Ensayo de co-inmunoprecipitación utilizando proteínas nucleares endógenas de las células cultivadas bajo condiciones hipóxicas

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo hipóxico, como las interacciones endógenas y nativas entre los factores de transcripción y sus coreguladores transcripcionales en condiciones hipóxicas. La principal ventaja de esta técnica es que las células hipóxicas se recolectan en condiciones hipóxicas y las fracciones nucleares se utilizan para la coinmunoprecipitación. Este protocolo utiliza células embrionarias humanas de riñón 293A cultivadas en cuatro placas de 10 centímetros.

Siembre de tres a cinco veces 10 a la sexta celdas por placa en 10 mililitros del medio Eagle modificado de Dulbeco suplementado con 10% de FBS, L-glutamina, piruvato de sodio, penicilina y estreptomicina. Cultive las células en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados. Veinticuatro horas después de la siembra, cuando las células hayan alcanzado un 80 a 90% de confluencia, coloque dos placas en la subcámara de hipoxia en la guantera de la incubadora con 1% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante cuatro horas.

Mantenga los otros dos platos en normoxia. El día antes de recolectar las células tratadas con hipoxia, preequilibre DPBS a condiciones hipóxicas colocando un frasco de reactivo de vidrio para experimentos de 100 mililitros lleno de DPBS en la subcámara de hipoxia durante 24 horas. Aproximadamente una hora antes de recolectar las celdas, coloque una nevera que contenga hielo en la cámara de procesamiento de la guantera, que se haya equilibrado con 1% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono.

Transfiera el frasco que contiene el DPBS hipóxico preequilibrado de la subcámara de hipoxia a la cámara de procesamiento y colóquelo en hielo. Cuatro horas después del tratamiento con hipoxia, transfiera las células de la subcámara de hipoxia a la cámara de procesamiento que se ha preequilibrado a 1% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono. Retirar el medio de cultivo por aspiración y con una pipeta de 10 mililitros, enjuagar las células una vez con 10 mililitros de DPBS hipóxico preequilibrado helado.

Con una pipeta de cinco mililitros, agregue 5 mililitros de DPBS preequilibrado helado y desaloje las células raspándolas con un raspador de células. Incline la placa de cultivo celular, recoja las células desprendidas con una pipeta de 10 mililitros y transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros. Mantenga el tubo de células en hielo.

Abra la puerta entre las cámaras de procesamiento y de almacenamiento intermedio en la guantera, las cuales han sido preequilibradas a 1% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono. Transfiera los tubos cónicos de 15 mililitros en hielo que contienen células tratadas con hipoxia de la cámara de procesamiento a la cámara tampón. Abra la puerta de la cámara intermedia y retire las celdas por completo de la guantera.

Granular tanto las células hipóxicas como las células normóxicas por centrifugación a 1000 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Para este procedimiento se utilizará un kit de extracción nuclear. Comience resuspendiendo suavemente cada gránulo celular en 500 microlitros de tampón de lisis NL, complementado con un cóctel de inhibidores de la proteasa 1X en DTT de 0,1 molares pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.

Añadir 25 microlitros de solución detergente NP a la celda de suspensión y vórtice durante 10 segundos a máxima velocidad. Centrifugar a 1000 veces 10 g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Guarde tanto el sobrenadante como la bolita nuclear.

Después de recolectar y almacenar el sobrenadante como se describe en el protocolo de texto, vuelva a suspender los núcleos celulares que contienen gránulos en 500 microlitros de tampón de lisis NL, suplementado con un cóctel de inhibidores de la proteasa 1X y DTT 0,1 molar mediante vórtice durante cinco segundos a máxima velocidad. Vuelva a suspender el pellet nuclear en 50 microlitros de tampón de extracción NX1, complementado con un cóctel de inhibidores de la proteasa 1X pipeteando el pellet hacia arriba y hacia abajo varias veces. Incubar en hielo durante 30 minutos.

Cada cinco minutos, vórtice durante 10 segundos a velocidad máxima. Centrifugar a 12.000 x g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Recoja el sobrenadante y transfiéralo a mini dispositivos de diálisis con un volumen máximo de 100 microlitros por unidad para la desalinización.

Tape los mini dispositivos de diálisis y colóquelos en un dispositivo de flotación. Coloque el dispositivo de flotación en un vaso de precipitados que contenga 500 mililitros de tampón de diálisis preenfriado. Tenga cuidado de evitar el contacto directo con la piel o la inhalación del tampón de diálisis, ya que contiene PMSF.

Incubar a cuatro grados centígrados agitando suavemente durante 30 minutos. Después de 30 minutos, recoja las muestras de la esquina de los mini dispositivos de diálisis y transfiéralas a nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Centrifugar a 12 mil veces g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.

Alícuota 25 microlitros de cada sobrenadante en un tubo de centrífuga de 1,5 microlitros y almacene a menos 80 grados centígrados. Preparar las perlas de proteína AG sefarosa para ser utilizadas en la inmunopreciptación. Pipetee 50 microliteras de perlas en cada uno de los cuatro tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros y agregue 500 microlitros de tampón DPBS por tubo.

Granular las perlas por centrifugación. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las perlas en 100 microlitros de tampón TBS. Añadir dos microlitros de anticuerpo monoclonal anti-ARNT de ratón o inmunoglobulina G de ratón que se preparó reconstituyendo 0,7 miligramos de IgG de ratón en 500 microlitros de tampón TBS.

Lleve los tubos de microcentrífuga que contienen las perlas a una habitación fría. Colócalos en un tubo rotador e incuba a 10 rpm durante dos horas. Después de dos horas, granule las perlas por centrifugación y deseche los sobrenadantes.

Diluir 200 microgramos del lisado de proteína nuclear preparado anteriormente en 800 microlitros de tampón de inmunoprecipitación. Incubar el lisado con las perlas acopladas a anticuerpos a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, granule las perlas por centrifugación a 3000 veces g durante dos minutos a cuatro grados centígrados.

Deseche el sobrenadante. Agregue un mililitro de TBS helado que contenga 0.2% NP-40 a cada tubo y centrifuga. De esta manera, lave las perlas tres veces con TBS helado que contenga 0.2% de NP-40.

Hervir las perlas en 50 microlitros de tampón de muestra Laemmli a 95 grados centígrados durante cinco minutos. Centrifugar las cuentas a 10 mil veces g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Recoja el sobrenadante y deseche las cuentas.

Se examinaron los niveles de expresión en la localización subcelular de los componentes del complejo HIF-1 tras el tratamiento con hipoxia en células HEK293A. Como se esperaba, los niveles totales de HIF-1a fueron regulados al alza por hipoxia, mientras que los niveles de ARNT en los lisados celulares totales no se alteraron significativamente. Además, la hipoxia indujo la acumulación nuclear tanto de HIF-1a como de ARNT.

Los experimentos de coinmunoprecipitación se realizaron utilizando extractos nucleares de células HEK293A expuestas a condiciones normóxicas o hipóxicas. Como se muestra aquí, HIF-1a fue coinmunoprecipitado junto con ARNT de los extractos nucleares de células HEK293A hipóxicas, lo que indica que HIF-1a interactúa con ARNT en condiciones hipóxicas. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la hipoxia exploraran las interacciones endógenas de proteínas nucleares y sus condiciones hipóxicas.