánodo y la membrana del lado del cátodo del cassette.</li>
		<li>Coloque el cartucho en el tanque de la transferencia con el tampón de transferencia que contiene 2,5 mM trisaminomethane (Tris), glicina 19,2 mM y 20% de metanol. PRECAUCIÓN: El metanol es inflamable y debe guardarse en el almacenamiento de líquidos inflamable gabinete.</li>
		<li>Llevar a cabo la transferencia por 1 h a 100 V en la cámara fría.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bloquear el blot en 10 mL de tampón de bloqueo que contiene 50 mM de Tris-Cl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0,1 leche descremada de Tween 20 y 5% durante 1 h a temperatura ambiente en un agitador.</li>
	<li>Incubar el blot con anticuerpos anti-HIF-1α (dilución 1/500) en el mismo tampón de bloqueo durante la noche a 4 ° C.</li>
	<li>Lave la mancha 3 veces durante 5 min cada vez con 50 mL de TBS-T.</li>
	<li>Incubar el blot con peroxidasa de rábano (HRP)-anticuerpo secundario conjugado (dilución al 1/1.000) en leche 10 mL de TBS-T que contiene 5% sin grasa durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave la mancha 3 veces durante 5 min cada vez con 50 mL de TBS-T.</li>
	<li>Mezcla 500 μl cada una de mayor chemilumescent (ECL) Reactivo A y B en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y agitar brevemente.</li>
	<li>El sustrato de la ECL se aplican a la mancha e incubar durante 1 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>
Captura las señales quimioluminiscencia utilizando un dispositivo de carga acoplada (CCD) sistema de imagen basado en cámaras.
	<ol>
<li>Escurrir exceso sustrato ECL tocando el borde de la membrana con un papel y colocar la membrana en un protector de hoja.</li>
		<li>Coloque la membrana sobre la bandeja de muestra de la CCD sistema de imagen basado en cámaras.</li>
		<li>Inicie el software de procesamiento de imagen (véase Tabla de materiales) y capturar las imágenes con las siguientes opciones: archivo → nuevo protocolo → canal → configuración de protocolo → Gel la proyección de imagen (aplicación: Chemi; Proyección de imagen de área: Gel listo Bio-Rad; Exposición de imágenes: El software optimizará automáticamente el tiempo de exposición para las bandas intensas) protocolo de funcionamiento → Nota: El tiempo de exposición puede ser ajustado manualmente para lograr las imágenes óptimas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. inmunoprecipitación y la detección de las proteínas Immunoprecipitated
<ol><li>Lavar 50 μl de bolas de proteína A/g sepharose en 500 μl de tampón TBS en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y los granos de pellets por centrifugación a 3.000 x g durante 2 min a 4 ° C.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y resuspender los granos en 100 μl de tampón TBS.</li>
	<li>Añadir 2 μl de anticuerpo monoclonal anti-ARNT de ratón (1,4 mg/mL) o el ratón de la inmunoglobulina G (IgG) (1,4 mg/mL) que fue preparado por reconstitución ratón 0,7 mg IgG en 500 μl de tampón TBS.</li>
	<li>Coloque los tubos de microcentrífuga de 1,5 mL con los granos en un tubo de los rotadores e incubar por 2 h a 10 rpm en la cámara fría. Nota: Manejar los tubos suavemente y mantenga la suspensión que contiene los granos en la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Los granos de pellets por centrifugación a 3.000 x g durante 2 min a 4 ° C y descartar el sobrenadante.</li>
	<li>Diluir 200 μg de la proteína nuclear lisada obtenida en paso 2.6.5 en 800 μl del buffer IP consistente en 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 180 mM NaCl, 20% glicerol, inhibidor de la proteasa de 0.2% NP-40 y 1 x cóctel. Incubar el lisado con los granos de acoplamiento de anticuerpos obtenidos en el paso 4.5 durante la noche a 4 ° C.</li>
	<li>Los granos de pellets por centrifugación a 3.000 x g durante 2 min a 4 ° C, desechar el sobrenadante y lavar los granos 3 veces con 1 mL cucharadas helado que contiene 0.2% NP-40.</li>
	<li>Hervir los granos en 50 μl Laemmli Solución tampón de muestra a 95 ° C durante 5 minutos.</li>
	<li>Centrifugue los granos a 10.000 x g por 5 min a 4 ° C, recoger el sobrenadante y desechar los granos. Nota: El sobrenadante puede almacenarse a 4 ° C a corto plazo o a-20 ° C a largo plazo.</li>
	<li>Detectar la presencia de HIF-1α de los complejos de proteína immunoprecipitated por western blot como se describió anteriormente en el paso 3.3 adelante. Nota: La cuantificación de proteína no es necesaria para este paso. Carga de volumen completo (50 μL) del sobrenadante de cada muestra en cada pocillo de una geles gradiente (4 – 20%) de SDS-PAGE prefabricado</li>
</ol>

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<li>Dumetz, A. C., Snellinger-O'brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+protein+protein+interactions+in+salt+solutions+and+implications+for+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization.</a> Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).</li>
<li>Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+endothelial+cell+glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase+expression+by+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia.</a> J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).</li>
<li>Caradec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desperate+house+genes%27%3A+The+dramatic+example+of+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia.</a> Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).</li>
</ol>

Los autores no declaran conflictos de interés.

El complejo de HIF-1 es un regulador principal de la homeostasis del oxígeno celular y regula una gran cantidad de genes implicados en diferentes respuestas de adaptación celulares a la hipoxia. Identificación de nuevas proteínas interactuantes de HIF-1 es importante para la comprensión del transduction de la señal hipóxica. Experimentos de co-inmunoprecipitación se utilizan comúnmente para los estudios de IBP para delinear vías de transducción de señal celular. Sin embargo, la sobreexpresión de la proteína sigue siendo ...

La hipoxia ocurre cuando falta oxígeno se suministra a las células y tejidos del cuerpo. Juega un papel fundamental en diversos procesos fisiológicos y patológicos como la diferenciación de la célula de vástago, inflamación y cáncer1,2. Factores inducible por la hipoxia (HIFs) funcionan como heterodímeros, compuesto por una subunidad α regulados por el oxígeno y una subunidad β constitutivamente expresada también conocido como ARNT3. Hasta la fecha se han identificado tres isoformas de las subunidades de HIF-α (HIF-1α, 2α HIF y HIF-3α) y tres subunidades β HIF (HIF/ARNT-1β, ARNT2 y ARNT3). HIF-1α y ARNT se expresan ubicuamente, mientras que HIF-2α, 3α HIF, ARNT2 y ARNT3 tienen más restringido de patrones de expresión4. El complejo de la proteína HIF-1 es el regulador clave de la respuesta de la hipoxia. Bajo condiciones de hipoxia, HIF-1α se convierte estabilizado, transloca al núcleo y dimerizes con ARNT5. Posteriormente, este complejo se une a nucleótidos específicos conocidos como elementos sensibles de la hipoxia (HREs) y regula la expresión de genes diana implicados en diversos procesos como angiogénesis, eritropoyesis y glucólisis6. Además de esta respuesta "canónica", la vía de señalización de hipoxia también es conocida por interferencia con la respuesta celular múltiples vías como la muesca y Nuclear Factor kappa B (NF-κB) de señalización7,8,9.
La identificación de proteínas interactuantes novela HIF-1 es importante para una mejor comprensión de la vía de señalización de la hipoxia. A diferencia de ARNT, que es insensible a los niveles de oxígeno y constitutivamente expresada, los niveles de la proteína HIF-1α están estrictamente regulados por los niveles de oxígeno celular. En normoxia (21% de oxígeno), HIF-1α proteínas son rápidamente degradadas10,11. La vida media corta de HIF-1α en normoxia presenta desafíos técnicos específicos para la detección de la proteína de extractos celulares, así como para la identificación de proteínas HIF-1α-que obran recíprocamente. Además, varios factores de transcripción, incluyendo aquellos del complejo HIF-1 se translocan a núcleo bajo condiciones hipóxicas12,13,14. La mayoría de los métodos actuales utilizados para estudios PPI se realiza utilizando no-fisiológico sobreexpresión de las proteínas. Dicha sobreexpresión de la proteína se ha divulgado para causar defectos celulares diferentes a través de múltiples mecanismos incluyendo sobrecarga de recursos, desequilibrio estequiométrica, interacciones promiscuas y vía modulación15,16. En cuanto a estudios PPI, sobreexpresión de la proteína puede llevar a falsos negativos positivos o incluso falsa, resultados, dependiendo de las propiedades de la proteína y las funciones de las proteínas sobreexpresadas. Por lo tanto, los métodos actuales para estudios de IBP debe ser modificado con el fin de revelar el IBP fisiológicamente relevantes bajo condiciones hipóxicas. Previamente hemos demostrado la interacción de HIF-1 y el factor de transcripción familia Ets GA-proteína de unión (GABP) en las células P19 hipóxicas, que contribuye a la respuesta del promotor Hes1 a hipoxia17. Aquí, describimos un protocolo de co-inmunoprecipitación estudio IBP entre proteínas endógenas nucleares bajo condiciones hipóxicas. La interacción de HIF-1α y ARNT se muestra como una prueba de concepto. Este protocolo es adecuado para demostrar las interacciones entre los factores de transcripción reguladores transcripcionales Co bajo condiciones hipóxicas, incluyendo pero no limitado a la identificación de proteínas interactuantes de HIF-1.

<table><tbody><tr><td><Material>fuerte</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.0 M Tampón Tris-HCl, pH 7.4&nbsp;</td><td>1ª BASE</td><td>1415</td><td></td></tr><tr><td>Proteína A/G Perlas de Sefarosa</td><td>Abcam</td><td>ab193262</td><td></td></tr><tr><td>Proteína IgG natural de ratón</td><td>Abcam</td><td>ab198772</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio-Rad</td><td>1610729</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Tampón</td><td>de muestra Bio-Rad 1610737</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocelulosa Membrana &nbsp; &nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueador de grado secante</td><td>Bio-Rad</td><td>1706404</td><td>Leche en polvo descremada para aplicaciones de Western Blot</td></tr><tr><td>10x Solución salina tamponada Tris (TBS)</td><td>Bio-Rad</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>10% Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>1610781</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine Buffer&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610771</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Patrones de color duales</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Anti-conejo IgG, Anticuerpo ligado a HRP</td><td>Señalización</td> celular <td>7074</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón IgG, Anticuerpo ligado a HRP&nbsp;</td><td>Señalización celular</td><td>7076</td><td></td></tr><tr><td>SignalFire ECL</td><td>Reactivo Señalización celular</td><td>6883</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)</td><td>Merck Millipore</td><td>52332</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo ARNT/HIF-1 beta&nbsp;</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-124&nbsp;</td><td>Concentración: 1.4 mg/mL</td></tr><tr><td>Anticuerpo HIF-1 alfa</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-479</td><td>Concentración: 1,0 mg/mL</td></tr><tr><td>YY1 Anticuerpo</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-46218</td><td>Concentración: 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>Qproteome Nuclear Protein Kit</td><td>Qiagen</td><td>37582</td><td>Tampón de lisis NL y tampón de extracción NX1 se proporcionan en el kit</td></tr><tr><td>GAPDH Anticuerpo</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-47724</td><td>Concentración: 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>Glicerol (&ge; 99%)</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Tampón RIPA</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>127087-87-0</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' Águila modificada' s medio (DMEM, 4,5 g/L de glucosa)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>línea celular HEK293A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>Metanol&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Tabletas inhibidoras de la proteasa&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88660</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>QSP punta de carga de gel&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>QSP#010-R204-Q-PK</td><td>1-200 uL</td></tr><tr><td>Equipment/Instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thick Blot Paper, Precortado, 7,5 x 10 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&nbsp; Célula de electroforesis vertical Tetra para mini geles prefabricados, con Mini Trans-Blot&nbsp; módulo y fuente de alimentación básica PowerPac</td><td>Bio-Rad</td><td>1658034</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 15% Mini-PROTEAN TGX Geles de proteínas prefabricadas</td><td>Bio-Rad</td><td>4561083</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+ System</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>I-Glove</td><td>BioSpherix</td><td>I-Glove</td><td></td></tr><tr><td>Synergy HTX Lector de microplacas multimodo&nbsp;</td><td>BioTek</td><td>BTS1LFTA</td><td></td></tr><tr><td>Costar 5mL Stripette Pipetas Serológicas</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>Costar 10mL Stripette Pipetas Serológicas</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Costar 25mL Stripette Pipetas Serológicas</td><td>Corning</td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96-Pocillos Fondo Transparente Microplacas de Poliestireno Negro</td><td>Corning</td><td>3631</td><td></td></tr><tr><td>15mL de Alto Tubos de centrífuga cónicos Clarity PP</td><td>Corning</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de celda pequeña</td><td>Corning</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Gilson &nbsp; Kit de 4 pipetas Pipetman L&nbsp;</td><td>Gilson</td><td></td><td>F167370 P2, P20, P200, P1000 y accesorios</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 ml</td><td>Greiner Bio-One&nbsp;</td><td></td><td></td>616201</tr><tr><td>PIPETBOY acu 2 Pipeta</td><td>INTEGRA Biosciences</td><td>155 000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gabinetes de almacenamiento de líquidos inflamables Justrite</td><td>Justrite Manufacturing Co.</td><td>896000</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice</td><td>Labnet</td><td>S0200</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>NuAire</td><td>NU-5820</td><td></td></tr><tr><td>Agitadores orbitales</td><td>Stuart</td><td>SSL1</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de tubo SB3 Stuart</td><td></td><td>SB3</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 21R Microcentrífuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002470</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 16 Centrífuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004240</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos (100 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer MINI Dispositivo de diálisis</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69580</td><td>10K MWCO, boyas flotantes de 0,1 mL</td></tr><tr><td>para dispositivos de diálisis Slide-A-Lyzer MINI de 0,1 ml Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>69588</td><td></td></tr><tr><td>LSE Calentadores de baño seco digitales Thermo</td><td>Fisher Científico</td><td>1168H25</td><td></td></tr><tr><td>Termo Científico&nbsp; Serie 1300 A2 Clase II, Tipo A2 Cabinas de bioseguridad</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-261-308</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Lab Software</td><td>Bio-Rad</td><td>1709691</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo de co-inmunoprecipitación utilizando proteínas nucleares endógenas de las células cultivadas bajo condiciones hipóxicas

Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

Niveles bajos de oxígeno (hipoxia) accionar una variedad de respuestas adaptativas con el factor inducible por hipoxia 1 (HIF-1) complejo actuando como regulador maestro. HIF-1 se compone de una subunidad α regulados por oxígeno de heterodiméricos (HIF-1α) y expresa constitutivamente la subunidad β (HIF-1β) también conocido como aril hidrocarburo del receptor nuclear translocador (ARNT), regulación de genes implicados en diversos procesos como angiogénesis , eritropoyesis y glucólisis. La identificación de proteínas interactuantes de HIF-1 es clave para la comprensión de la vía de señalización de la hipoxia. Además de la regulación de la estabilidad de HIF-1α, hipoxia desencadena también la translocación nuclear de los muchos factores de transcripción, incluyendo HIF-1α y ARNT. En particular, la mayoría de los métodos actuales utilizados para el estudio de tales interacciones proteína-proteína (IBP) se basa en sistemas donde los niveles de proteínas se incrementan artificialmente a través de la sobreexpresión de la proteína. Sobreexpresión de la proteína a menudo conduce a resultados no fisiológicos derivados de artefactos temporales y espaciales. Aquí describimos una co-inmunoprecipitación modificada protocolo después del tratamiento de la hipoxia con proteínas nucleares endógenas y como una prueba de concepto, para mostrar la interacción entre HIF-1α y ARNT. En el presente Protocolo, las células hipóxicas se cosecharon bajo condiciones hipóxicas y tampón de lavado de Dulbecco Phosphate-Buffered salina (DPBS) también fue previamente equilibrado a condiciones hipóxicas antes de su uso para mitigar la degradación de la proteína o complejo de la proteína disociación en reoxygenation. Además, las fracciones nucleares se extrajeron posteriormente para concentrar y estabilizar proteínas nucleares endógenas y evitar resultados falsos a menudo vistos en la sobreexpresión de la proteína. Este protocolo puede utilizarse para demostrar interacciones endógenas y nativas entre los factores de transcripción reguladores transcripcionales Co bajo condiciones hipóxicas.

Para evaluar la respuesta celular a la hipoxia, la expresión se examinaron los niveles y la localización subcelular de los componentes de tratamiento complejo de hipoxia siguiente de HIF-1. HEK293A las células fueron cultivadas bajo condiciones hipóxicas durante 4 h o guardado en normoxia como controles. Niveles de la proteína HIF-1α y ARNT se examinaron en células completas o extractos nuclear citoplasmática por western blot. Como los niveles de HIF-1α esperados, total eran upregulated p...

Aquí se describe un protocolo de co-inmunoprecipitación para estudiar interacciones de proteínas entre las proteínas nucleares endógenas bajo condiciones hipóxicas. Este método es conveniente para la demostración de las interacciones entre los factores de transcripción reguladores Co transcripcionales a hipoxia.

Ensayo de co-inmunoprecipitación utilizando proteínas nucleares endógenas de las células cultivadas bajo condiciones hipóxicas

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo hipóxico, como las interacciones endógenas y nativas entre los factores de transcripción y sus coreguladores transcripcionales en condiciones hipóxicas. La principal ventaja de esta técnica es que las células hipóxicas se recolectan en condiciones hipóxicas y las fracciones nucleares se utilizan para la coinmunoprecipitación. Este protocolo utiliza células embrionarias humanas de riñón 293A cultivadas en cuatro placas de 10 centímetros.Siembre de tres a cinco veces 10 a la sexta celdas por placa en 10 mililitros del medio Eagle modificado de Dulbeco suplementado con 10% de FBS, L-glutamina, piruvato de sodio, penicilina y estreptomicina. Cultive las células en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados. Veinticuatro horas después de la siembra, cuando las células hayan alcanzado un 80 a 90% de confluencia, coloque dos placas en la subcámara de hipoxia en la guantera de la incubadora con 1% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante cuatro horas.Mantenga los otros dos platos en normoxia. El día antes de recolectar las células tratadas con hipoxia, preequilibre DPBS a condi

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Investigación

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Biology

Biología

Aquí proponemos métodos sencillos para inducir la hipoxia en cultivos de células y pruebas sencillas para evaluar el estado de hipoxia de los cultivos.

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Este video describe el protocolo para el ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), que es una técnica clásica para demostrar las interacciones proteína-ADN. Esta técnica se utiliza para identificar genes diana en células de leucemia linfocítica crónica humana.

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina: una técnica para estudiar las interacciones proteína-ADN en células

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Aprende co-inmunoprecipitación de proteínas nucleares endógenas en células HEK293A bajo hipoxia. Este método permite estudiar interacciones entre factores de transcripción y correguladores en condiciones de bajo oxígeno.

Ensayo de co-inmunoprecipitación utilizando proteínas nucleares endógenas de las células cultivadas bajo condiciones hipóxicas

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